转铁蛋白受体介导的Survivin对U251细胞生长的抑制作用

目的 构建Survivin短发夹状RNA(shBNA)序列的表达载体并观察其对神经胶质瘤细胞U251生长的抑制作用.方法 针对Survivin基因编码shRNA的序列,克隆到携带绿色荧光蛋白基因的载体,经酶切电泳和DNA测序鉴定.采用转铁蛋白.多聚乙烯亚胺(Tf-PEI)介导的转染方法 将重组的shRNA质粒转入U251细胞后,通过倒置荧光显微镜和流式细胞仪观察绿色荧光蛋白的表达,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot分别检测Survivin inRNA和蛋白表达;采用MTF法测定细胞增殖.结果 编码短发夹状的RNA序列被成功地插入到预期位点.转染Survivin shRNA1、shRNA2载体分别入U251细胞后,其bcl-2蛋白表达水平均显著降低,P＜0.05.U251细胞在48、72和96 h细胞生长明显受到抑制,分别与转染阴性shRNA组比较,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 构建的Survivin shRNA可特异性地抑制U251细胞生长.     

短发夹状RNA抑制缺氧诱导因子1α在前列腺癌细胞中的表达

目的:构建产生缺氧诱导因子1α(HIF-1α)特异性短发夹状RNA(shRNA)的载体并检测其抑制作用,探讨该技术在前列腺癌治疗中的应用前景。方法:设计、合成针对HIF-1α的特异性shRNA模板序列,将其插入含有U6启动子的psilencerTM2.1-U6载体中,得到shRNA表达载体psilencer-HIF,在脂质体介导下转染前列腺癌细胞株PC-3M,应用绿色荧光蛋白质粒pEGFP共转染评价转染效率,RT-PCR及Western印迹检测其对HIF-1α表达的影响。结果:重组质粒psilencer-HIF经测序分析证实与设计的完全一致,共转染24 h后质粒转染效率为(89.26±4.72)%,其产生的shRNA在PC-3M细胞中能诱导RNA干扰(RNAi),转染后48 h HIF-1αmRNA和蛋白水平分别下降82.09%和81.61%(P<0.01);而阴性对照组HIF-1α表达水平无明显改变(P>0.05)。结论:成功构建了HIF-1α基因shRNA表达质粒,其可有效抑制前列腺癌细胞中的HIF-1α的表达,为前列腺癌的基因治疗提供了新思路。     

联合转染Livin和Survivin shRNA表达载体对肝癌HepG2细胞生物学行为的影响

目的:分别构建Livin、Survivin基因短发夹RNA(shRNA)真核表达载体,探究联合转染Livin和Survivin真核表达载体对肝癌HepG2细胞生物学行为的影响。方法:分别设计并构建针对Livin、Sur-vivin基因shRNA真核表达载体pSD11-Livin和pSD11-Survivin,脂质体法单独或联合转染肝癌HepG2细胞,分空白对照组、质粒对照组、Survivin组、Livin组和共转染组。荧光定量PCR、Western blot分别检测Livin、Survivin mRNA及蛋白的相对表达量,MTT法检测细胞增殖的变化,TUNEL法检测细胞凋亡率。结果:针对Livin、Survivin基因的shRNA真核表达载体构建成功。共转染组Livin、SurvivinmRNA相对表达量分别为0.120±0.022、0.325±0.125,与单独转染组相比显著降低(P<0.05);共转染组Livin、Survivin蛋白相对表达量分别为0.412±0.099、0.473±0.051,与单独转染组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。共转染组转染后48、60、72 h细胞生长抑制率均显著高于单独转染组(P<0.05),转染后48 h细胞凋亡率明显上升(P<0.05)。结论:针对Livin、Survivin基因的shRNA真核表达载体构建成功。联合转染pSD11-Livin和pSD11-Survivin更有效地降低了Livin和Survivin基因在HepG2细胞中的表达,更显著地抑制了肝癌细胞的增殖,促进了肝癌细胞的凋亡。     

端粒酶催化亚单位基因反义寡核苷酸诱导前列腺癌细胞凋亡的研究

目的 探讨端粒酶催化亚单位(hTRT)基因反义寡核苷酸(ASODN)对前列腺癌细胞的诱导凋亡作用。方法合成针对hTRT的28mer ASODN,转染前列腺癌细胞12～36 h后,细胞计数、透射电镜、DNA Ladder、原位末端转移酶标记技术(TUNEL)检测癌细胞凋亡;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、聚合酶链反应-酶联免疫吸附试验(PCR-ELISA)技术检测hTRT基因表达和端粒酶活性。结果0.5～2.0μmol/L ASODN转染后,癌细胞体外生长抑制16.08％～53.41％(P<0.05),部分癌细胞呈现凋亡形态学改变和DNA片段化,凋亡率为9.36％～37.54％(P<0.05),hTRT表达减弱24.48％～86.73％(P<0.01),端粒酶活性降低24.74％～76.72％(P<0.01)。 结论运用ASODN阻断端粒酶hTRT基因表达,能降低端粒酶活性,显著诱导前列腺癌细胞凋亡。     

RNAi沉默DLL4基因诱导人乳腺癌细胞凋亡及对多西他赛的增敏作用

目的探讨短发夹RNA(shRNA)靶向沉默DLL4基因对MCF-7细胞凋亡的诱导及对化疗药物多西他赛的增敏作用。方法针对DLL4基因的序列设计具有特异性的shRNA,经脂质体转染MCF-7细胞,作为实验组,空脂质体转染的MCF-7细胞为脂质体组,未做任何处理的MCF-7细胞为对照组。采用免疫细胞化学方法检测3组细胞DLL4蛋白的表达情况;采用流式细胞仪检测3组细胞凋亡率及细胞周期改变;采用噻唑蓝(methyl-thiazoyl-tetrazolium bromide,MTT)法测定3组细胞的增殖情况及对多西他赛的敏感性。结果实验组平均光密度值及阳性面积率均低于对照组和脂质体组(P<0.01);实验组细胞在24 h、48 h及72 h时间点A值均低于对照组和脂质体组(P<0.01);转染后24 h、48 h、72 h及96 h,实验组细胞凋亡率高于对照组和脂质体组(P<0.05);RNA干扰(RNAi)沉默DLL4基因后,实验组G2/M期细胞比例高于对照组和脂质体组(P<0.05);实验组的IC50值较对照组和脂质体组低(P<0.05)。结论 RNAi技术抑制DLL4基因的表达能够抑制MCF-7细胞的增殖、诱导细胞凋亡及增强细胞对多西他赛作用的敏感性。DLL4可能会成为乳腺癌治疗的重要靶点。     

体外构建的小片段发夹RNA对肿瘤细胞端粒酶基因表达的干扰

目的:探讨针对端粒酶hTERT基因的小片段发夹RNA对人肿瘤细胞（HeLa）端粒酶基因的干扰及对肿瘤端粒酶的抑制作用。方法:体外合成制备shRNA，并用磷酸钙转染法转染HeLa细胞，分别用TRAP－银染法和PCR－EIA法检测端粒酶活性。结果:将制备的46个碱基的小片段发夹RNA转染HeLa细胞后端粒酶活性明显下降。结论:shRNA对肿瘤端粒酶hTERT基因表达有明显的干扰作用, 可望为临床开展对其他肿瘤端粒酶基因干扰抑制的实验研究奠定基础。     

短发夹RNA对大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞磷酸二酯酶5型基因表达的抑制作用

目的 观察短发夹RNA(shRNA)对大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞磷酸二酯酶5型(PDE5)基因表达的抑制作用,探讨运用RNA干扰(RNAi)技术治疗勃起功能障碍(ED)的可行性.方法 构建靶向大鼠PDE5基因的shRNA重组腺病毒rAd-rPDE5-shRNA,将其转染大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞48 h后,通过荧光标签进行显微计数确定转染效率,并以逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及Western blot检测PDE5基因的表达水平.结果 rAd-rPDE5-shRNA构建成功,转染大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞效率达95%以上,并使PDE5基因表达在mRNA水平抑制(80.78±2.30)%,在蛋白水平抑制(67.39±3.33)%.结论 以腺病毒为载体表达的shRNA能稳定、有效地抑制大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞PDE5基因的表达.     

端粒酶hTERT基因反义核酸对TNF-α诱导前列腺癌PC3细胞凋亡的影响

目的:探讨hTERT基因的两端部分硫代修饰反义寡核苷酸(AS PS-ODN)抑制前列腺癌细胞PC3端粒酶活性后,肿瘤坏死因子α(TNF-α)对PC3凋亡的增敏作用。方法:采用端粒重复序列扩增法及TRAP-PCR-ELISA法检测前列腺癌细胞的端粒酶活性;采用MTT比色试验观察hTERTAS PS-ODN与TNF-α共同作用对前列腺癌细胞PC3生长活力的影响;倒置显微镜观察凋亡细胞的形态变化;通过流式细胞仪测定凋亡细胞的百分率。结果:hTERTAS PS-ODN作用于PC3细胞48h,其端粒酶活性下降,作用72h,其端粒酶活性受到抑制,与正义寡核苷酸组及空白对照组相比差异有显著性(P<0.05)。hTERTAS PS-ODN作用于PC3细胞后加入TNF-α作用48h,PC3细胞的抑制率与对照组、S PS-ODN组、AS PS-ODN组、TNF-α组及S PS-ODN+TNF-α组相比有统计学差异(P<0.01)。hTERTAS PS-ODN作用于PC3细胞后加入TNF-α作用48h,细胞出现典型的凋亡形态变化。hTERT ASPS-ODN作用于PC3细胞后加入4μg/ml TNF-α作用48h,凋亡细胞的百分率分别与对照组、S PS-ODN组、AS PS-ODN组、TNF-α组及S PS-ODN+TNF-α组相比差异有显著性(P<0.05)。结论:hTERTAS PS-ODN能降低前列腺癌细胞PC3端粒酶活性;hTERT基因反义核酸对TNF-α诱导前列腺癌细胞PC3凋亡有增敏作用。     

RNAi沉默pyk2基因对鼠脑胶质瘤细胞增殖、侵袭能力的影响

目的 探讨pyk2小干扰RNA表达载体对小鼠脑胶质瘤G422细胞增殖、侵袭能力的影响.方法 用以pGenesil-1质粒为载体,以pyk2为靶基因,构建短发夹状小干扰RNA表达载体.用pyk2短发夹状小干扰RNA表达载体转染体外培养的人脑胶质瘤G422细胞,反转录聚合酶链反应和Western blot法检测pyk2基因和蛋白表达的改变,噻唑蓝(MTT)比色法检测转染后细胞的增殖情况,Transwell小室法测定转染细胞体外侵袭能力.结果 构建了pGenesil-1-pyk2重组质粒,并成功转染G422细胞.逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)显示pyk2 siRNA转染G422细胞后显著降低pyk2mRNA的表达,以48 h为著,下降近70%;Western blot证实转染后pyk2蛋白的表达下降近65%;G422细胞的活力降低为(67.1±5.2)%;Transwell小室测定转染细胞体外侵袭能力明显下降.结论 pGenesil-1-pyk2 siRNA重组质粒明显下调pyk2在胶质瘤细胞中的表达,并抑制肿瘤细胞增殖,抑制其侵袭能力.     

野生型p53基因对人胃癌细胞端粒酶逆转录酶mRNA转录的影响

目的 研究野生型p53基因对人胃癌细胞端粒酶逆转录酶(hTERT)mRNA转录及端粒酶活性的影响。方法 将含人野生型p53基因的pcDNA3—p53转染人胃癌细胞系BGG—823，通过半定量逆转录—聚合酶链反应(RT—PCR)检测转染后细胞hTERT基因mRNA的转录，聚合酶链式反应结合酶联免疫吸附(PCR ELISA)方法检测端粒酶活性。结果 转染野生型p53基因后48、72h BGC-823细胞的hTERT基因mRNA转录量由对照组的( )下降为( )和( )；转染前BGC—823细胞表达高水平的端粒酶活性(3．049)，而转染48、72h后的端粒酶活性分别为1．678和0．757。结论 野生型p53基因能够显著抑制人胃癌细胞hTERT基因mRNA的转录，通过下调hTERT、基因mRNA的转录来抑制胃癌细胞的端粒酶活性。     

RNA干扰双位点抑制Survivin基因诱导雄激素非依赖性前列腺癌PC-3细胞凋亡

目的研究采用RNA干扰技术抑制雄激素非依赖性前列腺癌PC-3细胞中Survivin 基因的表达对PC-3细胞增殖及凋亡的影响。方法设计2条靶向Survivin mRNA的Survivin shRNA,克隆至同一质粒载体,并鉴定分析;质粒转染PC-3细胞,绘制细胞生长曲线;并于转染48 h 后进行Survivin基因蛋白表达及细胞凋亡检测。结果酶切鉴定、测序分析证实负载双片段Sur- vivin shRNA的质粒载体构建成功。转染PC-3细胞后,细胞生长曲线示实验组PC-3细胞增殖明显受抑制;转染后48 h．实验组、阴性对照组、空白对照组Survivin蛋白表达强度分别为(4．62± O．84)％、(38．83±7．96)％和(40．98±3．83)％,实验组与两对照组相比差异均有显著性意义(P< 0．05);转染48 h后PC-3细胞凋亡率开始增加。结论负载双片段Survivin shRNA的质粒载体转染PC-3细胞后能明显抑制PC-3细胞增殖,抑制PC-3细胞Survivin蛋白表达,并能诱导PC-3细胞凋亡。但诱导PC-3细胞凋亡最明显的时机需要进一步观察。     

小肝癌与癌旁组织中端粒酶检测的意义

目的: 研究小肝癌与癌旁组织中端粒酶蛋白hTRT基因. 方法: 用原位杂交、免疫组化方法检测小肝癌中hTRT基因与PCNA的表达. 结果: hTRT阳性信号在癌中检出率为80%(16/20),呈异质性分布,并在细胞中有两种阳性形式:膜型和浆型.hTRT阳性信号强度、分布与癌细胞PCNA阳性强度呈密切相关(P<0.01).癌旁肝硬变和肝炎肝硬变中出现弱阳性信号,其检出率分别为14.7%(1/7)和25%(1/4),癌中hTRT阳性信号显著高于癌旁非癌组织(P<0.01).癌旁不典型腺瘤样增生病灶中,hTRT阳性信号的检出率为66.67%(2/3),接近于癌中;在癌中坏死组织和癌旁相对正常的肝组织中未检出hTRT阳性信号.癌中hTRT阳性信号强度与癌分化、与是否同时伴有肝病情况无关. 结论: 小肝癌中hTRT阳性信号特异性增强,与肝细胞增殖有关,端粒酶活化是肝癌发生的早期事件,检测端粒酶蛋白hTRT基因有望成为肝癌早期诊断的指标之一.     

靶向沉默核干因子对前列腺癌PC-3细胞增殖能力的影响

目的:检测前列腺癌PC-3、LNCaP及DU145细胞中核干因子(Nucleostemin,NS)基因的表达,研究NS基因沉默后对PC-3细胞增殖能力的影响。方法:采用免疫细胞化学法及逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)分别检测NS蛋白及mRNA在3种前列腺癌细胞中的表达。用NS特异性小发夹RNA表达质粒转染PC-3细胞,分别用RT-PCR及Western印迹方法检测转染后细胞(简称NS-shRNA-PC-3)中NSmRNA及蛋白的变化。比较NS基因沉默前后PC-3细胞体外、裸鼠体内增殖能力及凋亡情况的变化。结果:3种细胞中均显示NS基因高表达。转染后NS-shRNA-PC-3细胞中NS表达显著降低,细胞增殖速度减慢,G0/G1期细胞百分率显著升高,早期凋亡细胞增多。体内致瘤实验显示,NS基因沉默后,PC-3细胞在裸鼠体内增殖能力显著降低。结论:NS在前列腺癌细胞系中呈高表达,RNA干扰沉默NS基因后PC-3细胞增殖能力显著降低,凋亡细胞增多。     

靶向CXCR1基因的shRNA真核表达质粒的构建及鉴定

目的：构建靶向化学趋化因子受体1（CXCR1）的短发夹小干扰RNA（shRNA）质粒表达载体。方法：针对人CXCR1基因的mRNA序列,按RNA干扰靶位点的设计原则,设计并构建靶向CXCR1基因的3个shRNA质粒表达载体和1个阴性对照质粒表达载体,经酶切和测序确认构建成功后,转染胃癌细胞MKN45,RT-PCR和Western blot检测CXCR1 mRNA和蛋白的表达。结果：经酶切和测序证实,3个靶向CXCR1基因的shRNA真核表达质粒均构建成功;与未转染和转染阴性对照质粒的MKN45细胞比较,转染3种shRNA质粒的MKN45细胞,CXCR1 mRNA和蛋白水平均明显下调（均P<0.05）。结论：靶向CXCR1基因的shRNA真核表达质粒的成功构建,为进一步研究CXCR1在胃癌中的功能和实验性靶向治疗提供了初步的基础。

     

短发卡RNA对人胃癌细胞STAT3基因的沉默作用

目的:探讨STAT3基因小发夹RNA（shRNA）表达质粒对胃癌MKN-45细胞STAT3基因的干扰作用。方法:根据STAT3 mRNA 编码序列，设计RNA干扰靶点，构建STAT3基因的特异性小RNA干扰质粒（psiRNA-H1/STAT3），使用脂质体转染人胃癌细胞系（MKN-45细胞）。实验分为对照（A）组，psiRNA-H1转染（B）组和psiRNA-H1/STAT3转染（C）组。通过RT-PCR和Western Blot检测STAT3特异性小RNA干扰基因对胃癌细胞STAT3基因mRNA和蛋白表达的影响。结果:psiRNA-H1/STAT3经限制性酶切及部分序列分析证明基因插入正确，并经测序证实。将其成功转染MKN-45细胞后，该细胞的STAT3 mRNA和蛋白表达均明显下降(P<0.05)。 结论:将成功构建的针对STAT3基因的shRNA表达载体转染MKN-45细胞，能有效抑制该细胞的STAT3 mRNA和蛋白表达，为STAT3基因靶向治疗提供一定的实验依据。     

RNAi对前列腺癌细胞水通道蛋白-1的影响

目的探讨RNA干扰技术沉默AQP1基因对前列腺癌PC-3细胞AQP1蛋白表达影响。方法设计合成针对前列腺癌PC-3细胞AQP1基因的小干扰RNA并构建高效表达载体,脂质体法转染PC-3细胞,Western Blot检测AQP1蛋白表达的变化。结果 AQP1在前列腺癌PC-3细胞表达,针对AQP1基因siRNA高效表达载体能够抑制AQP1蛋白在PC-3细胞的表达,AQP1蛋白相对表达量为：转染组0.54±0.04,正常对照组0.82±0.08,差异有显著性（P〈0.01）。结论通过抑制AQP1基因的表达,有效抑制了前列腺癌PC-3细胞AQP1蛋白表达。     

前列腺癌组织中端粒酶hTRT基因表达及意义

目的 探讨前列腺癌组织中端粒酶hTRT基因的表达及意义。方法 应用原位分子杂交技术,对47例前列腺癌（PCa)、21例良性前列腺增生（BPH）和10例正常前列醇（NP）组织中微粒酶hTRT基因进行检测和定位,并运用图像分析系统对hTRT表达水平与PCa分化程度的相关性进行研究。结果 端粒酶hTRT基因在PCa中表达阳性率为93．6％,表达强度与肿瘤细胞的分化程度显著相关：未分化腺癌＞低分化腺癌＞中分化腺癌＞高分化腺癌;癌旁组织中hTRT基因表达率为8．5％,在肿瘤组织和癌旁组强中差别有极显著性意义（P＜0．01）。端粒酶hTRT基因表达水平与肿瘤细胞的分布定位一致,NP组织及BPH组织中端粒酶hTRT基因表达均为阴性。结论 原位杂交检测端粒酶hTRT基因对PCa细胞水平的定位诊断具有重要意义,端粒酶hTRT有可能成为PCa诊断有新标志物及治疗新靶点。     

Survivin对PC-3细胞微小RNA表达的影响

目的 检测Survivin抑制后PC-3细胞微小RNA( miRNAs)表达谱的变化,探讨Survivin与相关miRNAs之间的关系.方法 利用负载Survivin短发夹RNA (shRNA)重组腺病毒( pGSadeno-sur shRNA),体外转染PC-3细胞,96 h后,收集细胞提取RNA,检测miRNA表达谱的变化.结果 共有650个miRNAs表达信号在雄激素非依赖前列腺癌PC-3细胞中可以被检测到,有9个miRNAs的表达信号水平高于1000,其中的6个miRNAs表达谱同实验组比较差异有统计学意义(P＜0.01).实验组与空白对照组比较有75个miRNAs表达差异有统计学意义(P＜0.01),其中42个表达上调、33个表达下调;阴性对照组与实验组比较有27个miRNAs表达差异有统计学意义(P＜0.01),其中22个表达上调、5个表达下调;实验组与空白对照组及阴性对照组比较均表达上调的miRNAs有15个,表达下调的miRNA有1个.结论 抑制PC-3细胞中Survivin的表达对miRNAs 表达谱有明显影响,为明确相关miRNAs在PC-3细胞中的作用提供新线索.