HBx、MHBst155真核表达载体构建及在HepG2细胞中的表达

目的建立稳定、高效的HBx、羧基末端截短的中分子表面蛋白(MHBst)体外表达细胞株,以进一步研究HBx、MHBst蛋白在肝癌发生中的作用及其机理。方法设计特异性引物,采用PCR方法从adr亚型HBV质粒pHBV DNA中扩增HBx、羧基末端截短至155位氨基酸的中分子表面蛋白(MHBst155)编码基因,并定向插入绿色荧光蛋白(GFP)表达载体pEGFP-C1的BglⅡ、KpnⅠ和BglⅡ、BamHⅠ酶切位点,转化宿主菌DH5α,提取质粒,分别用上述内切酶酶切及DNA测序鉴定重组质粒。采用脂质体介导将空载体、重组质粒分别转染到人肝肿瘤细胞株HepG2中,G418筛选抗性细胞克隆,荧光显微镜下观察GFP表达,挑取表达GFP的抗性克隆扩大培养、传代。采用RT-PCR、蛋白印迹检测抗性细胞中HBx、MHBst155的mRNA及蛋白水平。结果经酶切及测序鉴定成功构建了pGFP-HBx、pGFP-MHBst155重组表达载体,将空载体及重组质粒转染HepG2,经G418筛选约20 d获得抗性细胞克隆。将带有绿色荧光的抗性克隆扩大培养并经传代40次,细胞仍表达强的绿色荧光。RT-PCR及蛋白印迹检测表明转染重组体的HepG2/GFP-HBx、HepG2/GFP-MHBst155细胞有相应的条带,而空载体、空白对照组未出现条带。结论成功构建了HBx、MHBst155真核重组表达载体pGFP-HBx、pGFP-MHBst155,获得了稳定表达融合蛋白GFP-HBx、GFP-MHBst155的HepG2细胞系,为进一步研究HBx及MHBst蛋白在肝癌发生中的作用及分子机制构建了良好的平台。     

HBx基因重组逆转录病毒载体的构建及表达

目的:构建携带HBx基因的重组逆转录病毒载体,为进一步研究HBx基因在HBV相关性HCC(原发性肝癌)发病机制中的作用以及建立肝癌动物模型奠定基础.方法:根据基因库中已公布的HBx序列设计引物,采用PCR技术从HBx腺病毒质粒中扩增出HBx基因.将HBx基因克隆到逆转录病毒载体pSEB-HUS质粒中.酶切、PCR及测序鉴定后经脂质体介导转染L02细胞,Western Blotting检测HBx蛋白的表达.结果:PCR、酶切及测序鉴定证实目的基因正确克隆至逆转录病毒质粒pSEB-HUS中,目的基因序列与GENE BANK报道一致,转染L02细胞后荧光显微镜可观察到GFP的表达.Western Blotting检测可见HBx蛋白的表达.结论:成功构建HBx重组逆转录病毒载体.     

人类pEGFP/H2B真核表达质粒的构建及表达

目的:构建人H2B基因与GFP融合的绿色荧光蛋白真核表达质粒,并在HEK293细胞中表达.方法:通过RT-PCR从HEK293细胞总RNA中扩增获得H2B基因的部分cDNA序列,与载体pEGFP-C1连接构建H2B基因与GFP融合表达的真核表达质粒pEGFP/H2B,经酶切和测序鉴定;应用脂质体转染技术将重组质粒转染HEK293细胞观察融合蛋白的表达.结果:成功构建H2B基因与GFP融合的绿色荧光蛋白真核表达载体,与对照组中转染空载体pEGFP-C1的HEK293细胞中的弥漫荧光相比,转染重组质粒的细胞中可观察到绿色荧光蛋白集中表达在细胞核内,分裂期细胞中可见与染色体形态一致的绿色荧光.结论:该载体的成功构建为研究染色体的分离机制建立了有效的观察体系.     

小鼠肿瘤坏死因子受体1基因的克隆及其与绿色荧光蛋白的融合表达

目的：构建小鼠肿瘤坏死因子受体1（TNFR1）和绿色荧光蛋白（GFP）的融合基因真核表达质粒，然后在中国仓鼠卵巢（CHO）细胞表达，为TNFR1的基因干预研究提供简便的判定手段。方法：从小鼠肝组织提取总RNA，RT-PCR扩增出TNFR1基因的cDNA片段，将目的片段克隆至pMD18-T载体。酶切和测序鉴定，然后将目的片段酶切回收后插到GFP表达载体pEGFP-N2中GFP基因序列的上游，构建TNFR1-EGFP融合基因真核表达载体pEGFP-TNFR1，将该重组质粒转染到CHO细胞后24—48h，用免疫组化技术检测TNFR1的表达情况。同时荧光显微镜下观察GFP表达情况。结果：扩增出了长约1360bp的基因片段，并将其克隆至pMD18-T载体，酶切和测序鉴定无误；将pMD-TNFR1中TNFR1基因亚克隆至pEGFP-N2载体，酶切鉴定无误；重组质粒pEGFP-TNFR1转染CHO细胞后，免疫组化染色可见细胞有阳性棕染，同时荧光显微镜下也可观察到绿色荧光蛋白的表达。结论：成功构建了小鼠TNFR1-EGFP融合基因真核表达质粒；重组质粒可在CHO细胞中表达出TNFR1-EGFP融合蛋白，为进一步的TNFR1基因干扰研究奠定了基础。     

绿色荧光蛋白表达质粒的构建及鉴定

目的构建能表达绿色荧光蛋白的载体———pCDNA3.1-GFP。方法使用基因重组方法从质粒pGreenlantern中获取绿色荧光蛋白基因片段,克隆入PCDNA3.1的多克隆区,构建成PCDNA3.1-GFP,通过限制性核酸内切酶NotI与BamHI对所建质粒进行分析后,转染HepG2细胞并观察绿色荧光蛋白表达。结果经限制性内切酶及转染HepG2细胞表达鉴定,证实成功构建了PCDNA3.1-GFP。结论成功构建成携有绿色荧光蛋白报告基因哺乳动物表达载体,该质粒可用于融合表达目的蛋白,并将目的蛋白表达定位。     

新基因XTP11剪切体的克隆与亚细胞定位

[目的]克隆乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)X蛋白反式调节基因11(XTP11)的剪切体,观察剪切体蛋白在人肝癌细胞HepG2中的定位。[方法]利用逆转录-聚合酶链式反应(reverse transciptase-polymerase chain re-action,RT-PCR)技术扩增XTP11剪切体,将目的基因片段插入克隆载体pGEM-T中,经双酶切和测序鉴定后,定向克隆至荧光表达载体pEGFP-C1中,转染HepG2细胞,荧光显微镜下观察确定其亚细胞定位。[结果]XTP1剪切体的开放阅读框长度为1314 bp,编码产物为437个氨基酸残基;重组质粒在HepG2细胞中转染效率为50%,蛋白定位于细胞浆。[结论]转染重组表达载体的细胞内出现局限性强绿色荧光信号,推断目的蛋白位于细胞质内。XTP11剪切体的克隆和亚细胞定位为进一步从分子水平分析其生物学功能奠定基础,为阐明其在乙型肝炎病毒X蛋白致病机制中的作用提供信息。     

BMP-7/GFP融合基因在人肾小管上皮细胞的表达与定位

目的 构建骨成形蛋白-7(BMP-7)／绿色荧光蛋白(GFP)融合基因，观察其在人肾小管上皮细胞的表达与定位。方法 将小鼠BMP-7全长eDNA与GFP融合，连接进入真核细胞表达质粒pEGFP-C1中，以脂质体介导的方法将重组表达质粒pEGFP-C1-BMP-7转染入人肾小管上皮细胞。采用Western blot方法检测BMP-7在肾小管上皮细胞的表达；激光共聚焦荧光显微镜观察BMP-7在人肾小管上皮细胞中的定位情况。结果 限制性酶切以及DNA测序结果均说明所构建的重组质粒为BMP-7／GFP融合基因表达质粒。瞬时转染入肾小管上皮细胞BMP-7蛋白表达量较空载体转染组明显增加；GFP转染的细胞荧光均匀分布在整个细胞中，而pEGFP-C1-BMP-7转染的细胞荧光主要集中在细胞浆和细胞膜表面。结论 重组BMP-7／GFP融合蛋白具有GTP自发荧光的特性，且不影响BMP-7在细胞内的正确表达。     

乙肝病毒X基因真核表达载体pEGFP-X的构建及其表达

目的：构建pEGFP—X真核表达载体,观察其在肝癌细胞株中的表达。方法：从质粒pcDNA3．1（＋）-X酶切获HBVX基因片段,克隆至pEGFP—N1;用酶切、PCR和测序鉴定pEGFP—X载体;用脂质体法,将重组载体（pEGFP—X）和空载体（pEGFP-N1）瞬时转染肝癌细胞细胞株BEL-7402;分别用RT—PCR、荧光显微镜鉴定HBVX和EGFP基因表达。结果：鉴定证实pEGFP-X载体构建成功;该质粒瞬时转染的BEL-7402有HBVX基因表达,并发绿色荧光。结论：构建的pEGFP—X真核载体能在BEL-7402中表达,绿色荧光蛋白示踪利于表达HBVX基因稳定细胞株的筛选,并为探讨HBVX基因在HCC中的致瘤机理提供实验模型奠定基础。     

人GFP—AWP1融合基因载体的构建及其在293细胞中的表达

目的 克隆、构建绿色荧光蛋白(GFP)-AWPI(associated with protein kinase Crelated kinase I，AWPI)表达载体,观察AWPI在293细胞中表达和定位。方法 采用逆转录PCR(RT—PCR)法从人ECV304内皮细胞中扩增AWPI cDNA编码区．并将其重组于GFP表达载体pEGFP—C2中。经酶切，序列鉴定分析后，将该重组质粒通过DOTAP脂质体介导，转染293细胞。荧光显微镜观察AWPI在细胞内的表达和分布。结果 GFP—AWPI融合基因表达载体经酶切鉴定和测序分析确认构建成功，并在293细胞中获得了高效表达。荧光显微镜下，在不携带外源基因的空载体pEGFP—C2转染的对照组293细胞,绿色荧光均匀分布于整个细胞中；在重组质粒pEGFP—C2／AWPI转染的293细胞，绿色荧光弥散分布于细胞质内。结论 成功构建GFP—AWPI融合基因表达载体并表达于293细胞胞质中。     

人hepcidin真核表达载体的构建及稳定转染细胞系的建立

目的 构建人hepcidin全长结构基因真核表达载体,建立稳定高表达hepcidin的HepG2细胞系,以应用于拮抗hepcidin从而增强铁吸收的活性药物筛选.方法 化学合成结合PCR拼接hepcidin 全长结构基因,插入原核表达载体pMD18-T中,测序正确后再经HindⅢ与EcoRⅠ双酶切,定向插入真核表达载体pcDNA3.0内,酶切鉴定后,采用脂质体转染法将重组质粒转染人HepG2细胞,G418选择抗性细胞克隆,ELISA检测转染细胞hepcidin的蛋白表达.结果 经酶切鉴定,成功构建hepcidin真核表达载体pcDNA3-hepcidin;重组质粒转染HepG2,经G418筛选3周获得抗性细胞克隆,其hepcidin蛋白表达量为普通HepG2细胞表达量的3倍.结论 成功构建了稳定高表达hepcidin的HepG2细胞,该稳定转染细胞系的建立为进一步研究hepcidin降低肠道铁吸收的分子机制以及筛选拮抗hepcidin作用的活性药物奠定了实验基础.     

鼠尾胶原蛋白提取、分离、纯化方法的建立及鉴定

目的建立一种高效提取、分离、纯化鼠尾胶原蛋白的方法。方法通过对鼠尾进行剥离获得鼠尾腱,用Tris-HCl缓冲液、胃蛋白酶处理获得鼠尾胶原蛋白原液、反复使用氯化钠溶液进行分级盐析、醋酸溶液复溶进行鼠尾胶原蛋白的纯化。超纯水透析除去无机盐类获得纯化的鼠尾胶原蛋白。通过SDS-PAGE蛋白质电泳、氨基酸含量分析等技术手段鉴定。结果本研究建立的方法可以获得高纯度的鼠尾胶原蛋白,纯度达到电泳纯。与国外进口的商业化鼠尾胶原蛋白产品相比无差异。研究了提取、分离、纯化参数对得率、纯度的影响,建立了最优的鼠尾胶原蛋白提取条件,胃蛋白酶用量:1∶500,酶解时间:72 h,盐析浓度:2 mol/L,提取所用酸溶液:0.05mol/L醋酸溶液。结论为鼠尾胶原蛋白的扩大化生产提供了合适的工艺参数,为大量获得鼠尾胶原蛋白并进行更深层次的功效方面研究提供了理论支持和实践基础。     

Akt的PH结构域与其调节区的结合

目的 从人T细胞中克隆Akt的PH结构域及其调节区基因并进行6-his和GST融合表达，研究二者的体外结合情况，为进一步研究Akt的调节区在其分子激活中的作用打下基础。方法 以RT-PCR的方法从人T细胞中扩增目的基因片段，测序证明序列正确，再将正确的目的基因片段定向克隆到表达载体pRSET-A和pGEX-4T-1中，以IPTG诱导，获得Akt的PH结构域及其调节区与6-his和GST的融合表达。表达的PH结构域融合蛋白经谷胱甘肽耦联的琼脂糖珠纯化，以pull-down法检测该PH结构域与6-his调节区的结合。结果 Akt的PH结构域和调节区基因序列完全正确。得到与GST和6-his的融合表达，表达产物有较高可溶性。结论 SDS-PAGE检测到PH结构域可在体外与调节区特异地结合。     

绿色荧光蛋白-小鼠纤维介素蛋白融合基因表达载体的构建和表达

目的：构建绿色荧光蛋白(GFP)和小鼠纤维介素蛋白(mfgl2)的融合蛋白表达载体，在仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达，为mfgl2的RNA干扰体外研究提供简便的判断手段。方法：用PCR从mfgl2cDNA文库中扩增出mfgl2cDNA片段，插入到GFP表达载体pEGFP—N2中GFP基因序列的上游，构建成GFP—mfgl2融合基因表达载体pEGFP—mfgl2，将该载体转染到CHO细胞后24—48h，通过荧光显微镜观察并摄片。结果：扩增出长约1．3kb的基因片段，经双酶切鉴定和测序鉴定无误；重组载体转染CHO细胞后，在荧光显微镜下可观察到GFP的表达。结论：成功构建了pEGFP．mfgl2融合基因表达载体；重组载体可在CHO细胞中表达出GFP—mfgl2融合蛋白，为下一步进行mfgl2RNA干扰研究提供了简便的判断手段。     

树舌多糖对HepA小鼠瘤细胞蛋白质表达影响的研究

目的探讨树舌多糖抗肿瘤的作用机制,寻找特异蛋白。方法将各组小鼠的眼血清蛋白、匀浆蛋白、膜糖蛋白分别做PAGE电泳,分析其蛋白组分的变化。结果树舌多糖作用后血清蛋白、匀浆蛋白、膜糖蛋白的蛋白组分都有变化。     

亲和层析纯化重组中性粒细胞激活蛋白

目的:直链淀粉树脂亲和层析法分离纯化重组麦芽糖结合蛋白-中性粒细胞激活蛋白(recombinantmaltose-binding protein-neutrophil-activating protein,rMBP-NAP)。用于支气管哮喘模型小鼠进行免疫调节实验。方法:IPTG诱导基因工程菌E.coli TB1(pMAL-c2X-nap)表达rMBP-NAP,离心收获细胞,过柱缓冲液重悬菌体并超声破碎,再次离心取上清和沉淀,SDS-PAGE分析rMBP-NAP可溶性;直链淀粉树脂亲和层析法分离纯化rMBP-NAP;SDS-PAGE凝胶扫描分析纯化后rMBP-NAP纯度;蛋白定量试剂盒测定rMBP-NAP浓度。结果:IPTG诱导工程菌表达的rMBP-NAP主要以可溶性形式存在于超声上清中,相对分子质量约为57 kD,与预期结果一致;亲和层析法纯化rMBP-NAP纯度可达96.5%,浓度可达0.625 g/L。结论:用直链淀粉树脂亲和层析法,可纯化得到高纯度、高浓度的融合蛋白rMBP-NAP。     

微重力对骨骼肌蛋白代谢的影响

失重环境下肌肉萎缩的发生是由于骨骼肌蛋白质代谢的紊乱,包括蛋白合成降低和蛋白降解增强所致。本文就失重环境下肌原纤维蛋白在合成和降解过程中的多种影响因素,如肌原纤维mRNA的表达、热休克蛋白和泛素等的改变及其作用进行综述。     

HEREDITARY PROTEIN S DEFICIENCY——SURVEY OF A CHINESE FAMILY

A 76-year-old woman was diagnosed as having left lilac deep vein thrombosis due to a hereditary deficiency of protein S, seventeen members of her family were studied with the measurements of total protein S (TPS), free protein S (FPS), protein C (PC) and anti-thrombin-Ⅲ(AT-Ⅲ). The results showed that the level of FPS of thepatient was only 7%, while that of TPS 137.1%. Her secondson had a low FPS level (13.4%) too, and his TPS level was 48.1%. PC and AT-Ⅲwere all normal It was thus the first case of hereditary PS dificiency reported in China.     

Survivin、Her-2、P16和PTEN在膀胱癌中的表达及意义

目的研究Survivin、Her2、P16和PTEN蛋白在膀胱癌中的表达及其生物学意义。方法采用免疫组织化学SP法检测43例膀胱移行细胞癌和10例正常膀胱组织中以上4种蛋白的表达。结果4种蛋白在膀胱癌中的表达与在正常膀胱黏膜比较差异均有显著性意义(均为P<0.01)。不同临床分期间Her2和PTEN表达的差异具有显著性意义(P<0.05);不同病理分级间Survivin、Her2和PTEN表达的差异具有显著性意义(P<0.05或P<0.01)。Her2和Survivin蛋白表达间存在正相关(r=0.821,P<0.05)。结论Her2和Survivin的高表达是膀胱癌预后不良的指征;P16可作为早期诊断的标记物;PTEN则可作为膀胱癌预后不良的独立性指标。     

肺癌组织中Fhit蛋白和PCNA蛋白表达及意义

目的　探讨肺癌组织中Fhit蛋白和PCNA蛋白表达及其与临床病理因素的关系。方法　应用免疫组织化学S P法检测 6 2例肺癌组织中Fhit蛋白和PCNA蛋白表达。结果　肺癌组织中Fhit蛋白和PCNA蛋白表达阳性率分别为 5 3.2 %和6 4 .5 % ,PCNA蛋白表达阳性肺癌Fhit蛋白阳性率明显低于PCNA蛋白表达阴性肺癌 (P <0 .0 1)。Fhit蛋白和PCNA蛋白在肺癌中表达与肺癌的分化程度、淋巴结转移、3年生存期均密切相关 ,PCNA蛋白与肺癌病理类型亦有关。结论　Fhit蛋白和PC NA蛋白异常表达与肺癌发生、发展密切相关 ,二者相互抑制 ,呈明显负相关     

非小细胞肺癌患者肺耐药蛋白和多药耐药相关蛋白的表达及其临床意义

目的 检测肺耐药蛋白和多药耐药相关蛋白在非小细胞肺癌（NSCLC）中的表达情况.并探讨其临床意义.方法 采用免疫组化方法对术前未经化疗、术后病理诊断明确的92例肺癌组织标本并以20常肺组织作为对照进行了多药耐药相关蛋白（MRP）、肺耐药蛋白（LRP）表达的检测.并对病理类型、分化程度、临床分期、预后等进行统计学分析.结果 （1）92例肺癌组织中MRP、LRP及其两者共表达的阳性率分别为53%、52%和45%,均显著高于正常肺组织中的表达水平（P〈0.05）.（2）MRP、LRP蛋白表达在不同病理类型、不同分化程度之间具有统计学差异（P〈0.05）,而在不同年龄、性别、临床分期、淋巴结转移情况等均无明显差异.另外,MRP、LRP蛋白的表达与患者预后密切相关,且随着耐药蛋白表达种类的增加,生存曲线水平下降.结论 NSCLC中MRP、LRP的表达可能在肺癌的原发性多药耐药中起不同程度的作用,检测NSCLC中MRP、LRP在判断患者预后.指导肿瘤化疗方面具有重要的临床意义.