胶质瘤U251细胞及其干细胞抗凋亡与多重耐药基因的关系

目的利用培养成功的U251胶质瘤干细胞,探讨其抗凋亡和耐药基因的表达差异。方法WST-8法检测胶质瘤干细胞增殖活性,实时荧光定量RT-PCR技术检测Livin、Livinα、Livinβ、Survivin和MRP1、MRP3 mRNA的表达。结果单层培养的U251细胞比胶质瘤干细胞表现出更强的增殖活性;U251胶质瘤干细胞Livin、Livinα、Livinβ、Survivin和MRP-1 mRNA表达量较U251单层培养细胞表达量都有不同程度的升高,而MRP-3 mRNA表达量降低。结论U251胶质瘤干细胞抗凋亡和MRP-1 mRNA表达量较U251单层培养细胞表达量有不同程度的升高,提示胶质瘤干细胞比较其同源的肿瘤细胞具有更强的耐药性,这可能是肿瘤耐药的机制。     

TJ905胶质瘤细胞系中脑肿瘤干细胞的培养、分离与鉴定

目的培养恶性胶质瘤TJ905细胞,并从中分离、培养和鉴定肿瘤干细胞,观察干细胞生长特征,为脑肿瘤干细胞的进一步研究奠定基础。方法将TJ905细胞置于含血清培养基中培养;将TJ905细胞置于含生长因子的无血清培养基中培养,待其形成悬浮生长的细胞球后用免疫磁珠分离获取CD133+细胞。用细胞免疫荧光染色对肿瘤干细胞及其分化细胞进行鉴定。结果在恶性胶质瘤细胞系TJ905中成功分离出肿瘤干细胞,培养于无血清培养液中,细胞呈球形、悬浮生长,具有很强的繁殖与自我更新能力;将该细胞置于含血清的培基中可分化;免疫荧光染色显示脑肿瘤干细胞中神经上皮干细胞蛋白(Nestin)表达阳性。结论培养的恶性胶质瘤细胞系TJ905中有脑肿瘤干细胞的存在,并且能在体外将其培养、分离及诱导分化,可为肿瘤干细胞的研究提供便利条件。     

神经干细胞的培养观察及鉴定

目的：建立一个稳定的神经干细胞系．方法：从孕12～16d小鼠胚胎脑内分离纹状体，吹打消化为单细胞悬液，于DMEM／F12(1：1)培养基(含有bFGF，EGF和N2添加剂)中培养．通过MTT法检测细胞活性，并绘制生长曲线．采用免疫荧光法观察神经干细胞nestin的表达情况和其分化的子代细胞NSE及GFAP等的表达情况．结果：原代分离培养4～6d后，培养基内可见神经克隆球，分散克隆球所获的单细胞继续培养可以重新生成克隆球．新生克降球细胞呈nestin阳性，传代入含血清的培养基后可以分化为NSE和GFAP阳性细胞．结论：所获新生克隆球细胞是神经干细胞．     

大鼠骨髓源神经干细胞的分离培养及鉴定

目的:对Wistar大鼠骨髓源神经干细胞进行分离、培养和鉴定,观察其生长方式和分化特征。方法:运用无血清培养基对Wistar大鼠骨髓基质细胞进行培养,对分离获得的悬浮生长的神经球采用免疫组织化学法检测CD133和Nestin表达情况。用血清诱导其分化,分化7 d后,采用免疫荧光细胞化学染色方法检测分化后GFAP、Map2、β-tubulinⅢ、Galc的表达情况。结果:大鼠骨髓基质细胞在无血清培养基中,呈悬浮状态生长,形成细胞球,经免疫荧光检测,细胞球呈CD133和Nestin阳性。将细胞球转入含血清培养基后,转为贴壁生长,经免疫荧光检测大部分已分化细胞呈GFAP阳性,少部分细胞呈MAP-2、β-tubulinⅢ及Galc阳性。结论:采用含bFGF、EGF的无血清培养基可培养出呈球状聚集生长、具多向分化潜能的大鼠骨髓源神经干细胞。     

胶质瘤C6肿瘤干细胞蛋白质组学初步分析

目的: 运用蛋白质组学的方法,对C6脑肿瘤干细胞(BTSC)和非BTSC细胞进行配对研究,建立差异性蛋白文库,为探讨胶质瘤病因提供初步线索.方法: 在C6细胞中,参照神经干细胞(NSC)培养条件进行培养.出现典型的神经球后,利用免疫荧光染色检测细胞标记,包括nestin,神经元特异性烯醇化酶(NSE),神经胶质细胞纤维酸性蛋白(GFAP)等,以及诱导分化等方法,鉴定神经球细胞是否为BTSC.收集神经球和非神经球细胞,进行配对,利用双向凝胶电泳(2D-PAGE)检测细胞总体蛋白,分析差异性蛋白点.结果: C6细胞在NSC培养条件下,出现比较典型的神经球.神经球细胞nestin阳性,NSE和GFAP阴性.经诱导发生分化,分化后细胞形态与C6相似,能够表达NSE和GFAP等多种表型细胞标记,证实这种神经球细胞为肿瘤干细胞.在2D-PAGE结果中,C6肿瘤干细胞和非干细胞配对比较,有统计学差异(P＜0.05)的蛋白点共有84个,大于2倍差异蛋白点有50个,大于3倍的有17个,大于4倍的有6个,最大差异倍数为11.607 2.在BTSC中,有55个差异蛋白表达增多(上调),29个蛋白表达下降(下调).结论: 胶质瘤C6细胞系中存在肿瘤干细胞,在蛋白质组学方面与非BTSC细胞有明显差异.     

MRP-1、MDR1、GST-π mRNA在CD133~+肿瘤干细胞中的表达分析

目的分离鉴定CD133~+肿瘤干细胞,初步分析MRP-1、MDR1、GST-π在CD133~+胶质瘤干细胞多药耐药性中的作用。方法采用胶质瘤U+251细胞系、磁珠分离,培养CD133~+胶质瘤干细胞,RT-PCR技术分析MRP-1、MDR1、GST-π在CD133~+胶质瘤干细胞中的表达。结果培养的胶质母细胞瘤干细胞表达干细胞标记物Nestin,分化后细胞表达GFAP、β-tubulin;MRP-1、MDR1、GST-π在CD133~+胶质瘤干细胞中呈高表达,与CD133-胶质瘤干细胞比较差异有统计学意义(P0.05)。结论培养、鉴定胶质母细胞瘤肿瘤干细胞、MRP-1、M DR1、GST-π在CD133~+胶质瘤干细胞中呈高表达,为下一步研究奠定基础。     

成年小鼠脑室下区神经干细胞培养与鉴定体系的建立

目的 建立系统的成年小鼠脑室下区神经干细胞分离、培养及鉴定体系.方法 用无血清方法分离培养成年小鼠脑室下区来源的神经干细胞;用克隆培养、BrdU整合的方法检验培养细胞的干细胞特性;用免疫荧光细胞化学方法检测Brdu、神经干细胞标记物nestin和SOX2,分化的细胞标记物Tuj1、GFAP、NG2.用Western boltting和RT-PCR方法进一步检测神经干细胞标记物nestin和SOX2的表达.结果 从成年小鼠脑室下区分离培养出具有自我更新、增殖的神经球,构成神经球的细胞nestin和SOX2呈阳性,它们分化后产生Tujl阳性的神经元、GFAP阳性的星型胶质细胞、NG2阳性的少突胶质细胞.结论 建立了简单、稳定的培养成年小鼠脑室下区神经干细胞方法.     

益气活血化痰中药复方对大鼠胚胎神经干细胞生长分化增殖的影响机制研究?

目的研究益气活血化痰药物血清对体外培养的大鼠胚胎神经干细胞(NSC)生长分化增殖的影响。方法细胞分为空白血清组、含药血清组、阻滞剂组、含药血清+阻滞剂组和培养基对照组5组。采用细胞培养、血清药理学、免疫荧光等技术,观察中药复方血清对大鼠NSC生长分化的影响;相差显微镜进行形态学观察;免疫荧光染色技术,检测各组细胞nestin、神经元特异性烯醇化酶(NES)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达,观察神经干细胞的分化。结果益气活血化痰中药对神经干细胞无毒性,并能够促进神经干细胞生长分化。nestin蛋白在诱导分化24 h内表达最强,诱导72 h后nestin表达明显减弱直至消失。益气活血化痰中药组NES和GFAP阳性细胞数明显增加。结论益气活血化痰药物血清有促进NSC生长分化增殖的作用。     

成年大鼠骨骼肌肌源性干细胞向神经细胞的分化

目的 研究成体骨骼肌肌源性干细胞(MDSCs)向神经细胞分化的潜能.方法 从成年 SD 大鼠骨骼肌组织中培养出肌源性干细胞,采用 bFGF、EGF 诱导出神经球样细胞团,并检测 nestin 表达.再在贴壁培养条件下,用 RA、BDGF 诱导分化,并检测 NSE、GFAP 的表达.结果 MDSCs 能被诱导出神经球样细胞团,并表达 nestin.这些细胞进一步诱导,部分细胞表现出神经元样或胶质细胞样形态,并表达 NSE 或 GFAP.结论 MDSCs 能向神经细胞样细胞分化,有望用于神经系统疾病的治疗.     

体外培养海马神经干细胞的分化及超微结构观察

目的：研究胎鼠海马神经干细胞（NPCs）体外培养方法、了解其分化及超微结构特点．方法：分离胎鼠海马NPCs,应用机械分离法将海马组织制成单细胞悬液,用含有bFGF和EGF的无血清培养基培养,传代后用含血清培养基促分化,免疫细胞化学方法对NPCs及其分化后的子代神经细胞进行鉴定,并在电镜下观察分化后细胞的形态结构特征．结果：海马NPCs在无血清培养基中悬浮成球,贴壁后,细胞逐渐从细胞球向周围迁移分化．体外培养胎鼠海马NPCs表达巢蛋白（nestin）,在体外可诱导分化产生分别表达Tuj-1和GFAP的神经细胞．电镜观察到分化后的神经细胞及突起相互间排列、具有各种细胞器结构,可见细胞间紧密连接,完整的突触结构．结论：采用无血清培养基中加入特定生长因子的培养技术,可培养出在体外稳定增殖并有多向分化潜能的大鼠胚胎NPCs．     

胶质瘤U251细胞中CD133表达及干细胞特性分析

目的： 探讨CD133⁺细胞的生物学特性,分析CD133作为胶质瘤干细胞标记的可行性。方法： 利用免疫荧光染色检测U251细胞中CD133、巢蛋白（nestin）、神经元特异性烯醇化酶( NSE )、神经胶质细胞纤维酸性蛋白(GFAP)等蛋白表达,分析CD133⁺细胞与CD133^－细胞中巢蛋白、NSE、GFAP阳性细胞存在的差异。结果： U251中CD133⁺细胞比例为0.060±0.003,在CD133⁺细胞中,巢蛋白阳性细胞,NSE和GFAP阴性细胞比CD133^－中明显增多;在CD133^－细胞中,也存在巢蛋白阳性细胞,数目较CD133⁺中明显减少,相反巢蛋白阴性细胞,NSE和GFAP阳性细胞明显增多。结论： 胶质瘤U251细胞存在CD133⁺细胞,在CD133阳性和阴性细胞中,均存在干细胞样细胞,但是在CD133⁺细胞中此类细胞更多。     

Glioblastoma stem cells resistant to temozolomide-induced autophagy

Background Recent studies have demonstrated the existence of a small fraction of cells with features of primitive neural progenitor cells and tumor-initiating function in brain tumors. These cells might represent primary therapeutic target for complete eradication of the tumors. This study aimed to determine the resistant phenotype of glioblastoma stem cells （GSCs） to temozolomide （TMZ） and to explore the possible molecular mechanisms underlying TMZ resistance. Methods Freshly resected glioblastoma specimen was collected and magnetic isolation of GSCs was carried out using the Miltenyi Biotec CD133 Cell Isolation kit. The cytotoxic effect of TMZ on CD133^＋ and CD133^- glioblastoma cells was determined by using the 3-（4,5-dimethylthiazol-2-yl）-2,5-diphenyltetrazolium bromide （MTT） assay. Autophagy-related proteins （Beclin-1, LC3 and Atg5） and cleaved caspase-3 （p17） were analyzed by Western blotting. Immunofluorescent staining was used to detect Atg5, glial fibrillary acidic protein （GFAP） and CD133 expression in glioblastoma cells. Statistical analysis was carried out using SPSS 10.0 software. For all tests, the level of statistical significance was set at P 〈0.05. Results CD133^＋ glioblastoma ceils exhibited neurosphere-like growth in vitro and high expression of CD133 stem cell marker. The growth-inhibiting rate in CD133- glioblastoma cells treated with 5 or 50 pmol/L TMZ was significantly higher than that in CD133^＋ glioblastoma cells （（14.36±3.75）% vs （2.54±1.36）% or （25.95±5.25）% vs （2.72±1.84）%, respectively, P 〈0.05）. Atg5, LC3-11 and Beclin-1 levels were significantly lower in CD133^＋ glioblastoma cells than those in autologous CD133^- cells after TMZ treatment （P 〈0.05）. Caspase-3 was mildly activated only in CD133^- glioblastoma cells after exposure to TMZ （P 〈0.05）. Immunofluorescent staining revealed elevated expression of Atg5 in GFAP^＋ cells following TMZ treatment. Conclusions The GSCs display strong capability of tumor＇s resistance to TMZ. This resistance is probably contributed by the CD133^＋ cells with down-regulation of autophagy-related proteins. Future treatment should target this small population of cancer stem cells in tumors to improve survival of patients.     

CD133+ 胶质瘤干细胞化疗耐受机制分析

目的:探讨ABC超家族转运体蛋白在CD133 胶质瘤干细胞多药耐药性中的作用机制.方法:选取30例人脑胶质瘤标本,利用免疫磁珠法分选标本中的CD133 胶质瘤干细胞(悬浮细胞)和CD133-肿瘤细胞(黏附细胞),并进行分选细胞的体外扩增培养、传代与鉴定,应用免疫组化和RT-PCR法分别检测细胞中 MDR1和MRP1的蛋白及其活性表达情况.结果:3例胶质母细胞瘤来源的CD133 细胞能在含血清培养基中形成肿瘤干细胞球,并进行1～3次传代;MDR1与MRP1耐药蛋白在CD133 细胞中高度表达,阳性细胞比例范围分别为18%～67%和23%～73%;MDR1与MRP1在CD133 细胞中的表达活性分别为在CD133-细胞中的16.1倍和19.6倍;多药耐药蛋白的阳性细胞比例和其表达活性与肿瘤的恶性程度呈正相关,而表达阳性率与肿瘤的病理级别无关;MDR1与MRP1在CD133 细胞中的表达有明显的相关性.结论:神经上皮肿瘤中仅有小部分细胞亚型(CD133 胶质瘤干细胞)具有内在耐药性(天然耐药性),而ABC超家族转运体蛋白MDR1与MRP1在CD133 胶质瘤干细胞中的共同过度表达是胶质瘤多药耐药的主要原因之一;CD133 细胞是胶质瘤化疗的关键性治疗标靶.     

脑肿瘤干细胞体外分化的形态、标志物及细胞增殖动力学特征

目的探讨脑肿瘤干细胞(BTSC)在体外分化过程中的细胞形态、分化相关标志物表达和增殖动力学变化,为进一步研究BTSC分化走向提供实验依据。方法取同一病例初发和复发的间变性室管膜瘤患者的肿瘤手术标本,用CD133免疫磁珠分离出CD133+细胞,加血清分化,相差显微镜下观察其形态,在未分化和分化后第3、7、10、21天收集细胞,流式细胞术检测细胞CD133+、神经上皮干细胞蛋白(Nestin)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、β-微管蛋白(Tubulinβ-)Ⅲ的表达。在未分化和分化第7天做增殖周期测定。取正常神经干细胞(NSC)作为对照。结果(1)形态:BTSC由圆形到短梭形和多角形、再到长梭形及少量星形,第7天以后细胞形态往短梭形和圆形回复,出现细胞聚集成球重新飘浮在培养基中;NSC按固有规律分化。(2)标志物:BTSC和NSC未分化时CD133+和Nestin均高表达,BTSC分化后CD133+和Nestin全程表达,且先降后升,第7天表达率分别为(3·65±0·17)%和(28·99±1·26)%,第21天分别为(14·63±1·16)%和(45·46±1·27)%;GFAP和β-TubulinⅢ表达量一直偏低,但GFAP阳性表达率相对高于β-TubulinⅢ;NSC在分化第10天时失去了CD133+和Nestin的表达,GFAP和β-TubulinⅢ表达量明显增加,分别为(88·94±1·23)%和(11·94±0·36)%。(3)增殖周期及倍体:BTSC分化前为亚二倍体,分化后有少量二倍体和大量亚二倍体及超二倍体,处于G2-M期和S期的细胞比例大于NSC,复发BTSC分化后细胞组成比原发BTSC复杂;神经干细胞分化前后都为整二倍体,主要处于G0-G1期。结论细胞形态、标志物的表达、增殖周期及倍体变化反映出脑肿瘤干细胞分化走向和神经干细胞不同,前者存在明显的分化障碍。     

人卵巢肿瘤细胞系3AO中肿瘤干细胞的分离鉴定

目的利用CD133抗体偶联的免疫磁珠分选法从人卵巢肿瘤3AO细胞系中分离CD133+细胞,并且通过检测其抗凋亡能力和耐药性进一步鉴定其特征。方法通过免疫磁珠分选方法分离人卵巢肿瘤细胞系中CD133+肿瘤干细胞,流式细胞仪检测肿瘤干细胞自我更新能力和抗凋亡能力,裸鼠移植实验反映成瘤性,MTT法检测其耐药性。结果通过免疫磁珠手段可成功分离得到CD133+卵巢肿瘤肿瘤干细胞,细胞增殖活力好,自我更新能力强,随着培养时间的延长可产生大量的CD133-细胞。裸鼠移植成瘤实验表明CD133+细胞成瘤率是10/10,成瘤平均时间是(58±6)d;而CD133-成瘤率是4/10,平均成瘤时间是(145±8)d,CD133+细胞成瘤能力明显强于CD133-细胞。MTT检测结果表明CD133+细胞的IC50值为CD133-细胞的2.5倍左右,提示对顺铂药物不敏感。对使用顺铂的细胞进行吖啶橙染色后发现,大量CD133-细胞呈现细胞凋亡状态,而CD133+细胞形态基本正常。进一步的AnnexinⅤ-FITC和PI双染结果表明,药物处理后的CD133+细胞比CD133-细胞具有更强的抗凋亡能力。结论免疫磁珠分选得到的CD133+细胞具有自我更新、增殖和分化为CD133-细胞等肿瘤干细胞的特征。CD133+细胞比CD133-细胞具有较强的成瘤能力、耐药性及抗凋亡能力。     

热休克蛋白B1在U251细胞株及其干细胞中的差异性表达对肿瘤细胞凋亡的影响

目的探讨热休克蛋白B1(heat shock protein B1,HSPB1)在U251细胞株及其干细胞中差异性表达对肿瘤细胞凋亡的影响。方法采用无血清培养基培养U251细胞,获得U251干细胞;应用细胞免疫荧光染色法检测CD133和nestin鉴定胶质瘤干细胞;应用iTRAQ技术对U251细胞株及其干细胞进行HSPs差异性分析;应用MTT法、Western blot和RT-PCR观察经卡莫司汀干预后,肿瘤细胞凋亡与HSPB1蛋白、基因表达变化的关系。结果在未经卡莫司汀干预的胶质瘤与胶质瘤干细胞的HSPB1的蛋白比值为0.523;经卡莫司汀干预U251及其干细胞后,HSPB1蛋白含量分别升高了1.4、3.3倍,HSPB1 mRNA分别升高1.5、3.6倍,经相同浓度的卡莫司汀干预后的U251细胞生长受到抑制,而U251干细胞无明显抑制。结论 HSPB1参与U251胶质瘤干细胞化疗抵抗过程,对肿瘤细胞增殖、凋亡起着重要的调控作用。     

外源P16基因对人类恶性脑胶质瘤细胞系活性的影响

①目的探讨5型腺病毒载体（Ad5）携带P16基因对恶性脑胶质瘤细胞系T／905生长状态的影响。②方法免疲组织化学法测定P16蛋白表达；甲基噻唑基四唑法测定恶性脑腱质瘤细胞系生长状态及感染病毒细胞克隆形成数的测定。③结果重组体腺病毒能介导P16外源基因在恶性脑肢质瘤细胞系TJ905细胞中阳性表达，6天时肿瘤经胞生长抑制率为98％，并且能显著地抑制肿瘤细胞的克隆形成能力。④结论腺病毒介导P16基因能在肿瘤细胞中表达，并能明显抑制肿瘤细胞生长的状态。     

Chemoresistance of CD133+ cancer stem cells in laryngeal carcinoma

Background  Mounting evidence suggests that tumors are histologically heterogeneous and are maintained by a small population of tumor cells termed cancer stem cells. CD133 has been identified as a candidate marker of cancer stem cells in laryngeal carcinoma. This study aimed to analyze the chemoresistance of CD133⁺ cancer stem cells.

Methods  The response of Hep-2 cells to different chemotherapeutic agents was investigated and the expression of CD133 was studied. Fluorescence-activated cell sorting analysis was used to identify CD133, and the CD133⁺ subset of cells was separated and analyzed in colony formation assays, cell invasion assays, chemotherapy resistance studies, and analyzed for the expression of the drug resistance gene ABCG2.

Results  About 1%–2% of Hep-2 cells were CD133⁺ cells, and the CD133⁺ proportion was enriched by chemotherapy. CD133⁺ cancer stem cells exhibited higher potential for clonogenicity and invasion, and were more resistant to chemotherapy. This resistance was correlated with higher expression of ABCG2.

Conclusions  This study suggested that CD133⁺ cancer stem cells are more resistant to chemotherapy. The expression of ABCG2 could be partially responsible for this. Targeting this small population of CD133⁺ cancer stem cells could be a strategy to develop more effective treatments for laryngeal carcinoma.

     

人脑胶质母细胞瘤肿瘤干细胞的分离鉴定研究

目的 从人脑胶质母细胞瘤中分离出肿瘤干细胞.体外培养并鉴定其生物学特性.方法 获取5例人脑胶质母细胞瘤肿瘤细胞,通过无血清培养基和悬浮培养法,观察肿瘤干细胞克隆球的形成.利用免疫荧光技术检测原代肿瘤细胞和克隆球细胞中CD133阳性细胞的比例,分析克隆球细胞的抗原表达和多向分化能力.观察肿瘤干细胞子代分化细胞在无血清培养基中的逆向分化现象.结果 成功获取人脑胶质母细胞瘤肿瘤细胞,研究发现部分细胞具有克隆形成能力,在无血清培养基中呈悬浮球状生长,并可稳定增殖、传代.免疫荧光检测显示原代肿瘤细胞及克隆球细胞中均有CD133阳性细胞.克隆球细胞在含血清培养基中具有多向分化能力,其分化的子代细胞在无血清培养基中可逆向分化.结论 培养获得人脑胶质母细胞瘤肿瘤干细胞,证实其在体外具有自我更新、无限增殖、多向分化和逆向分化的生物学特性,为下一步研究奠定基础.