流式细胞术检测骨髓微量神经母细胞瘤细胞在临床中的应用

【摘要】目的 阐明神经母细胞瘤（NB）患儿骨髓微量肿瘤病灶(minimal residual disease MRD)的检测方法及其结果对预后的影响。方法 应用CD45-FITC/CD81-PE/CD56-PECy5单抗组合通过流式细胞术(FCM)检测了人NB细胞株TGW的免疫表型并确定本实验室FCM的敏感度；比较BM细胞形态学检查与FCM检测骨髓中的CD45-/ CD81+/ CD56+细胞，分析病程中MRD检测与预后的关系。结果 ⑴ TGW细胞株表达CD56和CD81，不表达CD45，本实验室FCM敏感度为1/104。⑵61例患者共144份标本中细胞形态学提示BM转移者23份;FCM显示表达CD45-/ CD81+/ CD56+细胞的标本数62份，BM细胞形态学检测方法和FCM阳性检出率的比较有显著性差异，（P﹤0.01 X2检验）。⑶比较平均化疗4个疗程后MRD结果与预后关系：31例患儿初诊时BM MRD检测阳性，化疗4个疗程后11例患儿MRD转阴，随访至今无复发及进展，DFS中位时间23mos；另外20例化疗4个疗程后仍为阳性，其中11例复发或进展，包括1例死亡，两组比较有显著性差异（P﹤0.01）。⑷化疗后移植患儿PBSC采集前骨髓MRD结果与预后的相关性：共有19例患儿接受化疗后PBSCT，13例患儿采集时骨髓MRD为阴性，其中2例复发，自移植后始DFS中位时间9mos；6例患儿采集时骨髓MRD为阳性，5例复发，两组比较有显著性差异，（P﹤0.05）。结论 运用FCM检测NB患儿骨髓中的微量肿瘤细胞敏感度高、特异性强，可协助初诊患儿的诊断、评估临床疗效，骨髓中的微量肿瘤细胞残留与神经母细胞瘤预后相关.     

用流式细胞仪对小儿神经母细胞瘤的诊断与监测

目的　建立一种快速而特异的流式细胞仪 (flowcytometer,FCM)分析方法用于神经母细胞瘤 (NB)患儿的诊断与监测。方法　采用多色FCM和抗人神经节苷脂D2 (gangliosideD2 ,GD2 )单抗12 6 4、CD56、CD45组合对 13例 36份NB标本和 2 4例非NB标本进行检测、比较和分析。结果　NB患儿的阳性检出率 (12 / 13例或 92 % )明显高于非NB患儿的阳性检出率 (0 / 2 4 ,P =7 0 2× 10 -9)。外周血标本的阳性检出率 (17/ 2 1份或 81% )与骨髓标本的阳性检出率 (7/ 9份或 78% )差异无显著意义(χ2 =1 0 35 ,P >0 7) ,初诊病例与病理检查的诊断结果符合率达 92 %。2例随访结果表明 ,1例GD2阳性细胞随治疗及病情进展而变化 ,另 1例则确诊后 38d内外周血标本中始终含有NB细胞。结论　多色FCM分析GD2 阳性细胞能简便、快速、特异地检测NB细胞 ,对NB患儿的诊断与微小残留病(minimalresidualdisease ,MRD)的监测具有重要意义     

儿童神经母细胞瘤骨髓微小残留病变的临床意义分析

目的探讨儿童神经母细胞瘤(NB)患者骨髓微量NB细胞的动态变化及其与临床特征、治疗转归的关系。方法纳入33例确诊为NB并完善骨髓微量NB细胞监测的患儿,采用流式细胞仪(FCM)检测NB患儿治疗前后骨髓微量NB细胞,结合临床数据,进行Mann-Whitney U tests及Fisher精确概率法分析。结果 (1)初诊时骨髓转移与INRG分期、MYCN扩增状态、治疗疗效及是否复发均无显著相关性。(2)转移期患儿的骨髓转移发生率为69%,提示骨髓是NB肿瘤细胞主要转移地点。(3)治疗后骨髓微小残留病灶(MRD)持续阳性或由阴转阳患儿复发可能性大(P 0.001)。结论本研究初诊转移期患儿转移发生率过半,提示NB侵袭性强,骨髓为主要转移器官。监测骨髓MRD有助于早期发现疾病复发,指导临床治疗。     

循环肿瘤细胞对神经母细胞瘤转移的诊断价值及疾病进展的预测价值

目的探讨循环肿瘤细胞(CTCs)数目对神经母细胞瘤(NB)转移的诊断价值及疾病进展的预测价值。方法采用CD56免疫磁珠阳性分选和免疫荧光鉴定的方法,检测2015年11月—2017年3月我院收治的25例NB患儿CTCs,其中DAPI~+/GD2~+/CD45~-的细胞被认为是CTCs。结果治疗后发生肿瘤进展的患儿在初诊时NSE水平较高(P=0.010)、CTCs数目较多(P=0.015)、2个疗程化疗后CTCs检出率更高(P=0.028)。在4例骨髓NB细胞免疫表型流式检查阴性的患儿外周血中检测到CTCs,其中3人发生疾病进展并死亡。初诊时CTCs数目≥11个/3mL的患儿中位无进展生存时间较短(19.4个月vs.32.5个月,P=0.007)。结论初诊时NB患儿CTCs数目对于肿瘤转移早期诊断、疾病进展具有预测价值。对于骨髓流式检测阴性的患儿,外周血CTCs动态检测可作为监测NB进展的辅助手段。     

神经母细胞瘤循环肿瘤细胞分离与鉴定方法的建立及临床应用

目的建立一种神经母细胞瘤(NB)循环肿瘤细胞(CTCs)的分离和鉴定方法,初步探讨其测定NB患者CTCs的临床价值。方法应用CD56免疫磁珠阳性分选结合免疫荧光染色方法,对IMR32细胞和20例非血液肿瘤疾病患儿的外周血样本进行处理,通过统计捕获到的DAPI~+/GD2~+/CD45~-细胞数目,计算该方法分离和鉴定NB细胞的敏感性和特异性;检测12例初发晚期NB患儿治疗前及2疗程化疗后外周血中的CTCs数量。结果 10个以内IMR32细胞组,CTCs捕获的敏感性为(80±6.73)%;10～100个IMR32细胞组,CTCs捕获的敏感性为(79.14±3.97)%。20例非血液肿瘤疾病患儿的外周血中均未检测到DAPI~+/GD2~+/CD45~-细胞的存在,提示该方法捕获CTCs的特异性为100%。12例Ⅲ期或Ⅳ期NB患儿,治疗前有9例检测出CTCs,阳性率为75%;化疗2个疗程后,9例患儿CTCs数目均有不同程度减少,该动态变化趋势与患儿血清NSE水平、24h尿VMA水平及骨髓MRD变化相吻合,而影像学评估显示3例为部分反应(PR),6例为混合反应(MR),3例无反应(NR)。结论免疫磁珠阳性分选结合免疫荧光染色的方法对于NB患儿CTCs的捕获具有良好的敏感性和特异性,CTCs数目动态变化比影像学检测可更灵敏地反映疗效,该方法为进一步探讨CTCs在NB儿童疗效评估及复发风险预测中的价值提供了技术手段。     

KAI1/CD82在神经母细胞瘤转移中的表达及意义

目的探讨KAⅠ1／C硝2在神经母细胞瘤转移中的表达及意义。方法选取40例各期神经母细胞瘤、9例节细胞神经瘤蜡块标本，应用免疫组织化学方法检测KAⅠ1基因的蛋白产物CD82的表达水平。结果无转移组中的CD82的阳性率为71．43％．有淋巴结或远处转移的其阳性率为34．74％．节细胞神经瘤中CD82的表达阳性率为22．22％，有或无转移的神经母细胞瘤组之间及无转移的神经母细胞瘤和节细胞神经瘤组之间的差异有统计学意义．神经母细胞瘤中KAⅠ1／CD82的表达水平与是否转移有相关性，与是否进行过化疗无关，与转移为其他器官或骨髓也无相关性。结论KAⅠ1／CD82的表达水平与神经母细胞瘤的转移潜能呈负相关。     

RRS1在神经母细胞瘤组织和细胞中的表达及意义

目的 探究核糖体合成调控因子1(RRS1)在神经母细胞瘤组织和细胞中的表达及意义。方法 使用TARGET数据库分析RRS1在神经母细胞瘤组织中的表达情况,并分析RRS1高表达与神经母细胞瘤病理指标及预后之间的关联,随后使用GEO数据库分析RRS1在神经母细胞瘤细胞系中的表达情况。然后运用慢病毒转染技术过表达或敲低SK-N-AS细胞株中RRS1的表达,采用CCK-8法、平板克隆实验、流式细胞术和Transwell法检测RRS1对肿瘤细胞增殖、凋亡、周期分布和迁移的影响。结果 TARGET和GEO数据库分析结果显示,RRS1基因在59例NB组织中高表达(59/150),且其在NB高风险组中的表达明显高于中、低风险组(P<0.01);此外,RRS1 mRNA在NB细胞系中的表达水平明显高于其在对照细胞中的表达(P<0.01)。临床病理相关性分析结果显示,RRS1mRNA的表达水平与NB患者的年龄、MYCN扩增、INSS分期、COG分期及NB患者的死亡(临床回访)(P<0.05)有关;Kaplan-Meier生存分析显示,RRS1高表达组NB患者的总生存时间(OS)较低表达患...     

神经母细胞瘤骨髓转移细胞体外原代培养技术的实验研究

目的：根据神经母细胞瘤(neuroblastoma，NB)易发生早期骨髓转移的特点，建立NB骨髓转移细胞体外原代培养的实验技术。方法：对27例伴骨髓转移的NB患者进行NB骨髓转移细胞体外原代培养，并与已建立的SMS-KCNR和SH-SY5Y细胞系进行比较，在倒置相差显微镜下观察细胞生长情况及形态学特点，同时应用单克隆抗体F3系列检测原代培养的NB骨髓转移细胞。结果：在27例NB骨髓转移细胞体外原代培养中，培养成功9例，其细胞生长情况及形态学特点与SMS-KCNR和SH-SY5Y细胞系基本一致，单克隆抗体F3系列检测均阳性。结论：NB骨髓转移细胞体外原代培养技术的成功建立为NB体外诱导逆转及多药耐药等复杂机制研究提供更接近体内生物学性状的细胞来源。     

小儿神经母细胞瘤伴发急性髓性白血病1例报告

神经母细胞瘤(neuroblastoma,NB)是小儿常见的恶性肿瘤之一,占所有儿童期恶性肿瘤的8%~[1]。NB一直被认为是转移时间早、转移频度高的肿瘤,而骨髓是最常见转移部位~[2]。NB细胞转移至骨髓时,瘤细胞常集聚成簇,形成团块,而极易与之混淆的白血病细胞浸润骨髓时其排列较为均匀,二者瘤细胞的分布特征即可区分NB骨髓转移与白血病细胞骨髓浸润~[3]。尽管如此,也有将     

免疫组织化学染色法检测神经母细胞瘤骨髓转移的临床意义

目的研究免疫组织化学染色检测神经母细胞瘤骨髓转移的临床意义。方法建立免疫组化检测体系,选择Ⅳ期神经母细胞瘤患儿28例,诊断及诱导结束后分别采集骨髓进行免疫组织化学检测,临床随访生存情况。结果免疫组化检测方法的灵敏度为10-5,诊断时19例患儿骨髓有形态学转移,免疫组化检测所有病例骨髓神经母细胞瘤细胞阳性;诱导治疗后13例骨髓肿瘤细胞在免疫组化水平消失,11例未消失,4例病情进展死亡。随访(3.5±0.7)年,完全缓解组中位无病生存时间(4.1±0.7)年,部分缓解组中位无复发时间(2.8±0.5)年,两组比较差异显著(t=3.9,P=0.001);部分缓解组100%复发,完全缓解组46.1%复发,两组复发率差异有显著性(P=0.006)。两组4年无病生存率29.2%。结论免疫组织化学法检测骨髓神经母细胞瘤较形态学灵敏,具有预后判断作用;诱导治疗清除骨髓转移之神经母细胞瘤者较不清除者预后好。