甘肃省鼠疫耶尔森菌多位点可变数目串联重复序列基因分型及地区分布

目的 采用多位点可变数目串联重复序列(MLVA)对甘肃省鼠疫耶尔森菌(鼠疫菌)进行基因分型,探讨甘肃省鼠疫菌地区分布特征。方法 选取1962-2014年间甘肃省各市县(区)不同生态型的鼠疫菌198株,培养并提取基因组DNA。采用14+12对引物进行PCR扩增,产物进行测序,确定每对引物串联重复序列(VNTR)位点的拷贝数。应用BioNumerics 5.10软件对菌株的VNTR位点拷贝数进行聚类分析。结果 甘肃省鼠疫菌分为10个群,群内的菌株依据分离地点继续细化为5-28个分支。10个群分别为:阿拉善黄鼠疫源地菌株聚为1个群;甘南高原疫源地菌株聚成1个群;阿克塞县菌株分成2个群,为当金山群和加尔乌宗村群;肃北县菌株分为3个群,为马场群、党城湾镇群和鱼儿红群;玉门市菌株聚集在肃北县鱼儿红群内;肃南县菌株分为3个群,为大河乡群、马蹄乡群和康乐乡群。结论 MLVA可以清晰地区分甘肃省不同鼠疫疫源地的菌株,将疫源地内菌株继续细分为不同分支,直至精确的分离地点。MLVA分型方法可用于鼠疫菌株的溯源分析。     

云南省剑川县鼠疫疫源地分离菌株基因组多态性

目的 阐明云南剑川野鼠疫源地鼠疫菌种群的演化及其与云南省其他疫源地菌株之间的遗传进化关系。方法 按不同时间、不同疫点、不同分离源,随机选取24株剑川分离鼠疫菌进行研究;采用差异区段(DFR)、规律成簇的间隔短回文重复序列(CRISPRs)及多位点可变数目串联重复序列分析(MLVA)进行基因组多态性分析;以DFR+CRISPRs聚类分析划分簇,再以MLVA26对簇进行聚类分析。结果 24株剑川菌株中,20株菌聚为一个簇(剑川野鼠鼠疫簇);2017年疫情分离3株菌位于丽江野鼠鼠疫簇,与丽江菌株(2017LZ)存在2个位点的差异(N2577,M23);剩余1株为一个独立株;50年代菌株与其邻近的80年代菌株间位点差异未超过3。结论 剑川原野鼠疫源地的发现时间可往前推至上世纪50年代,同时疫情还波及过家鼠和人群;剑川县境内存在2种类型的野鼠疫源地,其鼠疫防控具有复杂性,应继续加强鼠间鼠疫的动态监测。     

四川省鼠疫耶尔森菌CRISPR基因分型及地区分布研究

目的 对四川省鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)做规律成簇的间隔短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats CRSIPR)基因分型和地区分布研究,为四川鼠疫防治提供科学依据。方法 对132株鼠疫菌培养和提取核酸,应用3对CRISPR引物对被试菌株DNA进行PCR扩增、测序和分析,确定四川省鼠疫菌的CRSIPR基因型。结果 132株鼠疫菌共发现17种spacer,包括YPa 9种、YPb 5种、YPc 3种,新发现的1种space阵列。所有鼠疫菌株被分为2个CRISPR基因簇(Cc3',Ca7),3个基因型(37'型、22型和sc01型)。其中石渠县青海田鼠型菌株基因型为37'型,石渠县人间鼠疫的菌株为22型,德格县旱獭型菌株基因型为22型,巴塘县、理塘县、雅江县和新龙县旱獭菌株基因型为sc01型。结论 四川省鼠疫菌菌株具有明显的地区分布特征。     

齐氏姬鼠-大绒鼠鼠疫疫源地内鼠疫主要宿主动物和指示动物携带非鼠疫耶尔森菌的调查研究

目的 探讨齐氏姬鼠-大绒鼠鼠疫疫源地内鼠疫的主要宿主动物(鼠类)和指示动物(家犬)携带小肠结肠炎耶尔森菌的情况,掌握小肠结肠炎耶尔森菌在鼠疫自然疫源地内的生态学分布特征方法 采集的啮齿动物和犬类标本分离小肠结肠炎耶尔森菌,并进行血清分型、生物分型及毒力基因检测结果 从62份啮齿动物标本检出43株小肠结肠炎耶尔森菌,携带率35.5％;从171份犬类标本检出96株小肠结肠炎耶尔森菌,携带率26.3％;138株小肠结肠炎耶尔森菌为生物1A型;1株小肠结肠炎耶尔森菌为生物3型、血清O∶3型结论 啮齿动物较犬类小肠结肠炎耶尔森菌的携带率高。非致病性小肠结肠炎耶尔森菌菌株为优势菌型。在鼠疫疫源地内研究小肠结肠炎耶尔森菌的分布及生物学特征对该病的预防控制具有重要意义,也有助于探讨致病性耶尔森菌在自然界长期保存、变化的机理以及相互关系。     

一起人间布鲁氏菌病聚集性疫情的病原学确诊及基因分型研究

目的 调查分析陕西省咸阳市三原县发生的一起人间布鲁氏菌病聚集性疫情的流行病学特征,分离鉴定病原菌并进行基因分型研究,为控制人间布鲁氏菌病提供支持。方法 对患者进行流行病学调查,采集患者血液进行血清学检测及病原学培养,采用多位点序列分析(MLST)和多位点可变数目串联重复序列分析(MLVA)进行基因分型。结果 本起疫情传染源为流产羊只,传播途径为经皮肤黏膜和呼吸道感染,2人感染发病。本次疫情分离得到2株羊种1型布鲁氏菌。MLST分型为ST8。MLVA分型为新型,该基因型在陕西省内首次发现。结论 散养户是布鲁氏菌病高危人群;首次在陕西省内报道布鲁氏菌新的MLVA基因型,丰富了陕西省布鲁氏菌的基因库,为更好的防控陕西省人间布鲁氏菌病提供了依据。     

陕西省鼠疫耶尔森菌间区规律短回文重复序列基因分型研究及流行病学分析北大核心CSCD

目的通过CRISPR(间区规律短回文重复序列)对陕西省鼠疫菌进行基因分型,分析流行病学特征,为陕西省鼠疫防治工作提供科学依据。方法提取分离自陕西省鼠疫疫源地的66株鼠疫菌核酸,利用针对鼠疫菌的3对CRISPR引物进行PCR扩增,对扩增产物进行测序及分析,确定CRISPR基因分型。结果 66株鼠疫菌在3个位点上共有12种spacer,其中YPa 3种、YPb 5种、YPc 4种,具体为al′、a2′、a3′、b1′、b2′、b29′、b1″、b2″、c1、c2、c3、c3′,基因簇为Cb2′,基因型分为1′和4′两种。结论疫情发生年份不同,鼠疫菌CRISPR基因型不同,鼠疫疫情处置进行溯源应将生态分型与基因分型结合。     

MLVA分型在布鲁氏菌临床分离株中的应用探索

目的 探讨MLVA分型对于鉴别布鲁氏菌病复发与重复感染的意义。方法 对初次发病与二次发病的布病患者进行血培养,分离菌株,对分离菌株做布鲁氏菌种属鉴定与MLVA-16分型鉴定,分析两次发病分离到的菌株的分型结果及各位点的差异。结果 收集到4例二次发病的布病患者的血培养物,分离得到8株布鲁氏菌,经MLVA-16分型鉴定为7个基因型,1例两次发病时间间隔较短的患者的2株分离株的MLVA-16分型一致,没有差别,提示为复发。而另外3例两次发病时间间隔较长的患者的6株分离菌株,其MLVA-16分型的基因型不同,分别各有一个位点的差异,提示为重复感染。结论 MLVA分型对于布鲁氏菌病的复发与重复感染具有一定的鉴别意义。     

陕西省鼠疫耶尔森菌差异区段分型及其流行病学特征分析

目的分析陕西省鼠疫耶尔森菌差异区段分型及流行病学特征。方法对分离自陕西省鼠疫疫区获得的48株鼠疫菌应用23个DFR(差异区段)和PMT1(质粒验证)PCR扩增,进行鼠疫菌DFR基因组分型及流行病学特征分析。结果相同年份,不同染疫动物、媒介蚤分离的鼠疫菌基因组型基本一致。陕西鼠疫耶尔森菌DFR基因组型有Genomovar11、17、20共3种。1987-1988年份、2000-2001年份DFR基因组型以Genomovar17为主,2006年份以Genomovar20为主。结论不同年份疫情主导的基因组型不同,随着时间的变化,鼠疫菌DFR基因组型从Genomovar17基因缺失微进化到Genomovar20。     

鼠疫耶尔森菌caf1基因缺失株体外生物学特性和对小鼠致病性分析

目的 探索caf1基因缺失对鼠疫耶尔森菌体外生物学特性与对小鼠致病性的影响。方法 利用CRISPR/Cas12a介导的基因编辑技术构建鼠疫耶尔森菌caf1基因缺失株,并通过PCR技术对caf1基因缺失验证。比较鼠疫耶尔森菌caf1基因缺失株和野生株201在生长速率、液体培养状态、聚集情况等体外生物学特性和对小鼠致病性等方面的差异。结果 PCR扩增结果证实,caf1基因缺失株构建成功。体外生物学特征分析表明,与野生株相比,caf1基因缺失株的形态学和生长速率并未发生明显变化,自凝聚率升高。肺递送途径LD₅₀分析表明,caf1的缺失导致鼠疫耶尔森菌气溶胶感染小鼠半数致死剂量显著降低。结论 不同途径感染结果表明,caf1基因缺失株相较于野生株,在肺递送、滴鼻、皮下、尾静脉注射4种途径下对BALB/c小鼠的毒力均降低。caf1基因的缺失导致鼠疫耶尔森菌自凝聚率升高,对BALB/c小鼠致病性下降。     

基于核酸预混室温储运技术的荧光定量PCR快速检测鼠疫耶尔森氏菌

目的 实现荧光定量PCR技术在鼠疫现场和基层的应用。方法 本试验将已建立的基于核酸预混室温储运技术的荧光定量PCR方法应用于我国各鼠疫疫源地野生菌株的检测,进行特异性评价。选取分布于我国境内不同鼠疫疫源地野生鼠疫耶尔森氏菌株、鼠疫减毒菌株、耶尔森菌属近缘菌株假结核菌及小肠结肠炎菌进行荧光定量PCR检测。结果 55株鼠疫耶尔森氏菌及鼠疫减毒菌株扩增阳性,假结核耶尔森氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌无阳性扩增,冻干试剂在室温25 ℃和37 ℃条件下可保存6个月,敏感性与冷冻保存无差异,核酸扩增诊断可在1 h内完成。结论 应用基于核酸预混室温储运技术的荧光定量PCR方法对我国各鼠疫疫源地55株鼠疫耶尔森氏菌检测呈现高度特异性,本试验冻干试剂具有可室温保存、便于运输、检测结果精准、快速等特点,具有较好的鼠疫现场应用前景。     

四川省德格县2株疑似喜马拉雅旱獭鼠疫菌株的鉴定

目的 通过对四川省德格县自毙喜马拉雅旱獭体内分离出的2株疑似鼠疫菌株进行生化特征、毒力鉴定,确定四川省是否存在旱獭鼠疫自然疫源地.方法 菌株鉴定采用细菌形态染色、培养特性、鼠疫噬菌体裂解试验、生化及糖醇类酵解试验、毒力因子、毒力、营养需求、质粒、基因检测及基因分型方法进行.结果 光镜下,2株被检菌株均为革兰染色阴性,呈球杆状,两极浓染、两端钝圆;在赫氏普通琼脂上24-48 h,被检菌株形态呈中心发暗,有黄褐色粗糙颗粒,边缘不整呈锯齿状、薄而透明的花边;在赫氏血琼脂上,菌落隆起,色泽深,花边消失或残留锯齿状痕迹.2株被检菌株均能酵解阿胶糖、麦芽糖、甘油,不酵解鼠李糖、密二糖,脱氮阳性;毒力因子均为F1+、VW+、Pgm+,Pst I+;携带鼠疫菌常见的质粒,相对分子质量(Mr)为6.0×106、45.0×106、65.0×106,具有鼠疫菌的毒力相关质粒基因Pla、calfl、LcrG;对小鼠的毒力试验,绝对致死量(LD100)均为50个菌;营养需求上,对苯丙氨酸、甲硫氨酸依赖;基因型是Genomovar 5;与假结核菌(PTB)在鉴别培养基尿素、奥腾、枸橼酸盐上有明显区别,含鼠疫菌特有的Pst I和F1抗原,22℃下能被鼠疫噬菌体完全裂解.含有鼠疫菌特有的3a片段.结论 四川省德格县喜马拉雅早獭体内分离的2株疑似菌株均为鼠疫耶尔森菌,具有青藏高原喜马拉雅旱獭型鼠疫菌株的特性,四川省存在喜马拉雅旱獭鼠疫自然疫源地.     

云南鼠疫耶尔森菌基因分型研究

目的通过对来自云南省鼠疫自然疫源地155株鼠疫菌进行基因分型,了解鼠疫菌的进化规律。方法根据22个差异区段(differentregions,DFR)设计引物,PCR扩增鼠疫菌的每个DFR。结果滇西山地闽广沿海居民区黄胸鼠鼠疫自然疫源地137株鼠疫菌的基因型均为9型。滇西山地齐氏姬鼠大绒鼠鼠疫自然疫源地18株鼠疫菌,有10株菌为7型,8株菌为9型。结论滇西山地齐氏姬鼠大绒鼠鼠疫自然疫源地鼠疫菌的基因型为7型和9型,而滇闽广沿海居民区黄胸鼠鼠疫自然疫源地鼠疫菌的基因型主要为9型。两疫源地鼠疫菌在遗传关系上有亲缘性,后者可能由前者进化而来。     

云南省个旧市鼠疫的流行病学调查

１９９６年７￣１２月，云南省个旧市发生了鼠疫流行。经现场流行病学调查，病原学和血清学检验，证实腺鼠疫患５人；并从黄胸鼠体分离到鼠疫菌５株，查出反相血凝阳性６份，对所获３株鼠疫菌做了质粒图谱分析，除携有６５、４５和６ＭＤ三种质粒外，还有分子量约４ＭＤ的质粒，调查认为：此次鼠疫流行为我省北纬２５°以南的历史家鼠（黄胸鼠）鼠疫疫源地在静息８５年后的地区性复燃。     

甘肃省临床分离结核分枝杆菌MLVA分型初步研究

目的随机选取2005-2007年间甘肃省肺科医院临床分离结核分枝杆菌菌株,通过多位点可变数目串联重复序列(Multiple locus variable numbers of tandemrepeats analysis,MLVA)分型,了解甘肃结核分枝杆菌流行菌株基因型情况。方法选择标化的15个VNTR位点,对临床分离菌株DNA进行检测,DNA指纹图谱使用Bio Numerics4.5软件进行统计分析,得出聚类分析结果。结果 228株结核分枝杆菌被分为4大基因群,7个大基因类型,分别包含13(5.7%)、3(1.3%)、7(3.1%)、1(0.4%)、171(75%)、31(13.6%)、2(0.9%)个株菌;在株水平基因分型上,93(40.8%)株为单菌株基因型;其余菌株基因型分别包含2-10株结核分枝杆菌,共构成132个基因簇。结论甘肃结核分枝杆菌菌株存在丰富的基因多态性,ML-VA方法具有较高的基因分型能力,可以满足结核分枝杆菌株水平DNA分型的需要。甘肃省结核分枝杆菌流行株主要为北京家族基因型菌株。     

青海省鼠疫疫源地鼠疫耶尔森菌的基因型分布

目的研究青海省鼠疫耶尔森菌(鼠疫菌)基因型分布特征。方法对分离到的青海省148株鼠疫菌,根据已经证实的22个差异区段设计引物,每株鼠疫菌的每个基因差异区段都采用PCR技术进行验证。结果148株青海省鼠疫菌共包括8个基因型,即1、5、7、8、14型、新基因组型和Ype-ancestor型,其中以5型和8型为主。祁连山南麓和青海湖环湖地区的祁连、门源、刚察、海晏、共和、天峻等的菌株绝大多数属于基因型8型,占40．5％(60／148);位于青南高原的格尔木、玉树、扎多、治多、称多、囊谦和曲麻莱等的菌株,其基因型主要为5型,占31．8％(47／148)。青藏高原青海田鼠鼠疫疫源地鼠疫菌基因型全部为14型,占8．1％(12／148)。结论在青海省分离的鼠疫菌中,喜马托雅旱獭鼠疫疫源地鼠疫菌的基因型以5型和8型为主,青海田鼠疫源地鼠疫菌以基因型14型为主。