重组人内抑素单克隆抗体的制备及初步鉴定

目的制备抗重组人内抑素(ES)单克隆抗体(McAb)并进行鉴定。方法利用重组人ES为抗原,免疫Balb/c小鼠,应用杂交瘤技术将免疫小鼠的脾细胞与同源小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)进行融合,间接ELISA法对细胞培养上清进行筛检,对能稳定分泌抗重组人ES的细胞株,进行扩大培养。体内诱生法制备腹水并对其初步鉴定。结果获得3B4、1D10、1G5、2D10,4株能稳定分泌抗重组人ESMcAb的杂交瘤细胞株,并对3B4和1D10两株给予鉴定,其免疫亚型为IgG2a、IgG3。腹水ELISA效价为10-6、10-5。通过蛋白免疫印迹法和免疫组化证明抗体有特异性和敏感性。结论成功制备分泌抗重组人ES的杂交瘤细胞株,为研究人ES的表达及相关领域奠定了基础。     

人Ⅰ型丙氨酸氨基转移酶单克隆抗体的制备及鉴定

目的 通过构建人Ⅰ型丙氨酸氨基转移酶(ALT1)的原核表达载体,并用纯化的ALT1重组蛋白免疫BALB/c小鼠,制备有生物活性的单克隆抗体.方法 用GST-ALT1融合蛋白作为免疫原,通过杂交瘤技术制备抗ALT1的单克隆抗体,用间接ELISA、Dot-Elisa、Western blot等方法对抗体的抗原结合特性进行鉴定.结果 获得1株能稳定分泌抗ALT1单克隆抗体的细胞株8A9,亚类鉴定这种单抗为IgG2.间接ELISA法测定细胞株腹水抗体的效价为10×10~5.Dot-ELISA、Western blot显示ALT1单克隆抗体能特异性地识别免疫原.结论 成功制备ALT1单克隆抗体.     

抗HBsAg单克隆抗体的制备与生物学特性的鉴定

目的:制备分泌抗HBV S蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并鉴定其特性,为建立快速诊断HBV感染的方法奠定基础.方法:以重组乙肝疫苗免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合建立了能稳定分泌抗HBsAg单抗的杂交瘤细胞株,利用间接ELISA技术和Western blot进行单抗特异性的鉴定,同时采用间接ELISA方法鉴定mAb的Ig亚类,检测mAb的效价及相对亲和力.结果:获得1株可分泌特异性mAb的杂交瘤细胞4D2,其抗体亚类为IgG1型,腹水效价为1:10(6),相对亲和力在10(5)以上.结论:成功地制备出抗HBV S蛋白的单克隆抗体,为建立快速特异检测HBV感染的实验方法提供了有力的工具.     

猪链球菌反应调节因子CovR单克隆抗体的制备与鉴定

目的CovR是一个全局性反应调控因子,对猪链球菌的致病性具有重要调控作用。文中制备抗2型猪链球菌（Streptococcus suis serotype2,S.suis2）反应调节因子CovR蛋白单克隆抗体（mAb）,以便对CovR的调控机制进行系统研究。方法以基因工程重组CovR蛋白为免疫原免疫BALB/c小鼠,采用淋巴细胞杂交瘤技术将免疫后的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,筛选可稳定分泌抗CovR mAb的杂交瘤细胞株。通过间接ELISA法和Western blot鉴定抗CovR mAb的特异性后,制备小鼠腹水并测定单抗腹水的抗体效价。单抗分型ELISA鉴定抗CovR单克隆抗体IgG亚类。结果获得2株能稳定分泌抗CovR mAb的的杂交瘤细胞株1A4和4D7,其培养上清抗体效价分别为1∶800、1∶1600,其相应单抗腹水的抗体效价分别为1∶819200、1∶1638400。mAb 1A4和4D7IgG亚类分别为IgG2b、IgGl。结论成功制备了抗CovR mAb,为进一步研究CovR的调控机制奠定了基础。     

鼠抗早孕因子单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备鼠抗早孕因子（EPF）单克隆抗体,纯化并进行鉴定。方法用重组EPF免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术获得抗EPF杂交瘤细胞株,注入BALB/c小鼠腹腔制备腹水型单抗,Protein-G亲和层析纯化后,SDS-PAGE电泳鉴定其纯度,用间接ELISA法测抗体效价,ELISA相加试验测定抗原表位,用Western blotting鉴定其特异性,并进行类及亚类、细胞染色体核型分析。结果筛选出2株具有较高活性和良好稳定性的分泌抗EPF单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其腹水的抗体效价均高于2×10^-5,2株单抗均为IgG类IgG1亚类,轻链类型均为κ,细胞核型分析符合杂交瘤细胞特征,特异性良好,2株单抗有不同的抗原表位。SDS-PAGE电泳显示纯化后抗体有较高的纯度,Western blotting表明其与EPF抗原有特异结合性。结论成功制备2株具有较高活性的鼠抗EPF单克隆抗体,为建立检测EPF方法奠定了良好的基础。     

抗恶性疟原虫EBA-175单克隆抗体的制备与初步鉴定

目的制备抗恶性疟原虫EBA—175的单克隆抗体（McAb），为恶性疟原虫的诊断及疫苗研究奠定基础。方法以恶性疟原虫EBA-175（Ⅱ区F2段）重组抗原免疫BALB／c小鼠，采用杂交瘤技术制备McAb，间接ELISA筛选分泌高滴度McAb的杂交瘤细胞株．测定其免疫球蛋白亚类及其效价，ELISA、Western blot试验分析其特异性。结果筛选获得6株稳定分泌抗重组EBA-175McAb的杂交瘤细胞株1F3、2E8、2H5、4Al、4C3、4H9，6株McAb经鉴定其亚类5株为IgG1，1株为IgG2a，6株McAb的培养上清ELISA效价为1：256～1：512，腹水效价为1：12800-1：25600，间接ELISA显示其中4株McAb 1F3、2H5、4A1、4H9能与恶性疟原虫抗原发生特异性结合，而只有1F3、4A1、4H9在Western blot试验中识别恶性疟原虫Mr约35000的虫源蛋白。结论获得了能稳定分泌高特异性抗EBA175McAb的杂交瘤细胞。     

ATP5B原核表达和单克隆抗体的制备及其鉴定

目的：制备高纯度ATP合酶β亚基（ATP5B）单克隆抗体并进行鉴定,为其后续研究奠定基础。方法：应用PCR法扩增ATP5B基因,克隆入pET28a载体中并转入大肠杆菌BL21（DE3）。异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导蛋白表达并用镍亲和层析柱纯化融合蛋白,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测蛋白纯度。用纯化的融合蛋白免疫3只雌性Balb/C小鼠,取小鼠尾静脉血,间接酶联免疫吸附法（ELISA法）检测血清中ATP5B抗体效价。取血清效价最高的免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤SP2/0细胞混合培养建立杂交瘤细胞,采用间接ELISA法筛选融合细胞并行单克隆化培养,对阳性细胞进行核型分析。取12周龄Balb/C小鼠,腹腔注射杂交瘤细胞制备腹水模型,收集腹水,间接ELISA法检测效价,SDS-PAGE检测抗体纯度,应用ELISA法检测抗体亚型。结果：PCR扩增后得到1 455bp的特异性条带,连接pET28a空载体获得重组pET28a/ATP5B载体。IPTG诱导转化的菌液表达目的蛋白,SDS-PAGE检测,在相对分子质量为51 000处出现明显的诱导蛋白条带。间接ELISA法检测免疫小鼠静脉血,血清效价最高达1：64 000。杂交瘤细胞染色体核型分析,染色体总数约为骨髓瘤细胞与正常小鼠脾细胞之和。采用杂交瘤细胞株制备小鼠腹水,抗体最高效价为1：240 000,杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的亚型为IgG1。结论：通过克隆、表达和纯化重组蛋白,成功制备出抗ATP5B蛋白单克隆抗体。     

抗粉尘螨主要变应原Der f1单克隆抗体的制备与鉴定

目的制备和鉴定鼠抗粉尘螨主要变应原Derf1的单克隆抗体（monoclonal antibody,McAb）。方法利用重组Derf1蛋白为免疫原,免疫BALB／c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤NS-1细胞融合。通过间接ELISA法筛选特异性分泌的杂交瘤细胞。用杂交瘤细胞株诱生小鼠腹水,应用蛋白A亲和层析法进行抗体纯化。采用Ig类与亚类鉴定试剂盒鉴定该单克隆抗体的Ig亚型;通过间接ELISA、Western Blotting鉴定该单克隆抗体的特性和交叉性。结果获得6株可稳定分泌鼠抗粉尘螨主要变应原Derf1的单克隆抗体,其Ig亚型均为IgG1,且6株单抗均具有良好的效价。ELISA和Western—blotting分析表明,该6株单抗均能识别重组Derf1蛋白和天然的粉尘螨提取物。其中,除了484不识别屋尘螨提取物,其他均能识别。结论成功制备了6株鼠抗粉尘螨主要变应原Derf1的单克隆抗体,为建立粉尘螨主要变应原Derf1检测及纯化方法奠定了基础。     

抗氯霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备及筛选

目的获得稳定、高效分泌抗氯霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株。方法以CAP-HS-BSA免疫BALB/c小鼠,用细胞融合技术筛选抗氯霉素单克隆抗体杂交瘤细胞,体内诱生腹水法大量制备单抗。捕获ELISA法测定小鼠免疫球蛋白亚型,间接ELISA法测定腹水效价;用两步硫酸铵法和G蛋白亲和层析法来纯化腹水。结果成功建立了一株分泌抗CAP单克隆抗体（McAb）的杂交瘤细胞4D10。经检测,其分泌的抗体亚类为IgG1,杂交瘤染色体数目90-110条,间接ELISA检测诱生小鼠腹水的抗体效价达1∶2.56×105,纯度达95%,该细胞连续培养生物学性状稳定。结论成功制备的抗氯霉素单克隆抗体4D10效价高、纯度高,为利用该单抗研制检测氯霉素残留试剂盒提供原材料。     

抗人肺表面活性物质相关蛋白A单克隆抗体的制备及其特性的鉴定

目的制备抗人肺表面活性物质相关蛋白A(SP-A)单克隆抗体并对其特性进行鉴定。方法以自行制备的SP-A蛋白作为抗原免疫Balb/c小鼠,建立分泌抗人SP-A单抗的杂交瘤细胞株,诱发小鼠产生单抗腹水,用(NH4)2SO4盐析纯化腹水,用间接ELISA法测定单抗效价,用Western blotting测定抗体特异性。结果建立了3株能持续分泌抗SP-A单抗的杂交瘤细胞株,其中2B6杂交瘤细胞株抗体效价最高,其染色体数目均大于100条。间接ELISA法测定腹水和细胞培养上清效价,分别为1∶50 000和1∶10 000。用Western blotting在SP-A蛋白泳道上相对分子质量31 000左右位置出现明显的一条染色条带。结论自行制备的抗人SP-A单抗,其具有特异性强、效价高的特点。