应用于PCR及实时荧光定量PCR的细菌DNA提取方法

目的建立特异灵敏的适应于PCR及实时荧光定量PCR的细菌DNA提取方法.方法于细菌样本离心所得沉淀中加入提取液(25% Chelex-100,0.5%NP40,TE配制,pH=9.0);56℃孵育30 min;100℃水浴10 min;离心后所得上清即为DNA.电泳、PCR及Real-time PCR扩增评价该方法的特异性及灵敏度.结果本方法所提细菌DNA电泳条带清晰,未见假阳性,D(260)/D(280)=(1.79±0.03);PCR及Real-time PCR扩增未见假阳性及假阴性,灵敏度达101/ml细菌浓度.结论本研究细菌DNA提取方法特异灵敏,适应于PCR及Real-time PCR.     

4种提取口腔产黑色素细菌DNA方法的比较

目的 比较4种提取口腔产黑色素细菌中间普氏菌DNA的方法,即酚-氯仿法、溴化十六烷基三甲铵(CTAB)提取法、Chelex-100提取法及试剂盒.方法 分别记录OD260、OD230、OD280及OD340值;聚合酶链反应(PCR)电泳,检测提取DNA的浓度、纯度及对PCR反映体系的影响.结果 试剂盒及CTAB法去除黑色素比较差异无统计学意义(P＞0.05),两者与酚-氯仿及Chelex-100法比较差异有统计学意义(P＜0.05);CTAB法提取DNA的浓度及纯度的效果要优于试剂盒,差异有统计学意义(P＜0.05),PCR电泳条带清晰,无拖带.结论 CTAB法可有效去除黑色素及其他杂质,同时获得较高浓度的DNA样品;黑色素并不溶于氯仿/异戊醇混合液,对PCR反应体系有很大影响.     

两种石蜡包埋组织DNA提取方法的比较

目的 比较两种不同的DNA提取方法 对DNA质量的影响.方法 选取石蜡包埋的病理组织24例,采用二甲苯脱蜡法和改良TES水浴法提取DNA.通过对所提DNA的浓度、纯度及完整性的检测,比较两种DNA提取方法 的优劣.结果 二甲苯脱蜡法提取样品D260/D280比值在1.6～1.8之间的为62.5%,电泳条带清晰可见;改良TES水浴法提取样品D2eo/D280比值在1.6～1.8之间的为41.2%,电泳条带模糊不清.结论 二甲苯脱蜡法提取DNA简单快速,需要的组织样品少,是一个值得推荐的石蜡包埋组织DNA的提取方法 .     

PCR及Real-time PCR评价细菌DNA提取方法

目的:比较几种不同的细菌DNA提取方法,建立一种适于PCR和Real-time PCR的细菌DNA提取方法.方法:分别用蛋白酶K法、碱裂解法、Chelex-100 NP40、Chelex-100 TritonX-100法和水煮法提取同种浓度大肠杆菌DNA,测定OD260/280;用不同方法提取不同浓度的大肠杆菌DNA,进行PCR和实时荧光定量PCR扩增,比较灵敏度.结果:5种方法提取细菌DNA,其中Chelex-100 NP40 法纯度(OD260/280=1.79±0.03)最高,此方法所提取的DNA产物进行PCR及Real-time PCR扩增未见假阳性及假阴性,其灵敏度为10个/ml细菌浓度.结论:Chelex-100 NP40的细菌DNA提取方法纯度及灵敏度高,且适应于PCR及Real-time PCR.     

人非抗凝血块中基因组DNA提取不同方法的比较

目的:比较三种不同方法提取人非抗凝血块基因组DNA的效果差异。方法:分别采用酚/氯仿法,天根试剂盒,Invitrigen purelinkTM试剂盒提取冻存时间较长的非抗凝血块基因组DNA,测定浓度、OD260/280值,琼脂糖凝胶电泳检测提取的DNA浓度和纯度,测定PCR产物灰度值。结果:三种方法都可以提取出基因组DNA,测定DNA浓度分别为:(35.56±15.27)ng/μL,(45.13±16.54)ng/μL,(57.93±14.5)ng/μL,组间存在统计学差异(P<0.01),A260/A280值分别为:1.46±0.19,1.49±0.16,1.519±0.23,三组间比较差异无统计学意义(P>0.05);三种方法提取的基因组DNA都能通过PCR扩增出目的条带,PCR产物电泳灰度值结果分别为:75.421±3.435,149.32±6.875和229.52±19.55,组间比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论:三种不同方法都能提取出冻存时间较长的非抗凝血块基因组DNA,但Invitrigen purelinkTM试剂盒法效果最好。     

三种方法提取金黄色葡萄球菌DNA的比较

目的对三种金黄色葡萄球菌DNA提取方法的效果进行比较,以期获得一种简便、经济的提取方法。方法采用改良SDS法、NP40法和细菌DNA试剂盒法分别提取同一浓度的金黄色葡萄球菌ATCC25923细菌DNA,利用Nano Drop 2000核酸检测仪测定核酸浓度和纯度,纯度用核酸在波长260 nm处的吸光值与在波长280 nm处的吸光值的比值A260/A280表示,用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量;提取不同浓度梯度的金黄色葡萄球菌ATCC25923细菌DNA,PCR扩增16S r DNA片段检测并比较三种方法的灵敏度。结果三种方法提取金黄色葡萄球菌所得核酸浓度差异有统计学意义(χ~2=6.25,P0.05),NP40法提取浓度较高,改良SDS法较低。试剂盒法提取的DNA纯度较高,A_(260)/A_(280)值在1.8~2.0之间;NP40法提取纯度较差;DNA电泳结果表明SDS法和TIANGEN试剂盒法提取的DNA条带清晰,无拖带现象,NP40法未出现DNA主带,且有拖带现象。所有方法所得DNA经PCR扩增均出现阳性条带。NP40法提取DNA的PCR检测敏感度最高,为1.5×10~6 cfu/ml,改良SDS法敏感度最低,为1.5×10~8 cfu/ml。结论 NP40法提取DNA成本低,耗时少,灵敏度高,适用于金黄色葡萄球菌的快速初筛。     

从血液和唾液中自动化提取人体DNA的探索与应用

目的 从样本获取方式、储存条件和DNA提取方法等方面探索快速、有效、低成本、无创伤、适合于大规模流行病学研究的基因组DNA来源样本.方法 对带有分离胶的血细胞、EDTA抗凝全血、分离血清后的凝固血细胞、新鲜唾液、-20℃保存1个月的唾液、2种唾液保护液作用的唾液样本和棉拭子获得的口腔黏膜上皮细胞样本进行DNA提取和检测,验证不同样本获得DNA的稳定性.随机抽取1人的2份质量控制合格的DNA样品,采用高通量测序技术对亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)C677T基因多态性位点进行分型检测.结果 带有分离胶的血细胞样本中,分离胶对血细胞DNA的提取效果影响明显,DNA样品合格率为37.7％(1130/3000).EDTA抗凝全血样本DNA提取效果良好,DNA浓度为(180.20±20.30)mg/L,D260/D280为1.90±0.10.分离血清后的凝固血细胞样本中DNA降解严重,提取的DNA浓度为28.91～34.53 mg/L.新鲜唾液和-20℃保存1个月的唾液样本经提取后得到的DNA浓度均合格,且差异无统计学意义(P>0.05).2种唾液保护液作用下的唾液样本提取得到的DNA浓度均合格,且差异无统计学意义(P>0.05).口腔黏膜上皮细胞样本提取的DNA浓度为(48.41±9.81)mg/L,低于唾液样本来源的DNA浓度.高通量测序结果显示,按照质量控制标准筛选的合格DNA样品可以实现体外目的基因片段的扩增和MTHFR C677T基因多态性位点的分型检测.结论 血液和唾液样本均是人体基因组DNA提取的良好来源,唾液样本成本低、采集无创伤且质量控制合格,是一种更有效的DNA来源样本.     

介绍一种快速提取胎鼠基因组DNA进行基因型分析的改良方法

目的 建立一种快速提取胎鼠基因组DNA进行基因型分析的简便方法.方法 先对胎鼠组织进行碱裂解,然后通过盐析纯化DNA,经琼脂糖凝胶电泳判断DNA大小,检测A260/A280的比值判断其纯度,最后将抽提的DNA进行PCR扩增和基因型分析,检测其作为PCR模板的稳定性.结果 在2h内能分离到胎鼠基因组DNA,片段完整没有明显的降解现象,A260/A280比值＞1.77,能稳定用于PCR基因型鉴定分析.结论 该方法简便、快速、经济,能得到PCR级的高质量胎鼠基因组DNA,为准确和快速地进行胎鼠的基因型分析提供保证,具有很好的稳定性、可靠性和实用性.     

昆明地区Rh阴性者RhD假基因(RhDψ)和杂交RhD-CE-D基因的检测和医学应用

目的 用PCR基因分型技术分析研究昆明地区常住人口Rh阴性血型的D基因多态性,建立和完善本地区Rh血型的PCR RhD基因检测方法 .方法 收集46例Rh阴性血型样本,首先采用外显子-SSP进行PCR扩增,筛选出5例D基因部分存在型,再采用内含子-SSP进行PCR扩增,扩增产物用于DNA测序.结果 在46例Rh阴性血型样本中,D基因完整缺失者29例(63%);D基因完整存在者12例(26.1%),存在全部外显子;D基因部分存在者5例(10.9%).DNA测序结果 显示,2例仅存在D基因的第10外显子的样本均为RhD-CE(3-9)-D杂合基因,1例存在D基因的第4、6外显子为RhD-CE(2-3,5,7-9)-D杂合基因,是新发现的变异等位基因.结论 (1)昆明地区常住人群存在高频率的RhD-CE(3-9)-D杂合基因.(2)在昆明人群发现一种新型D变异等位基因即RhD-CE(2-3,5,7-9)-D杂合基因.     

河南部分人群D16S539、D7S820、D13S317基因座遗传多态性分析

目的了解河南地区人群中D16S539、D7S820、D13S317基因座的遗传多态性,获得群体遗传数据.方法对230份无血缘关系个体的抗凝血样提取DNA,应用多位点复合PCR扩增技术结合聚丙烯酰胺凝胶电泳分型方法调查D16S539、D7S820、D13S317基因座在河南地区群体中的基因型分布.结果D16S539基因座在河南地区人群中存在9个等位基因,28种基因型;D7S820基因座存在9个等位基因,29种基因型;D13S317存在8个等位基因,31种基因型.基因型频率分布符合Hardy-Weinberg平衡.结论D16S539、D7S820、D13S317基因座是进行人类群体遗传学和法医遗传学研究十分有用的遗传标记.     

RP-HPLC法测定维生素D3制剂中的有关物质

建立维生素D₃制剂中有关物质检查的反相HPLC方法。以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;乙腈为流动相;柱温20 ℃;检测波长为265 nm;流速1.0 mL/min。建立的方法可以使维生素D₃与相邻杂质有效分离。通过光热反应特性和LC-MS-DAD对相邻杂质进行了定性。维生素D₃与其主要杂质前维生素D₃、反式维生素D₃和速甾醇D₃互为同分异构体,在LC-MS上具有相同的特征离子峰m/z 385.27,四者的最大紫外吸收波长分别为265,265,275,279 nm。该法专属性、耐用性较好,检测限和定量限分别为0.1μg/mL和0.3 μg/mL。供试品溶液在室温下放置24 h稳定。应用本法对3种维生素D₃制剂进行有关物质检查,并与正相HPLC法比较,两种方法结果一致,表明本法适用于维生素D₃制剂中有关物质检查。     

Preparation of the microarray for detecting hepatitis D virus]

OBJECTIVE: To prepare the microarray for detection of hepatitis D virus (HDV). METHOD: Several pairs of specific PCR primers were designed according to the conserved region of HDV genome. The DNA microarray were prepared by blotting the PCR products onto the surface of glass slides with the use of robotics, and restriction display PCR (RD-PCR) was employed to label the samples. RESULT: Sequences analysis showed that the products of PCR amplification were the specific gene fragments of HDV. Hybridization signals on the gene chip demonstrated good specificity and sensitivity of the microarray for HDV detection. CONCLUSION: Microarray-based clinical HDV detection can be sensitive and effective.     

O3/UV和O3/H2O2氧化法处理聚丙烯酰胺采油废水

为降低油田采油废水的化学需氧量（COD）负荷,提高其可生化性,采用O₃/UV和O₃/H₂O₂氧化法对聚丙烯酰胺采油废水进行处理,分别考察了氧化时间、H₂O₂与O₃物质的量之比、pH以及紫外灯功率对采油废水处理效果的影响。结果表明,与采用单独臭氧氧化相比,O₃/UV以及O₃/H₂O₂联用技术对采油废水中的COD及聚丙烯酰胺（PAM）的去除效果更为显著,废水可生化性均有所提高,且O₃/H₂O₂氧化法对采油废水的可生化性提高程度更大。O₃/UV氧化法对于聚丙烯酰胺采油废水可生化性影响的最佳条件为：pH=8.0,O₃质量浓度为19.7 mg/L,紫外灯功率为18 W,氧化时间为30 min,可生化性（B/C）提高至0.092;O₃/H₂O₂氧化法对于聚丙烯酰胺采油废水可生化性影响的最佳条件为：pH=8.0,O₃质量浓度为19.7 mg/L,H₂O₂与O₃物质的量之比为0.3,氧化时间为30 min,B/C提高至0.175。氧化预处理提高了废水的可生化性,减轻了后续生化处理压力。     

微阵列芯片技术在耐多药结核病临床诊断中的应用研究

目的 探讨微阵列芯片技术在耐多药结核病（multidrug resistant tuberculosis,MDR-TB）临床诊断中的应用。方法 收集2020年6月至2021年5月经滨州市中心医院确诊的245例住院肺结核患者的标本（痰液标本125例和痰培养分离菌株120例）。痰液标本同时采用DNA微阵列芯片技术和传统培养法检测其结核杆菌阳性率。痰液标本和分离菌株均采用DNA微阵列芯片技术进行肺结核耐多药检测和分枝杆菌菌种鉴定。结果 125例痰液标本经DNA微阵列芯片技术和痰培养法检测,阳性率分别为58.4%（73/125）和24.8%（31/125）,两种方法比较差异有统计学意义（2=14.520,P<0.001）。采用DNA微阵列芯片技术检测125例痰液标本和120例分离菌株,共检出结核分枝杆菌复合群192例,非结核分枝杆菌7例。结核分枝杆菌复合群192例检出耐药者41例,其中耐异烟肼15例,耐利福平19例,同时耐两种药物7例。非结核分枝杆菌包括胞内分枝杆菌4例,堪萨斯分枝杆菌2例,鸟分枝杆菌1例。结论 DNA微阵列芯片技术检测周期短,能同时进行结核分枝杆菌耐多药检测和菌种鉴定,对MDR-TB的早期诊断和治疗有较大的临床应用价值。     

基因芯片技术检测丁型肝炎病毒的研究

目的制备检测丁型肝炎病毒(HDV) 基因芯片。方法针对HDV基因保守区域设计多对PCR引物。用芯片点样仪将PCR产物点到玻片上制成基因芯片。样品标记采用限制性显示技术,样品标记后进行杂交。结果运用PCR技术得到多个HDV特异性基因片段,序列分析表明,所扩增的片段均属于HDV特异基因。杂交结果显示,样品和HDV诊断基因芯片杂交的敏感性和特异性均佳。结论用基因芯片检测HDV具有敏感、高效、检测结果可靠的优点,有着较大的应用前景。     

寡核苷酸芯片技术检测乙肝病毒拉米夫定耐药株的应用研究

目的建立乙肝病毒拉米夫定耐药检测寡核苷酸芯片技术,并对乙肝病毒拉米夫定耐药检测寡核苷酸芯片的临床应用进行了评价。方法通过对388份服用拉米夫定、559份未服用拉米夫定的HBV DNA阳性血清以及359份HBV DNA阴性血清进行耐药突变检测,同时对照进行荧光定量PCR检测和DNA序列测定,对芯片法检测的准确度、实用性进行考评。结果对388份乙型肝炎病毒DNA多聚酶突变标本均能检测到突变;528、552、555位密码子突变检测芯片法与测序法的符合率分别为96.6%,98.5%,100%。559例荧光PCR检测HBV DNA阳性的样品,除3份弱阳性标本外,均为阳性,且能进行乙型肝炎病毒DNA多聚酶拉米夫定耐药相关位点的检测,两者的符合率为99.7%。359份HBsAg阴性标本经芯片法检测,结果为HBV DNA全部阴性。结论乙肝病毒拉米夫定耐药检测寡核苷酸芯片可用于临床检测病人血清中的野生型和拉米夫定耐药突变型病毒株,指导临床用药。     

超顺磁Fe3O4@PDA核-壳结构纳米粒子的制备及表征

利用多元醇高温热解法和溶液氧化法制备超顺磁四氧化三铁聚多巴胺核-壳结构纳米粒子(Fe₃O₄@PDA)。采用 X 射线衍射(XRD)、透射电子显微镜(TEM)、动态光散射(DLS)、傅里叶转换红外光谱(FT-IR)和热重分析(TG)等对 Fe₃O₄@PDA 的结构、形貌和组成进行表征。采用综合物性测试系统(PPMS)对样品的磁性能进行表征。结果表明:Fe₃O₄@PDA 的尺寸可以通过氨水与多巴胺的物质的量之比和反应时间进行调控;当Fe₃O₄@PDA 中Fe₃O₄的质量分数约为5%时,具有超顺磁性,磁饱和强度为3.8 emu/g,比理论值高出36%。     

g-C3N4纳米棒/TiO2/Ni/CNTs复合物的制备及其光催化性能

通过简单的快速加热回流本体氮化碳制备了缺陷较少的g-C₃N₄纳米棒;然后采用缓慢水解法在g-C₃N₄纳米棒表面负载掺杂镍的TiO₂前驱体,经热处理制得g-C₃N₄纳米棒/TiO₂/NiO纳米复合光催化剂;最后以TiO₂中的Ni为催化剂,采用化学气相沉积法原位生长CNTs,制备g-C₃N₄纳米棒/TiO₂/Ni/CNTs纳米复合光催化剂。通过XRD、TG、TEM、FT-IR、UV-Vis等测试方法对催化剂进行表征,考察了样品在紫外光和可见光下对亚甲基蓝（MB）的光催化降解活性。结果表明：g-C₃N₄纳米棒/TiO₂/Ni/CNT纳米复合物在紫外和可见光下对亚甲基蓝的降解率分别为87%和68%,光催化活性较g-C₃N₄/TiO₂/NiO有明显提高。     

两种前处理方法对粘液型宫颈HPV分型结果的比较

目的 研究2种前处理方法对粘液型标本HPV DNA杂交结果的影响,为进一步提高临床检验质量和改进检测技术提供理论依据.方法 收集100例妇科门诊患者粘液型宫颈脱落细胞标本,分别采用常规方法(生理盐水震荡法)和蛋白酶K消化法对脓性粘液型标本进行前处理,应用核酸分子快速导流杂交技术进行21种HPV亚型感染检测.研究不同前处理方法对HPV DNA浓度、纯度和分型结果的影响.结果 ①常规方法处理后所抽提的DNA纯度、含量分别为1.63±0.71和(96.35±13.15)μg/ml,蛋白酶K消化法处理后所抽提的DNA纯度、含量分别为1.80±0.52和(105.14±18.65)μg/ml,蛋白酶K消化法处理后检测的DNA纯度和含量分别高于常规法(P＜0.01).②常规法检测出现PCR反应抑制物的例数为4例,而蛋白酶K消化法则为0例.③常规法和蛋白酶K消化法HPV分型的总阳性率、单一感染率、多重感染率分别为28.0％、23.0％、5.0％和32.0％、26.0％、6.0％,两法一致性检验Kappa=0.888,结果具有较好的一致性.结论 基于蛋白酶K消化法的HPV检测,对粘液型标本可获得质量较好的HPV DNA,无核酸丢失和污染,分型结果满意,可以有效去除PCR反应抑制物,操作简便,适合临床检验应用.     

不同厂家D_(101)大孔树脂对赤芍提取物纯化工艺考察

[目的]考察相同型号(D101)不同厂家生产的大孔吸附树脂对芍药苷的富集工艺比较。[方法]以芍药苷为指标,对树脂的静态和动态吸附、解吸附性能进行了考察。[结果]A、B两个厂家静态吸附和解吸附性能较好,而B、D、E 3个厂家的动态吸附和解吸附性能较好。[结论]不同厂家生产的D101大孔树脂在对芍药苷的吸附和解吸附性能上存在一定的差异。