RNA干扰骨髓基质细胞和/或骨髓瘤细胞APE1表达对共培养骨髓瘤细胞增殖及凋亡的影响

目的 探讨RNA干扰骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)及骨髓瘤细胞株U266 APE1表达对共培养的U266细胞增殖、凋亡的影响.方法 将构建的APE1 siRNA表达载体分别导入BMSCs及U266细胞中.Western blot法检测2种细胞中APE1蛋白表达;2株细胞经APE1 siRNA处理后采用Transwell插入式培养皿构建BMSCs与骨髓瘤细胞共培养模型,采用MTT法、Annexin V-PE/7-AAD双染法、RT-PCR分别检测U266细胞增殖、凋亡及细胞中IL-6/IL-8 mRNA表达水平.结果 APE1 siRNA 可明显降低BMSCs及U266细胞APE1蛋白表达,与对照组相比差异具有统计学意义(P＜0.01);在APE1 siRNA同时处理BMSCs和U266细胞后的共培养体系中,U266细胞增殖抑制及细胞凋亡明显高于单一细胞APE1敲低组及APE1 siRNA末处理组(P＜0.01);U266细胞中IL-6及IL-8 mRNA表达水平亦降低(P＜0.01).结论 抑制APE1在BMSCs和/或骨髓瘤细胞株U266的表达,可明显抑制共培养体系中U266细胞的增殖活性并促进其凋亡.     

APE1在PDT治疗非小细胞肺癌中的表达变化及疗效的关系

目的 探讨光动力疗法(PDT)治疗非小细胞肺癌对脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶(APE1)表达的影响及疗效的关系.方法 以Western blot分析PDT处理调控作用影响A549细胞APE1表达变化的时效关系,构建Ad5/F35-APE1 siRNA腺病毒干扰载体,通过Western blot检测其对APE1蛋白的敲低作用,设空白对照组、Ad5/F35-APE1 siRNA感染组、PDT组和Ad5/F35-APE1 siRNA+PDT组,采用MTT法观察不同组对A549细胞的增殖抑制作用.结果 PDT诱导A549细胞APE1蛋白表达增强在24h达到高峰,10MOI Ad5/F35-APE1 siRNA重组腺病毒感染A549细胞48h抑制APE1表达最为显著,MTT检测显示随光照剂量的增加增殖抑制作用显著增强,同时Ad5/F35-APE1 siRNA+PDT组对A549细胞具有明显的增殖抑制作用.结论 Ad5/F35-APE1 siRNA重组腺病毒能有效抑制PDT诱导的肺癌细胞APE1表达增加,明显增强PDT对肺癌细胞的杀伤效应.     

血红素加氧酶-1对食管癌细胞株Eca109增殖及凋亡作用的影响

目的 研究血红素加氧酶-1(heme oxygenase,HO-1)对食管癌细胞株Eca109增殖活性及凋亡作用的影响.方法 利用体外设计合成的靶向抑制HO-1的低分子RNA(siRNA)沉默食管鳞癌Eca109细胞HO-1基因的表达,应用RT-PCR、Western blot检测HO-1 mRNA和蛋白表达水平,分别以MTS法、流式细胞术检测干扰HO-1后食管鳞癌Eca109细胞增殖和凋亡水平.结果 RT-PCR、Western blot检测结果显示转染HO-1 siRNA可以成功抑制食管鳞癌Eca109细胞HO-1的表达;与空白组、阴性对照组比较,HO-1 siRNA干扰组Eca109细胞增殖能力明显减弱,细胞凋亡率显著增加.结论 HO-1siRNA可有效沉默食管癌细胞HO-1的表达,抑制细胞的增殖活性,促进细胞的凋亡.     

多发性骨髓瘤特异的APE1siRNA在KM3细胞中的转染与表达

目的观察APE1siRNA在KM3细胞内表达情况.方法将构建的MM特异APE1siRNA表达质粒pSilecer K-IE-IgP APE1siRNA与eGFP以脂质体共转染KM3细胞,经G418筛选获得稳定转染的细胞克隆,通过Western blot分析验证APE1siRNA在KM3细胞中的表达.结果 MM特异APE1siRNA表达质粒与eGFP共转染,转染效率约为38%～48%,且APE1siRNA转染细胞较对照组能有效敲除APE1基因表达.结论 APE1siRNA在KM3细胞中获得正确表达.     

SiRNA干扰DLL4表达对A549细胞周期和凋亡的影响

目的 筛选DLL4基因的特异性小干扰RNA(small interference RNA,siRNA),探讨DLL4对A549 细胞增殖、周期、凋亡的影响.方法 设计、合成并筛选针对DLL4的siRNA,转染A549细胞后,以RT-PCR和Western blot检测DLL4 mRNA和蛋白的表达,MTT法检测细胞增殖,激光扫描共聚焦显微镜检测细胞凋亡变化,流式细胞仪检测细胞周期改变.结果 DLL4 siRNA能够明显下调A549细胞中DLL4 mRNA和蛋白的表达.并能抑制细胞的增殖(抑制率为43.85％);促进细胞凋亡(P＜0.05),G2/M期细胞比例明显增加(P＜0.05).结论 DLL4在肺癌细胞中也有表达,下调其表达后,能够抑制肿瘤细胞增殖、促进其凋亡.     

组蛋白去乙酰化酶1 siRNA对HeLa细胞生长和凋亡的影响

目的 研究组蛋白去乙酰化酶1(histone deacetylases-1,HDAC-1)siRNA对宫颈癌HeLa细胞HDAC-1蛋白表达、细胞生长和凋亡的影响.方法 HDAC-1 siRNA沉默HDAC-1蛋白;Western blot技术检测HDAC-1蛋白;MTT法和克隆形成实验检测细胞生长抑制情况;流式细胞仪检测细胞凋亡.结果 HDAC-1 siRNA转染48 h可明显下调HeLa细胞HDAC-1蛋白表达;下调HDAC-1 表达明显降低HeLa细胞克隆形成率,抑制细胞增殖;下调HDAC-1诱导HeLa细胞凋亡.结论 HDAC-1 siRNA可能通过诱导凋亡抑制HeLa细胞生长.     

小干扰RNA抑制c-Myc表达对MCF-7细胞增殖和凋亡的影响

目的应用小干扰RNA（siRNA）干扰乳腺癌MCF-7细胞的c-Myc表达，了解c-Myc对肿瘤细胞增殖和凋亡的作用。方法将c-Mye siRNA，经IApofectamineTM2000脂质体转染MCF-7细胞后，实时定量RT-PCR和Western Blotting法检测细胞cMyc mRNA和蛋白的表达，MTT法和流式细胞仪检测干扰后细胞的增殖和凋亡水平。结果转染后MCF-7细胞的c-Myc的mRNA与蛋白表达明显减弱，增殖能力显著降低。洲亡率明显提高。结论运用RNAi技术，可以有效地干扰MCF-7细胞c—Myc的表达，抑制细胞增殖，并诱导细胞渊亡。     

RNA干扰TMEM33的表达对宫颈癌细胞生长的影响

目的 通过生物信息学方法探究跨膜蛋白33(transmembrane protein 33,TMEM33)在宫颈癌组织中的表达及其与预后的关系,观察TMEM33经RNA干扰后对宫颈癌细胞生长的影响。方法 应用基因表达谱数据动态分析（Gene Expression Profiling Interactive Analysis,GEPIA）数据库筛选出与宫颈癌相关的TMEM33基因,设计两条特异siRNA序列进行RNA干扰实验。实验分为3组：siTMEM33#1干扰组、siTMEM33#2干扰组、阴性对照组（非特异性siRNA）。采用Western blot法检测siRNA干扰后宫颈癌SiHa/HeLa细胞中TMEM33蛋白的表达,CCK-8法检测SiHa/HeLa细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期的变化,Western blot法检测细胞凋亡关键基因BCL-2、Bax及细胞周期蛋白CyclinD1、P21的表达变化。结果 与阴性对照组相比,特异性siRNA显著下调宫颈癌SiHa/HeLa细胞中TMEM33蛋白的表达（P<0.05）;宫颈癌细胞增殖明显受抑,细胞凋亡显著增加,...     

RNA干扰TMEM33的表达对宫颈癌细胞生长的影响

目的 通过生物信息学方法探究跨膜蛋白33(transmembrane protein 33,TMEM33)在宫颈癌组织中的表达及其与预后的关系,观察TMEM33经RNA干扰后对宫颈癌细胞生长的影响。方法 应用基因表达谱数据动态分析（Gene Expression Profiling Interactive Analysis,GEPIA）数据库筛选出与宫颈癌相关的TMEM33基因,设计两条特异siRNA序列进行RNA干扰实验。实验分为3组：siTMEM33#1干扰组、siTMEM33#2干扰组、阴性对照组（非特异性siRNA）。采用Western blot法检测siRNA干扰后宫颈癌SiHa/HeLa细胞中TMEM33蛋白的表达,CCK-8法检测SiHa/HeLa细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期的变化,Western blot法检测细胞凋亡关键基因BCL-2、Bax及细胞周期蛋白CyclinD1、P21的表达变化。结果 与阴性对照组相比,特异性siRNA显著下调宫颈癌SiHa/HeLa细胞中TMEM33蛋白的表达（P<0.05）;宫颈癌细胞增殖明显受抑,细胞凋亡显著增加,...     

沉默APE1对非小细胞肺癌细胞的放射敏感性的影响研究

目的 研究脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶-1（APE1）对非小细胞肺癌细胞放射敏感性的影响。方法 采用免疫组化染色检测手术标本切片（非小细胞肺癌组织20例及癌旁组织5例）中APE1的表达,Western blot与实时荧光定量（qRT）-PCR检测非小细胞肺癌细胞系（A549,H460,H1299）及肺正常上皮细胞系中APE1的表达;Western blot检测辐照A549与H460细胞0~6 Gy后APE1的表达;构建沉默APE1的A549与H460稳定细胞株后,Western blot检测其辐照6 Gy后APE1的蛋白表达;细胞克隆形成实验检测细胞克隆形成率;CCK-8检测细胞增殖;细胞术流式检测细胞凋亡。结果 非小细胞肺癌组织及细胞系中APE1的表达明显上调;辐照能诱导非小细胞肺癌细胞APE1的表达,且表达随辐照剂量增高而上调;沉默APE1能有效地抑制辐照诱导A549与H460细胞中APE1的表达;成功构建沉默APE1的A459、H460稳定细胞株;沉默APE1联合辐照进一步抑制了非小细胞肺癌细胞克隆形成率、细胞增殖率,同时促进细胞凋亡（ PAPE1可增强非小细胞肺癌细胞的放射敏感性。     

Effect of Antisense RNA Targeting Polo-like Kinase 1 on Cell Growth in A549 Lung Cancer Cells

In order to investigate the effect of Polo-like kinase-1 （Plk1） depletion on cell cycle progression and cell growth in lung cancer cells, a recombinant plasmid containing antisense RNA targeting Plk1 （pcDNA3-Plk1） was transfected into A549 cells by lipofectine. RT-PCR and Western-blot were used to detect the Plk1 gene expression. Cell proliferation was evaluated by direct cell counting and bromodeoxyuridine （BrdU） labeling. Cell cycle distribution and apoptosis were examined by flow cytometry, and the inhibition rate （IR） by vinorebline （NVB） was determined by MTF assay. The results showed that after transfection of pcDNA3-Plk1 into A549 cells, the expression levels of Plk1 mRNA and protein were greatly decreased. In pcDNA3-Plk1 transfected groups, abnormal morphological changes of cells and growth inhibition were observed, and the BrdU labeling index was significantly lower than in the control groups （P〈0.05）. Cells in pcDNA3-Plk1 transfected groups were arresed in G2/M phase and apoptosis was detectable 72 h post transfection. IR induced by vinorebline in pcDNA3-Plk1 transfected groups was significantly higher than in other groups. These data suggested that antisense RNA targeting Plk1 could suppress the Plk1 expression, and therefore, significantly inhibit cell proliferation and induce cell cycle arrest and apoptosis. Moreover, it sensitized lung cancer cells to chemotherapy.     

Kif15调控大鼠星形胶质细胞增殖、细胞周期及凋亡的研究

目的:探讨Kif15调控星形胶质细胞增殖、细胞周期及凋亡的影响及机制。方法:从出生1 d的大鼠分离出星形胶质细胞,分别用NC-小干扰RANA（siRNA）（NC-siRNA组）、Kif15-siRNA转染细胞（Kif15-siRNA组）,不做任何处理的细胞作为空白对照组（Control组）,48 h后收集细胞,Western blotting检测各组细胞中Kif15的蛋白表达,CCK-8法检测细胞增殖;流式细胞仪检测细胞周期及细胞凋亡率;Western blotting检测增殖细胞核抗原（PCNA）、细胞周期素D₁（cyclinD1）、Cleaved caspase3、p38、p-p38蛋白表达情况。结果:转染Kif15-siRNA能显著抑制Kif15的蛋白表达;与对照组及NC-siRNA组比较,Kif15-siRNA组细胞存活率、G₂/M期细胞及PCNA、cyclinD1、p-p38蛋白表达显著降低,细胞凋亡率、G₁期细胞及Cleaved caspase3蛋白表达显著升高（P<0.01）,p38蛋白表达在各组细胞间差异无统计学意义（P>0.05）。结论:抑制星形胶质细胞中Kif15的表达,可显著降低细胞的增殖,阻滞细胞于G₁期,促进细胞凋亡,其机制与抑制p38信号通路有关。     

外源性antizyme 1基因转染对SH-SY5Y细胞的生物学影响

目的 研究antizyme 1(AZl)基因对成人神经廇SH-SY5Y细胞增殖、细胞周期及凋亡的影响.方法 将构建好的AZ1基因重组真核表达载体pAZ1m稳定转染SH-SY5Y细胞.通过MTT法检测细胞增殖变化,流式细胞术分析AZ1转染对细胞周期及凋亡的影响.RT-PCR与Western blotting检测AZ1基因转染对cyclin D1和caspase-3表达的影响,caspase-3试剂盒检测酶活性变化.结果 稳定转染SH-SY5Y细胞后,检测结果显示AZ1基因转染能够减慢SH-SY5Y细胞增殖速度,并使细胞停滞于G0/G1期.在cyclin D1基因表达抑制的同时,caspase-3基因表达上调.酶活性测定显示Caspase-3活性上升.结论 AZ1基因能够抑制SH-SY5Y细胞增殖,通过降低cyclin D1的表达阻滞细胞周期于G0/G1期,并上调caspase-3表达促进SH-SY5Y细胞凋亡.     

TSA可能通过抑制APE1 BER功能增强顺铂的肺腺癌细胞毒性

目的 探讨曲古抑菌素A(trichostatin A,TSA)对顺铂诱导的细胞毒性的影响.方法 给予0、250、500 nmol/L TSA预处理A549细胞24 h后,分别联合0、5、10、15 μmol/L顺铂处理A549细胞24 h后,通过0、0.5、1、2μmol/L APE1 InhibitorⅢ调控APE1 BER功能,应用CCK-8方法检测细胞增殖率,AP内切酶活性实验检测APE1 BER功能,通过流式细胞仪检测细胞凋亡水平,immunoblot检测γ-H2AX表达水平.结果 TSA联合顺铂处理A549细胞明显增强顺铂的细胞增殖抑制,并促进顺铂诱导的细胞凋亡;随着TSA浓度的升高APE1内切酶活性逐渐减弱,TSA联合顺铂促进顺铂诱导的γ-H2AX表达;利用inhibitorⅢ抑制APE1内切酶活性,促进顺铂诱导细胞增殖抑制和凋亡水平.结论 TSA可能通过抑制APE1 BER功能增强顺铂诱导的细胞毒性反应.     

靶向抑制survivin对胰腺癌细胞增殖和凋亡效应的影响

目的 探讨反义survivin—脂质体复合物对胰腺癌细胞增殖和凋亡效应的影响及机制,为胰腺癌及survivin阳性肿瘤的治疗提供理论依据。方法 用脂质体介导survivin反义寡核苷酸转染胰腺癌细胞系PANC—1细胞;通过RT—PCR、Western印迹试验检测survivin表达水平;MTY法测量细胞生长情况;流式细胞术测定caspase—3活性及凋亡率;电镜观察细胞形态学变化;应用激光共聚焦显微镜免疫荧光分析法评价脂质体反义复合物在亚细胞水平对survivin蛋白分子的影响。结果 反义survivin脂质体复合物有效下调survivin表达水平,并呈剂量依赖关系,IC50值为300nmoL／L,最大效应浓度为500nmoL／L,此时表达水平下调了80％。类似细胞生长抑制结果为MTY实验所证实。与此同时,caspase—3活性和凋亡率随转染时间延长而逐渐递增,并出现凋亡形态学变化,如胞浆空泡变性、核浓缩和核碎裂。免疫荧光分析,标记有FITC—绿荧光染色的survivin蛋白分子在未转染的细胞浆中清晰可见,并呈“斑点”状分布;而在转染细胞中几乎没有发现,但是符合细胞凋亡的形态学特征。结论 靶向抑制联系细胞增殖和凋亡的关键分子—survivin在胰腺癌治疗中有良好的应用前景。     

IEX-1蛋白在胃癌中的表达及其意义

目的揭示即刻早期反应X-1（IEX-1）蛋白在胃癌组织及细胞系中的表达,探讨其对人胃癌细胞凋亡和增殖的影响。方法采用免疫组织化学法检测100 例胃镜活检标本中IEX-1 蛋白的表达,用实时荧光定量聚合酶链反应和Western blot 检测人正常胃黏膜细胞GES-1 和胃癌细胞MKN28 中-1 基因和蛋白的表达,同时转染IEX-1 的过表达质粒pcDNA3-FLAG-IEX-1 和干扰质粒pLL3.7-si-IEX-1,分别采用流式细胞术及四甲基偶氮唑盐比色法检测IEX-1 对细胞周期、凋亡及增殖的影响。结果胃癌组织中IEX-1 蛋白表达水平高于正常胃组织和慢性胃炎组织（p <0.05）,且随着病情进展,IEX-1 表达水平有逐渐升高的趋势。相对于人正常胃黏膜细胞GES-1,胃癌细胞MKN28 中-1 基因和蛋白表达更高（p <0.05）。与对照组相比,IEX-1 蛋白表达增高后S 期细胞比例升高,G2期细胞比例降低,细胞增殖率升高,凋亡减少（p <0.05）,而干扰IEX-1 蛋白表达后,G1期细胞升高,G2期细胞比例下降,细胞增殖率下降,细胞凋亡增加（p <0.05）。结论IEX-1 蛋白在胃癌组织中呈高表达,在人胃癌细胞中上调IEX-1 蛋白能促进细胞增殖,发挥抗凋亡能力,干扰IEX-1 蛋白表达能阻滞细胞周期进程,并诱导凋亡。     

转染Stat3β cDNA对人乳腺癌细胞的作用

目的 研究转染Stat3β cDNA阻断人乳腺癌细胞系SK-BR-3细胞的Stat3信号传导通路对人乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响。方法 应用阳离子脂质体介导的瞬时转染技术将携带Stat3β cDNA的质粒转入人乳腺癌细胞系SK-BR-3细胞中,流式细胞分选术将转染阳性细胞分离后,用四唑盐(MTT)比色试验检测细胞增殖能力,蛋白质印迹法(Western blot)检测STAT3通路蛋白表达,流式细胞术(flow cytometry)检测细胞周期和凋亡。结果 转染48h后13、79％SK-BR-3细胞被导入携带Stat3β cDNA的质粒pIRES-Stat3β;转染Stat3β cDNA后p-STAT3表达水平下降,细胞增殖能力受到抑制,出现G0／G1期的阻滞、S期比例下降,以及细胞凋亡增加。结论 转染携带Stat3β cDNA的质粒pIRES-Star3β可以阻断SK-BR-3细胞中Stat3通路,抑制人乳腺癌细胞的增殖,促进其凋亡,可能为乳腺癌的基因治疗提供新的靶点。