空肠弯曲菌Pen:19 cadF基因真核表达重组质粒的构建与表达

目的：构建空肠弯曲菌Pen：19cadF基因真核表达重组质粒，并证实其能在COS-7细胞中表达。方法：以含有KpnI和EcoRI酶切位点的同一对引物行PCR反应，获得空肠弯曲菌Pen：2、Pen：8、Pen：19和Pen：21cadF基因DNA片段。并选择与格林-巴利综合征最为相关的空肠弯曲菌Pen：19PCR产物为目的基因片段，插入到真核表达载体pcDNA3．1（＋）中，以构建重组质粒pcDNA3．1（＋）-cadF。重组质粒经双酶切、PCR反应鉴定和DNA双向测序确认后转染至COS-7细胞。运用RT-PCR方法检测重组质粒在细胞mRNA水平的表达。结果：双酶切反应、PCR反应和DNA双向测序证实cadF基因插入成功。采用RT-PCR方法能够从重组质粒转染的COS-7细胞中扩增出与目的基因大小一致的DNA片段。结论：空肠弯曲菌Pen：19cadF基因真核表达重组质粒pcDNA3．1（＋）-cadF构建成功，并能在COS-7细胞中表达。为空肠弯曲菌DNA疫苗的研究奠定了良好的基础。     

携带flk-1的减毒沙门疫苗菌抗胶质瘤血管生成的研究

目的观察表达鼠血管内皮生长因子受体2（VEGFR2，flk-1）的重组减毒鼠伤寒沙门疫苗菌对胶质瘤荷瘤小鼠的抗肿瘤血管及肿瘤生长抑制作用。方法构建真核表达载体pcDNA3、1-flk-1通过电转化法将pcDNA3．1-flk-1导入减毒鼠伤寒沙门菌SL7207中，经由胃管饲于C57BL／6J小鼠，对胶质瘤荷瘤小鼠进行免疫预防及治疗。通过观察免疫动物的生存期，免疫荧光法检测肿瘤血管密度，评价重组疫苗菌的抗血管及肿瘤生长抑制作用。分离免疫小鼠的脾细胞，分析重组疫苗菌免疫后小鼠体内的特异性细胞毒性T细胞（CTL）应答。结果重组疫苗菌免疫能够明显减少肿瘤血管密度，延缓胶质瘤的生长，延长小鼠生存期，获得明显的抗肿瘤效果。重组疫苗菌免疫后可诱导小鼠脾淋巴细胞产生针对flk-1的CTL活性。结论表达鼠flk-1的重组减毒鼠伤寒沙门疫苗菌经口服免疫，可打破小鼠对于自身抗原flk-1的免疫耐受，诱导小鼠产生抗flk-1的特异性免疫反应，特异性杀伤肿瘤血管内皮细胞，预防和治疗小鼠胶质瘤。     

Sjcb2 DNA疫苗的构建及其在真核细胞中的表达（英文）

目的 克隆日本血吸虫组织蛋白酶B基因，构建真核表达重组质粒，转染真核细胞，观察其表达情况。方法用PCR技术从已构建好的重组质粒pBCSK＋／Sjcb2中扩增出Sjcb2基因片段，重组入克隆载体pUCm-T。再将Sjcb2基因片段亚克隆入真核表达载体pcDNA3．1（＋）。进行PCR、双酶切和DNA序列鉴定后，运用电穿孔技术将重组体pcDNA3．1（＋）／Sjcb2转染HeLa细胞，间接免疫荧光技术观察目的基因的表达。结果成功扩增出Sjcb2基因片段并构建DNA疫苗；重组质粒在HeIJa细胞中获得表达。结论Sicb2基因能够在体外真核细胞中表达。     

HBsAg和GM-CSF融合表达质粒的构建

目的：构建乙肝HBsAg和GM-CSF的融合表达质粒，借助GM—CSF的免疫佐剂作用，提高乙型肝炎DNA疫苗的免疫效果。方法：用PCR方法分别从pEcob6和pCD-hGM—CSF中扩增出基因S和GM-CSF，克隆到真核表达质粒pcDNA3．1( )中，构建pcDNA3．1-S及融合表达质粒pcDNA3．1-GM-CSF-S，然后以重组质粒转染真核细胞，研究重组质粒体外表达。结果：经酶切鉴定及DNA序列证实重组质粒构建正确，细胞转染试验表明重组质粒能在COS-7及HepG-2内表达。结论：乙肝HBsAg和GM-CSF的融合表达质粒构建成功，重组质粒能在真核细胞内表达。     

猪endoglin胞外段真核表达载体的构建及其诱导抗小鼠自身endoglin抗体的实验研究

目的分别扩增猪和小鼠endoglin胞外段cDNA,构建真核表达载体作为DNA疫苗,了解猪endoglin DNA疫苗是否能够在小鼠体内诱导产生抗小鼠endoglin的自身抗体.方法利用RT-PCR技术,从猪和小鼠胚肝中分别扩增出猪和小鼠的endoglin胞外段,用内切酶消化后分别将其插入真核表达质粒pcDNA3.1( )中,经琼脂糖凝胶电泳和测序鉴定后,体外转染真核细胞COS-1,用RT-PCR和免疫印迹鉴定是否能正确表达.然后大量扩增和提取相应质粒,将这些质粒作为DNA疫苗,肌注免疫小鼠,通过ELISA、免疫印迹和ELISPOT测定抗自身endoglin的抗体和脾脏中分泌特异性抗endoglin抗体的B淋巴细胞.结果琼脂糖凝胶电泳和测序鉴定证实RT-PCR扩增的cDNA及构建的重组真核表达质粒正确,重组的真核表达质粒能在COS-1细胞中正确表达,猪endoglin胞外段真核质粒DNA疫苗免疫小鼠可以诱导产生抗小鼠endoglin的自身抗体.结论重组猪endoglin胞外段真核表达载体可作为DNA疫苗用于抗肿瘤血管生成的基因治疗.     

梅毒螺旋体外膜蛋白Gpd在Hela细胞中的表达及鉴定

目的 构建梅毒螺旋体（Tp）外膜蛋白甘油磷酸二酯磷酸二酯酶基因（Gpd）的真核表达载体peDNA3．1（＋）-Gpd，鉴定其在Hela细胞的表达，为开展TpDNA疫苗动物实验打下基础。方法 用PCR从TpNichols株基因组中扩增Gpd基因，构建真核表达重组质粒pcDNA3．1（＋）-Gpd，脂质体介导转染入Hela细胞，以免疫组化及跳tern-blot检测在Hela细胞中的表达。结果 双酶切及DNA测序显示重组质粒含有1059bp的目的基因片段，读码框架正确，无突变。该重组质粒在Hela细胞能有效表达分子量为41kDa的目的蛋白，重组蛋白能-9梅毒螺旋体阳性血清反应。结论 构建的质粒peD-NA3．1（＋）-Gpd成功地在体外真核细胞中表达。     

以HBc颗粒为呈现载体的真核表达载体pcDNA3．1-HBc^Hhel的构建

目的构建含乙肝核心C基因的真核表达载体pcDNA3．1-HBc^Hhel探索其作为DNA疫苗载体的可能性。方法采用分子克隆技术在原核表达质粒pTrc—core的HBcAg el—loop处添加Nhel酶切位点，双酶切此重组载体pTrc-core^Nhel及真核表达载体pcDNA3．1，产物经纯化、T4DNA连接酶连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α，筛选抗Amp^＋克隆并提取质粒进行酶切及PCR鉴定。结果成功构建了真核表达质粒pcDNA3．1-HBc^Hhel。结论该重组质粒可作为治疗性及预防性疫苗的候选载体，为深入研究预防性及治疗性疫苗奠定了基础。     

人趋化因子受体CCR6的克隆、表达及其功能分析

目的构建人趋化因子受体6（CCR6）cDNA序列的真核表达载体．并在HEK293细胞中表达．为研究CCR6生物学功能和筛选CCR6拮抗剂奠定基础。方法采用RT-PCR方法从人扁桃体克隆CCR6受体的DNA片段．并将该片段插入真核表达质粒pcDNA3．1（＋）中,构建重组真核表达质粒pcDNA3、1（＋）-CCR6;将该质粒pcDNA3、1（＋）-CCR6转染HEK293细胞．用流式细胞术检测转染pcDNA3．1（＋）-CCR6质粒的HEK293细胞;采用体外趋化实验、钙流实验,验证转染pcDNA3.1（-）．CCR6质粒的HEK293细胞表面表达的CCR6的生物学活性。结果经RT-PCR获得了编码人CCR6受体的DNA片段．构建了重组真核表达质粒pcDNA3．1（＋）-CCR6：转染HEK293细胞．经流式细胞仪检测、趋化实验、钙流实验证实．表达CCR6的HEK293细胞具有趋化因子受体CCR6的生物学活性。结论重组人趋化因子受体CCR6克隆成功．并在HEK293细胞中获得了表达．为研究CCR6的生物学功能及筛选CCR6拮抗剂奠定了基础。     

T淋巴瘤TCRβ链独特型DNA疫苗在小鼠骨骼肌中的基因蛋白表达

目的：检测T淋巴瘤TCRβ链独特型DNA疫苗的基因表达。方法：大剂量提取质粒，将BALB／c鼠随机分为pcDNA3．1组、pcDNA3．1／TCRVβ8组、pcDNA3．1／TCRβ8＋IL－2组、pcDNA3．1／TCRVβ8＋CpG＋脂质体组和全硫代CpG组共5组（每组6只），双侧股四头肌内注射疫苗免疫，于第0、2、4周各免疫1次，共3次。接种疫苗后5d，用RT－PCR法检测重组质粒mRNA表达。接种疫苗后7d应用免疫组化检测重组质粒蛋白表达。结果：pcDNA3．1／TCRVβ8组、pcDNA3．1／TCRVβ8＋IL－2组、pcDNA3．1／TCRβ8＋CpG＋脂质体组小鼠骨骼肌中均显示mRNA和蛋白表达，而pcDNA3．1组和全硫代CpG组未见mRNA和蛋白表达。结论：T淋巴瘤TCRβ链独特型DNA疫苗在小鼠骨骼肌中有效地表达了基因产物。     

人脂蛋白脂酶基因重组质粒的构建及其表达

目的研究野生型人脂蛋白脂酶(LPL)cDNA重组表达质粒的构建了及其在COS-1细胞中的表达。方法采用RT-PCR法从人大网膜脂肪组织获取LPL cDNA基因,以pcDNA3.1Zeo( )质粒作为载体,运用基因克隆技术构建野生型人LPLcDNA重组质粒,限制性内切酶酶切、PCR以及双向测序鉴定重组质粒;运用L ipofectam ine 2000TM将重组pcDNA3.1Zeo( )-LPLcDNA质粒导入COS-1细胞,RT-PCR法检测LPL mRNA,ELISA法和比色法分别检测细胞裂解液及细胞培养基中LPL浓度及活性。结果经限制性内切酶酶切及PCR鉴定,证实LPL基因已被连接到pcDNA3.1Zeo( )质粒中;DNA双向测序证实其产物与基因库中LPL基因序列完全一致。LPL mRNA和蛋白表达及其活性测定结果表明,pcDNA3.1Zeo( )-LPL cDNA重组质粒已转染入COS-1细胞中。结论实验成功构建野生型人LPL cDNA重组表达质粒,并证实其能在COS-1细胞中有效表达。     

弓形虫SAG1、SAG3基因的克隆和复合基因SAG1/SAG3真核表达重组质粒的构建

目的构建弓形虫表面抗原SAG1、SAG3复合基因的真核表达重组质粒,为弓形虫疫苗的研制作准备。方法提取弓形虫基因组DNA;用PCR技术扩增出表面抗原SAG1、SAG3的基因,再分别重组入pGEM-T克隆载体;将pGEM-SAG1和pGEM-SAG3重组质粒分别经酶切、纯化后定向亚克隆入pcDNA3.1(+)真核表达载体,经PCR、酶切及测序等方法对重组子进行鉴定。结果从弓形虫基因组DNA中扩增出SAG1、SAG3基因;构建了pGEM-SAG1、pGEM-SAG3克隆质粒;成功构建pcDNA3.1(+)-SAG1-SAG3真核表达复合基因质粒,测序表明目的基因定向正确连接。结论构建了pcDNA3.1(+)-SAG1-SAG3复合基因表达质粒,为今后研制弓形虫复合多价疫苗提供候选抗原奠定了实验基础。     

Flk1胞外1-3区基因的克隆及核酸疫苗的构建

目的 :克隆并构建小鼠 Flk1胞外 1 - 3区核酸疫苗 ,并检验疫苗引起特异性免疫反应的能力。方法 :RT- PCR克隆 Flk1胞外 1 - 3区 ,构建核酸疫苗 pc DNA3.1 ( + ) -Flk1 Domain1 - 3,脂质体转染 COS7细胞 ,western- bolt检测表达 ;疫苗免疫小鼠 ;以小鼠血管内皮细胞为靶细胞 ,以免疫的小鼠脾细胞作为效应细胞 ,采用标准 4h51Cr释放法计算 CTL特异性杀伤率。结果 :扩增出 1 2 5 2 bp片段。疫苗 DNA自动测序证明所获基因片段序列阅读框架正确。Western- blot检测转染疫苗的 COS7细胞显示细胞中有分子质量为 44k Da的蛋白表达 ;疫苗组与对照组比较 ,CTL杀伤率差异有显著性。结论 :pc DNA3.1 ( + ) Flk1 -Domain1 - 3核酸疫苗可有效的引起针对 Flk1的免疫反应。     

CONSTRUCTION AND IMMUNOGENICITY OF HUMAN PAPILLOMAVIRUS TYPE 6B L1 RECOMBINANT PLASMID

Objective To construct a DNA vaccine as a prophylactic model to prevent condyloma acuminatum and detect its immunogenicity in mice. Methods The major capsid protein (L1) gene of human papillomavirus (HPV) 6b was inserted into an eukaryotic expression plasmid (pcDNA3.1). The recombinant plasmid was transfected into COS-7 cells. Western blot were performed to detect whether L1 protein can be expressed in eukaryotic cells. Eighteen female BALB/c mice were tested for immunogenicity study. Results The recombinant plasmid (pcDNA3. 1-HPV6bL1) was verified as HPV6b L1 gene by sequencing. Western blot showed specific strip. Anti-L1 protein antibodies could be detected in the mice‘s sera inoculated with pcDNA3.1-HPV6bL1. Similarly, IL-4, IL-2, and IFN-γ were increased in the same mice. Conclusion HPV6b L1 recombinant plasmid was constructed successfully which had immunogenicity for BALB/c mice. It provided experimental evidence for the research of DNA vaccine of condyloma acuminata.     

VEGF基因RNA干扰质粒的构建与鉴定

目的构建干扰血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）基因RNA表达的重组质粒。方法设计3组针对VEGF基因的核糖核酸干扰（RNA interference,RNAi）序列,应用基因重组技术克隆入载体pcDNA3.1中,重组质粒分别命名为pcDNA3.1-VEGF-LH1、pcDNA3.1-VEGF-LH2和pcDNA3.1-VEGF-LH3,用DNA直接测序法和双酶切法鉴定构建的重组质粒。结果 DNA测序证实克隆入载体pcDNA3.1（-）中的序列正确,双酶切证实RNA干扰序列正确插入载体pcDNA3.1（-）。结论成功构建针对VEGF基因的RNAi质粒,为进一步研究该RNAi质粒在脉络膜新生血管形成中的作用奠定了基础。     

结核分枝杆菌Ag85B-Ag85A双抗原融合真核表达质粒的构建及表达

目的：构建结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B-Ag85A融合基因及其双价抗原真核表达载体．方法：采用gene SOE-ing法将Ag85B和Ag85A编码基因用疏水甘氨酸接头(Gly4Ser)3行PCR扩增融合，经限制性内切酶消化后克隆入pcDNA3．1( )中构建真核表达质粒pCDAg85B-A，酶切、DNA测序鉴定，用脂质体法将pCDAg85B-A转染COS-7细胞，采用RT-PCR，ELISA方法检测其表达．结果：Ag85B-Ag85A融合基因定向克隆人pcDNA3．1( )，双向测序表明碱基无突变，Ag85B-Ag85A融合基因在真核细胞中能表达．结论：成功构建结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B-Ag85A融合基因及其双价抗原真核表达载体，为结核病基因疫苗的研究奠定基础．     

插入CpG序列和IL—2基因的HBV重组真核表达载体的构建

目的：构建插入CpG序列和IL-2基因的HBV重组真核表达载体。方法：采用PCR产物直接克隆方法,构建了编码HBsAg基因的真核细胞表达载体pcDNA3.1^ -HBsAg;并以此为基础通过重组DNA技术分别构建了在不同位置含不同数目的CpG序列的重组质粒pcDNA3.1^ -S/CpG1、pcDNA3.1^ -S/CpG2、pcDNA3.1^ -S/CpG1 CpG2及IL-2和HBsAg融合基因的表达载体pcDNA3.1^ -S/IL-2。通过脂质体基因转移技术导入Cos-7细胞中检测其瞬间表达。结果：通过酶切、PCR及测序证实已分别正确完整地插入IL-2基因和CpG序列,体外转染Cos-7细胞后可见基因的表达和分泌,结论：本实验成功构建了我们所设计的5种重组质粒,拟为今后探索优化基因疫苗的设计及HBV治疗性疫苗的研究奠定基础。     

日本血吸虫Rho GTPase DNA疫苗及亚单位疫苗的构建和分析

目的 构建日本血吸虫大陆株Sj-Rho GTPase-like真核及原核表达重组质粒，并进行鉴定分析。方法 用PCR法将Sj-Rho GTPase-like基因从已剪切阳性克隆中扩增出来，亚克隆至pcDNA3.1和pGEX-5X-3中，分别经PCR、双酶切、测序、SDS-PAGE和Western blot等方法鉴定。结果 PCR和测序均证明Sj-Rho GTPase-like基因疫苗构建成功，重组蛋白经SDS-PAGE电泳可观察到与预期分子量相应的条带，转印后可被水牛感染血清识别。结论 成功构建了Sj-Rho GTPase-like基因的两种重组载体，为保护性免疫研究打下基础。     

结核分枝杆菌免疫优势抗原ESAT-6真核表达载体的构建及蛋白表达的鉴定

目的　克隆并表达结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶ESAT 6的编码基因 ,为研究其免疫功能奠定基础。方法　以结核分枝杆菌H37Rv株基因组为模板 ,用PCR对ESAT 6基因进行扩增 ,扩增产物克隆到真核表达载体pcDNA3 1/Zeo( )中。对重组表达载体pcDNA ESAT 6进行酶切、PCR及测序鉴定。经鉴定无误的重组质粒用DEAE 葡聚糖法转染COS 7细胞 4 8h后 ,用Trizol法提取转染细胞总RNA进行RT PCR鉴定。结果　重组质粒pcDNA ESAT 6构建成功 ,并能在COS 7细胞中有效表达。结论　结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶ESAT 6真核重组表达质粒pcDNA ESAT 6构建成功 ,为进一步研究ESAT 6和CFP 10的免疫原性、免疫保护性及其二者之间的相互作用奠定了基础