浙江省丽水地区2株汉坦病毒分离株的型别鉴定和基因差异研究

目的 从浙江省丽水地区肾综合征出血热(HFRS)疫区阳性鼠肺标本中分离汉坦病毒(HV),并对丽水分离株进行分子生物学鉴定,分析M和S片段基因序列以确定毒株的型别和基因差异程度.方法 收集宿主动物标本,采用直接免疫荧光检测鼠肺标本HV抗原.将HV抗原阳性的鼠肺标本接种Vero-E6细胞,分离HV.提取病毒总RNA,应用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增病毒M和S基因全片段,克隆入质粒载体,纯化后测定序列,并同HV其他病毒株进行比较.结果 成功分离到2株HV,扩增出2株病毒的M和S全片段并测定了序列,经对核苷酸序列分析表明,2株病毒与现有的HTNV有最高的同源性,均为HTNV,但与国内外其他的HTNV核苷酸差异高达13.4%～20.7%和10.3%～16.1%.用M和S片段核苷酸序列所构建的系统进化树显示,2毒株分在HTNV发生群,与HTNV的Z10、A9、Z5病毒株亲缘关系最近,但独自构成一进化支.结论 浙江丽水分离株可以定型为HTN型病毒,与国内外其他的HTN型病毒基因差异较大.     

一株汉城型汉坦病毒的分离及基因鉴定

目的从鼠肺中获得汉坦病毒分离株并进行基因鉴定与分型,为地区分离株特性研究提供基础。方法用Vero-E6细胞分离病毒,进行荧光和RT-PCR鉴定,之后对目的片段进行序列测定和分析。结果从褐家鼠鼠肺中分离到一株汉坦病毒,编号SC106。用汉城型（SEO）汉坦病毒M基因特异性引物检测得到预计大小的片段,此片段的核苷酸序列分析表明,SC106与SEO型参考毒株的同源性较高,均在94%以上;与汉滩型（HTN）参考毒株的同源性较低,均在67%以下。进化树分析表明SC106位于SEO型所在的支系。结论SC106为SEO型汉坦病毒。     

江西省537份鼠肺标本中大别山病毒的检测及基因特征分析

目的 了解江西省大别山病毒的基因特征。方法 对2017年收集的经直接免疫荧光法检测为汉坦病毒阳性的鼠肺标本进行汉坦病毒全S和部分M基因片段RT - PCR扩增,对扩增产物进行TA克隆和测序,运用DNAstar 软件对获得的序列进行分析。结果 2017年共收集鼠肺标本537份,直接免疫荧光法检出14份汉坦病毒阳性,对其中的6份进行RT - PCR扩增。经序列分析表明,有2株（GAXW19/2017、GAXW20/2017）为大别山病毒。获得的GAXW19/2017、GAXW20/2017全S基因和部分M基因核苷酸同源性均为100%。S基因全长1 725 bp,编码429个氨基酸。全S基因与大别山病毒NC167株核苷酸同源性88.6%、氨基酸同源性为98.4%,部分M基因与NC167株核苷酸同源性86.4%, 氨基酸同源性分别为99.0%;与其他型别汉坦病毒比较,S和部分M基因核苷酸同源性均小于80%,氨基酸同源性均小于93%。在汉坦病毒S和M基因进化树上,GAXW19/2017、GAXW20/2017均分布在大别山病毒分支且独立分支。结论 GAXW19/2017、GAXW20/2017为大别山病毒,首次在江西省鼠肺样本中发现大别山病毒。     

辽宁省汉滩型汉坦病毒基因特征及分布研究

目的探讨辽宁省汉滩型汉坦病毒(HTNV)的基因特征及其分布情况。方法在辽宁省肾综合征出血热(HFRS)主要流行地区收集鼠肺和HFRS患者标本,采用间接免疫荧光法检测鼠肺中HV抗原,以RTPCR方法扩增标本中M和S基因片段的特异性核苷酸序列,将HTNV的阳性产物测序,并进行同源性比对和系统发生分析。结果辽宁省HFRS疫区HTNV主要为黑线姬鼠所携带;从鼠肺标本中扩增出M片段4份,患者标本中扩增出M片段5份,S片段1份;M片段的核苷酸同源性分析表明,辽宁株与Bao14、CJAp267等株同源性最高,为95%～97%,与HTNV原型株76-118同源性为87.4%～89.0%;系统发生分析显示辽宁株均分布于同一支内,与Bao14、CJAp267等株构成一个独立的支系,同属于H4亚型;TL2S基因片段与YaluRiver13核苷酸同源性最高(97.1%),与HTNV原型株76-118同源性为91.2%;推导的S片段氨基酸同源性,TL2与Bao14、CJAp93同源性较高,为93.0%～96.2%,与其他代表株同源性多在74.1%～81.6%;而且基于S片段的系统发生分析提示与M片段的分型结果基本一致,与Bao14、CJAp93等株位于同一分支内,为H4亚型。结论目前辽宁省流行的HTNV主要为H4基因亚型,基因亚型的分布相对比较单一。     

2012 - 2015年江西省啮齿动物间流行的汉坦病毒基因型和基因亚型分析

目的 了解2012 - 2015年江西省啮齿动物间流行的汉坦病毒基因型别和基因亚型。方法 选取江西省肾综合征出血热疫情发生地区捕鼠,收集鼠肺标本,采用直接免疫荧光法检测鼠肺中汉坦病毒抗原,提取阳性鼠肺标本核酸,设计并采用特异性引物分别对病毒的S、M、L 3个基因进行RT - PCR扩增,对扩增产物测序和分析。结果 共捕鼠2 235只,其中汉坦病毒阳性的86只,阳性率3.85%,流行的HV基因型为汉滩型(Hantaan orthohantavirus,HTNV)和汉城型（Seoul orthohantavirus,SEOV）。江西省HTNV之间S、M、L 3个基因核苷酸的同源性为93.4%～100%,与国内外HTNV参考株3个基因核苷酸的同源性为77.3%～88.0%,在3个基因系统进化树上均呈独立分支;M基因系统进化分析发现江西省SEOV分布在S3、S4亚型分支以及1个独立的进化分支,该独立分支的9株SEOV与国内外SEOV M基因核苷酸同源性仅为84.3%～88.7%。结论 江西省啮齿动物流行的HV为HTNV和SEOV 2种基因型别,其中HTNV为新的基因亚型,SEOV存在3个基因亚型:S3、S4和1个新的基因亚型。     

安徽省汉坦病毒的基因序列分析

目的了解安徽省汉坦病毒(HV)型别及分子特征,为防治提供科学依据。方法将汉坦病毒抗原阳性的鼠肺及急性期病人血清标本接种Vero细胞,分离汉坦病毒。阳性培养物提取病毒总RNA,应用RT-PCR扩增病毒S片段,产物经测序拼接获得S片段全基因序列,用DNAStar、MEGA 4.1等生物软件进行核苷酸序列分析,构建基因序列系统进化树,确定病毒型别。结果免疫荧光检测,513鼠肺标本21份阳性,分离6株病毒;4份急性期病人血清分离1株病毒。选择3株病毒进行S片段基因测序,测定序列与汉坦病毒HTN、SEO、SNV型毒株比较,表明两株为HTN型,一株为SEO型,序列相似性达98.4%以上。结论安徽省流行的HV为HTN型和SEO型,以HTN型为主,未发生较大变异。     

湖南省2006年肾综合征出血热病原学监测研究

目的 了解湖南省啮齿动物中汉坦病毒带病毒率、基因型别和分布.方法 采用直接免疫荧光(DFA)法检测鼠肺汉坦病毒抗原,从汉坦病毒阳性鼠肺标本中提取病毒RNA,应用汉坦病毒型特异性引物进行逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增、核苷酸序列测定以及基因分型和同源性分析.结果 总鼠密度为3.15%,鼠带病毒率为1.31%,在室内捕获的7只褐家鼠、黑线姬鼠、小家鼠、黄胸鼠鼠肺标本中均发现携带SEO型病毒,在室外捕获的1只黑线姬鼠鼠肺标本则携带HTN型病毒.成功对6份阳性PCR产物进行了序列分析,浏阳市1、2、4、6号标本同源性较高为100%,邵东市的7、8号标本同源性也较高为100%,但两地区间的同源性差异为89.3%,L99株与浏阳分离株的同源性为94.4%,与邵东分离株的同源性为88.3%.结论 湖南省汉坦病毒存在HTN和SEO型,以SEO型为主.     

深圳市鼠类感染汉坦病毒的分子特征

目的 了解深圳市宿主动物携带汉坦病毒状况、病毒型别及分子特征.方法 笼日法捕鼠,计算鼠密度,确定鼠种构成.共捕获宿主动物472只,褐家鼠为优势鼠种,占87.29%.免疫荧光抗原阳性鼠肺标本中提取病毒RNA,应用汉坦病毒型特异性引物进行逆转录.套式PCR扩增M片段基因和核苷酸序列测定,对汉坦病毒进行基因分型和同源性分析.结果 21只来自我市不同区褐家鼠的鼠肺标本中均发现携带汉城型病毒,汉坦病毒M片段核苷酸同源性高达95.4%以上,属于同一亚型.系统进化树显示它们可以分为6个小进化分支,与SZ2083进化关系相对最近.但发现来源于地理位置较近的病毒株并没有显示出较高的基因组核苷酸序列的同源性,反而相隔较远的病毒株呈现出一致性.结论 深圳市汉坦病毒的主要宿主动物是褐家鼠,携带的汉城型汉坦病毒之间的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列同源性较高,但也存在一定的差异.这种差异形成的原因有待进一步研究.     

浙江省2008-2011年啮齿动物中汉坦病毒的分离及鉴定

目的 分析浙江省肾综合征出血热(HFRS)疫区鼠形动物携带汉坦病毒状况及其型别.方法 应用直接免疫荧光试验和RT-PCR方法检测汉坦病毒抗原和核酸,阳性者用长爪沙鼠和Vero-E6细胞进行病毒分离,对分离株的M片段基因进行序列测定和分析.结果 2008-2011年在浙江省HFRS疫区捕获的鼠形动物中以黑线姬鼠为优势鼠种;从该鼠鼠肺中共分离到6株汉坦病毒,序列分析表明分离株均为汉滩型汉坦病毒,其中Z521、524、534为H7亚型,TT-27、T-43、R88可能为新亚型;6株分离株之间的基因同源性较高,并与以往浙江省分离株具有较高同源性.结论 2008-2011年浙江省HFRS疫区鼠间存在汉滩型汉坦病毒流行.     

东南沿海地区汉坦病毒的遗传进化分析

目的 对浙江、福建省及上海市东南沿海地区汉坦病毒的基因进行比较.方法 收集浙江、福建省及上海市汉坦病毒部分M基因序列,应用Mega 4.0和DNAStar软件包进行系统发生分析,以邻位相连法(NJ)构建系统发生树,分析东南沿海地区浙江、福建省及上海市汉坦病毒的基因差异,分析采用1000个多序列组.结果 经对浙江、福建省及上海市若干株汉坦病毒基因的序列比较与系统进化分析,浙江省分离的同型别毒株的基因序列同源性高于福建省与上海市的分离毒株,而浙江省同地区分离株的核苷酸同源性更高,地区接近的分离株系统进化分支的分布也大部分更靠近.汉滩型病毒(HTNV)福建株的ZH53和汉城型病毒(SEOV)浙江建德株Gou3和ZJ5与本研究同型别的其他株及国际标准株的核苷酸同源性较低,分别为82.7％～86.3％和84.0％～85.3％,而且分别在HTNV和SEOV发生群中构成一独立分支.浙江省从田鼠中分离到SEOV,产生宿主“溢出”现象.结论 浙江、福建省及上海市东南沿海地区汉坦病毒的基因差异和亲缘远近关系主要表现在地区性,显示出高度的地理聚集现象,浙江省建德地区和福建省分别存在SEOV和HTNV的特殊亚型病毒.     

山东省汉坦病毒分子流行病学研究

目的探讨山东省汉坦病毒（HV）的分子流行病学特点。方法用反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）及核苷酸序列测定技术,对肾综合征出血热（HFRs）监测点的阳性鼠肺标本进行目的基因扩增并测序,与国内外的HV毒株进行同源性分析及系统发生树分析。结果有15份标本扩增出汉城（SEO）型S、M片段,对其中10份扩增片段进行序列分析认为均为SEO型HV,S片段之间的同源性≥96.3％,其推导的氨基酸序列同源性（JN5-153S和DY1S除外）≥96．8％;M片段之间及与山东省以往分离的ZB8同源性≥97．5％,其推导的氨基酸序列同源性为98．6％～100％。结论近年来山东省流行的HV仍以SEO型S3亚型为主。同一地区或地理位置相邻的地区病毒基因组同源性较高,具有明显的地区聚集性,基因型别较为稳定。     

浙江省天台县2011－2018年汉坦病毒基因型别和进化变异研究

目的 研究2011－2018年肾综合征出血热（HFRS）国家监测点浙江省天台县汉坦病毒（HV）的基因型别和进化变异情况，了解天台县HV分子流行病学特点。方法 将天台县2011－2018年HV抗原阳性的鼠肺标本超声后提取核酸，利用HV型特异性引物，应用巢式PCR对部分M片段进行扩增分型和序列测定，将天台县2011－2018年的HV序列与国内外其他已知的HV序列进行比较，以明确该地区的基因型别，分析病毒的进化变异情况。结果 HV抗原阳性的67份鼠肺标本经型特异性引物巢式PCR扩增后31份标本为阳性，其中30份为汉滩病毒（HTNV）、1份为汉城病毒（SEOV），31份PCR阳性鼠肺均来自黑线姬鼠。31份巢式PCR阳性产物的部分M片段核苷酸序列有30株分布在HTNV单元群，1株分布在SEOV单元群。HTNV单元群中的天台T2018-130株与天台其余29株及国内外其他株同源性为84.8%～87.9%，差异较大，天台其余29株亲缘关系较近； SEOV发生群中的T2016-31株来自黑线姬鼠的鼠肺标本，与SEOV天台以往分离株ZT71株、ZT10株和浙江温州分离株Z37株在系统发生树上分布于同一或临近分支。结论 浙江省天台县HV流行的主要型别HTNV基因表现出明显的地理聚集现象，但也存在着基因差异较大的变异株T2018-130株；同时从病毒基因序列分析证实SEOV T2016-31株存在于黑线姬鼠中，可能意味着在SEOV进化过程中病毒在宿主间发生了“溢出”现象。     

2015年黔东南地区麻疹病毒分离株基因特征分析

目的 分析2015年黔东南地区麻疹病毒基因型别和特征。方法 采集疑似麻疹病例临床咽拭子标本,经Real - time RT - PCR初筛为麻疹病毒核酸阳性,使用Vero/SLAM细胞进行病毒分离,对阳性分离物提取病毒RNA,采用RT - PCR方法扩增麻疹病毒N基因羧基末端编码的634个核苷酸片段,并进行测序与分析。结果 35例疑似麻疹病例中检测到4例麻疹病毒阳性核酸,经分离得到2株麻疹病毒。基因亲缘关系显示2株为H1基因型中的H1a基因亚型。2株麻疹病毒株与H1基因型参考株MVi/Hunan.CHN/0.93/7(AF045212)比较,核苷酸和氨基酸同源性分别为97.7%和98.0%;与H1a基因亚型参考株Chin9322比较,核苷酸和氨基酸同源性分别为98.9%和99.3%;2株H1a基因亚型与往年及本省流行的麻疹病毒的核苷酸和氨基酸同源性分别为98.2%～100%和98.0%～100%。结论 黔东南地区2015年分离到的麻疹病毒为H1a基因亚型,与贵州省本土麻疹流行的优势基因亚型一致。     

汉滩型与汉城型汉坦病毒基因重排的初步研究

目的：探讨汉坦病毒汉滩型与汉城型之间能否发生基因重排以及发生重排的频率和特点。方法：用汉坦病毒汉滩型76－118株与汉城型SR－11株混合感染VeroE6细胞，空斑形成试验挑取子代病毒克隆株，分型聚合酶链反应方法鉴定子代病毒基因型。结果：大部分（68．19％）子代病毒的基因组来自7－118株或SR－11株；2株（4．55％）两型引物扩增均为阳性；2株（4．45％）两型引物扩增均为阴性；5株（11．36％）发生了M片段重排，3株（6．82％）发生了L片段重排，未发现S片段重排；1株M片段来自双亲株，1株S片段为双倍体。结论：证实汉坦病毒I型与II型之间可以发生重排。     

Hantavirus outbreak associated with laboratory rats in Yunnan,China

An outbreak of hemorrhagic fever with renal syndrome occurred among students in a college (College A) in Kunming, Yunnan province, China in 2003. Subsequent investigations revealed the presence of hantavirus antibodies and antigens in laboratory rats at College A and two other institutions. Hantavirus antibodies were detected in 15 additional individuals other than the index case in these three locations. Epidemiologic data indicated that the human infections were a result of zoonotic transmission of the virus from laboratory rats. A virus was isolated from rats in College A and the full-length genome sequence revealed that this was a new Hantaan virus isolate, designated strain KY. Sequence analysis of the three genome segments indicated that this new isolate is a reassortant derived from human and rat Hantaan viruses. Further sequence analysis of the medium (M) genome segment revealed that it originated from a recombination event between two rat Hantaan virus lineages.     

云南省澜沧江流域蚊虫流行性乙型脑炎病毒分子特征分析

目的确定2007-2009年从云南省澜沧江流域采集蚊虫中分离的13株流行性乙型脑炎病毒(JEV)基因型及其E基因序列特征。方法用反转录-聚合酶链反应(RTPCR)扩增E蛋白核苷酸序列,测序后用DNAStar软件包中的MegAlign程序完成核苷酸相似性和氨基酸同源性分析;用ClustalX1.83软件进行碱基配对后采用Mega5.0软件做进化树分析。结果 13株JEVE基因的核苷酸相似性为98.0%～100%,氨基酸的同源性为99.8%～100%,与我国乙脑减毒活疫苗株SA14-14-2的核苷酸相似性为86.1%～86.9%,氨基酸同源性为96.8%～97.2%;进化树分析发现,13株JEV均属于基因Ⅰ型。结论 2007-2009年从云南省澜沧江流域采集蚊虫中分离的13株病毒属于JEV基因Ⅰ型。     

Vero—E6细胞培养中汉坦病毒抗原流式细胞术检测方法的建立及与ELISA、IFA方法的比较

目的建立运用流式细胞仪检测Vero-E6细胞中汉坦病毒抗原的方法，并与间接免疫荧光法（IFA）、ELISA进行比较。方法将汉坦病毒感染10d的Vero-E6细胞以A35单克隆抗体为一抗，FITC标记羊抗鼠抗体为二抗，采用流式细胞仪检测表达抗原的细胞，并将病毒不同感染天数及病毒不同载量感染情况下的抗原检测结果与IFA、双抗体夹心法ELISA进行比较。结果流式细胞术在感染后的第2天可检出的阳性细胞数为2．60％，其最低检出的病毒感染载量为50pfu／ml；而IFA和双抗体夹心法ELISA则分别在感染后的第3天、第2天能检出抗原，最低检出的病毒感染载量均为50pfu／ml。结论流式细胞术检测法作为一种检测细胞内汉坦病毒抗原的方法具有简便、灵敏快速，与ELISA、IFA方法比较，可更直接准确定量。