实时荧光定量RT-PCR检测TGF-β1 mRNA表达

利用荧光TaqMan技术 (5′核酸外切酶活性 )和一种可以实时检测荧光信号的仪器 (ABIPrism 770 0序列检测系统 ) ,在PCR反应完全封闭的情况下可实时检测PCR扩增的动力学变化 ,能够对标本扩增过程中的起始拷贝数快速、准确地定量 ,极大地克服了原有PCR技术存在的不足 ,已逐步成为PCR更新换代的新技术[1 ,2 ] 。目前常规检测 β1 转化生长因子(TGF β1 )表达多采用竞争RT PCR及内源性参比基因RT PCR ,它们都属于PCR终点法检测 ,很难对起始模板数准确定量。我们利用实时荧光定量RT PCR技术建立了检测TGF β1 mRNA表达的方法。…     

SYBR Green Ⅰ实时定量PCR检测生存素基因的方法建立及条件优化

目的建立SYBRGreenⅠ染料实时定量PCR检测生存素（Survivin）基因定量的方法。方法根据PCR产物荧光强度、循环阈值（Ct值）、标准曲线斜率、相关系数和熔解曲线优化反应体系中各组分的量及反应条件，对引物二聚体消除策略和Ct值获取方式进行评价。并用该方法检测43份胃癌组织Survivin基因扩增情况。结果SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR体系扩增Survivin的最佳组成和条件是：Taq酶2．5U／100μl、MsCl2 2mmol／L、引物浓度0．2μmol／L和退火温度58℃；在PCR循环延伸结束后设置1个低于特异产物退火温度值2℃的荧光读取温度，能有效消除引物二聚体对定量检测的影响；以二次倒数最大值方式确定Ct值，能避免主观因素所致误差。研究建立的SYBRGreenⅠ染料实时定量PCR检测Survivin基因含量方法的灵敏度为10拷贝／μl，线性范围10^1～10^4拷贝μl（r=0．9997），批内变异系数（CV）1．13％-1．91％，批间CV3．31％-4．50％；胃癌组织中Sttrvivin基因扩增率为13．9％（6／43）。结论优化后的SYBRGreenI实时定量PCR方法具有方便、经济、灵敏度高和重复好等特性，可用于Survivin基因含量分析。     

荧光定量RT-PCR检测糖尿病病人PBMC中TGF-β1表达水平

目的：应用荧光定量逆转录聚合酶链反应（FQ—RT—PCR），检测糖尿病病人外周血单个核细胞（PBMC）中TGF-β1mRNA的表达水平。方法：分离外周血单个核细胞，用Trizol裂解液提取总RNA，逆转录为cDNA，在扩增体系中加入SYBR Green I，应用FQ—RT—PCR定量检测TGF-β1mRNA。结果：重组质粒测序证明插入的片断为TGF-β1特异性片断。荧光定量RT—PCR检测TGF—β1mRNA的灵敏度达10^5拷贝／ml，线性范围为10^5～10^11拷贝／ml，批内、批问变异系数分别为2．27％～2．56％和4．78％～5．22％．临床应用显示．糖果病惠者PBMC中TGF—β1 mRNA含量显著高于正常。结论：FQ-RT-PCR检测TGF-β1mRNA具有灵敏、特异、快速等特点．为临床应用提供了方法学依据。     

内源性TGF-β_1、TNF-α在三氧化二砷诱导HL-60细胞凋亡中作用的研究

目的　探讨内源性TGF β1、TNF α在三氧化二砷 (As2 O3)诱导HL 6 0细胞凋亡过程中的作用。方法　建立As2 O3 诱导HL 6 0细胞凋亡模型 ,应用RT PCR、定量PCR、ELISA、缺口末端标记(TUNEL)法、片段化DNA分析等方法研究As2 O3 诱导HL 6 0细胞凋亡过程中内源性TGF β1、TNF α及其受体基因以及TGF β1蛋白表达的变化 ;进而研究TGF β1、TNF α反义磷酸硫代脱氧寡核苷酸 (PSODN)对细胞凋亡的干预作用。结果　①As2 O3 诱导HL 6 0细胞凋亡过程中伴有TGF β1、TNF α表达上调 (处理前后mRNA拷贝数分别为 135 46± 12 4,4972 16± 187和 2 32 73± 2 2 9,6 742 17± 189) ,bcl 2表达下调 (处理前、后分别为 10 42 4± 2 74和 336 1± 89) ,细胞培养 2 4h上清中TGF β1蛋白水平明显提高 ,上升为对照组的 2 .0倍。②TGF β1、TNF α反义PSODN能够明显抑制As2 O3 诱导细胞凋亡的发生 ,并使细胞bcl 2mRNA及蛋白表达恢复到处理前的水平。结论　内源性TGF β1、TNF α在As2 O3 诱导HL 6 0细胞凋亡中起重要作用 ,两者均可通过下调bcl 2表达促进细胞凋亡。     

实时定量逆转录PCR检测慢性淋巴细胞白血病MDM4基因mRNA的表达及其临床意义

本研究旨在探讨慢性淋巴细胞白血病(CLL)患者鼠双微体4(MDM4)基因mRNA的表达情况及其在CLL预后中的意义.采用SYBRGreenⅠ荧光染料行实时定量逆转录PCR(qRT-PCR)方法检测66例CLL患者白血病细胞MDM4 mRNA的表达,以β-actin为内参照物,以2(-△Ct)方法计算MDM4的相对定量值...     

实时荧光RT-PCR检测喉鳞状细胞癌组织端粒酶逆转录酶mRNA

目的　建立一种实时荧光逆转录多聚酶链反应 (RT PCR) ,检测喉鳞状细胞癌组织人端粒酶逆转录酶 (hTERT)mRNA表达水平 ,并与传统的RT PCR进行比较。方法　采用TriZOL提取总RNA并将mRNA逆转录成cDNA ,然后利用TaqMan技术定量检测喉鳞状细胞癌组织hTERTmRNA。结果　实时荧光RT PCR检测癌组织的阳性率为 97.0 6 % ,癌旁组织的阳性率为 38.2 4 % ,差异显著 (χ2 =2 4 .2 5 ,P <0 .0 0 5 ) ,与癌旁组织比较 ,喉鳞状细胞癌组织hTERTmRNA表达水平平均上升 17.88倍 ;传统的RT PCR检测喉鳞状细胞癌组织和癌旁组织的阳性率分别为 73.5 3%和 11 77% ,均显著低于实时荧光RT PCR的阳性率 (P <0 .0 1)。结论　实时荧光RT PCR是检测喉癌组织hTERTmRNA水平的一种快速有效、灵敏度和特异性更高的方法 ,hTERTmRNA表达的上调可能是导致喉鳞状细胞癌发生的重要因素。     

短波紫外线照射对创伤局部转化生长因子β表达的影响

目的研究不同剂量短波紫外线 (UVC)照射对伤口肉芽组织中转化生长因子 β(TGF β)表达的影响。 方法UVC 15mJ/cm2 ,15s/d和 6 0mJ/cm2 ,6 0s/d分别照射大鼠背部伤口 3d ,采用免疫组化和原位杂交的方法观察伤口肉芽组织中TGF β的表达。结果致伤后照射 7天时 ,15mJ/cm2 照射组TGF β在mRNA水平与蛋白水平的表达均高于 6 0mJ/cm2 照射组和对照组 (P <0 .0 5 ) ;照射 2 1天时 ,6 0mJ/cm2 照射组TGF βmRNA表达高于 15mJ/cm2 照射组和对照组 (P <0 .0 5 )。结论在伤口愈合早期 15mJ/cm2 UVC照射能促进TGF β的表达 ,有利于组织修复 ;愈合晚期 ,6 0mJ/cm2 照射使TGF β的表达有逐渐增高的趋势     

急性胰腺炎大鼠胰腺星形细胞激活与纤维化改变的研究

目的　检测急性胰腺炎早期转化生长因子- β1(TGF - β1)信使RNA的表达,Ⅰ型胶原(Collagen -Ⅰ)以及α-平滑肌激动蛋白(α-SMA)的生成,探讨胰腺星形细胞在胰腺炎早期纤维化启动中的作用及其意义。方法　采用阻断胰腺导管同时腹腔注射雨蛙素(5 0 μg·kg-1·d-1)的方法诱导急性胰腺炎大鼠模型,假手术组施行开腹手术并腹腔注射生理盐水。分别于0、72、12 0h处死大鼠,取完整胰腺组织用免疫组化方法检测Ⅰ型胶原和α-SMA的表达,再以逆转录聚合酶链反应(RT -PCR)检测TGF - β1mRNA的表达情况。结果　假手术组大鼠胰腺组织胰腺星形细胞染色偶尔阳性,实质无明显改变,胶原染色阴性,TGF - β1mRNA无表达。模型72h组胰腺炎症改变,Collagen -Ⅰ、α-SMA检测表现胰腺间质以及腺泡周围的黄染,涉及广泛,深浅不一,较正常组变化明显;TGF - β1mRNA表达明显增强。模型12 0h组,光镜检查炎症表现更甚,间质组织增生。Collagen -Ⅰ、α-SMA表现也呈进行性进展,TGF - β1mRNA表达比较72h模型组略有降低。结论　研究表明,在急性胰腺炎早期即出现TGF - β1的激活,并刺激胰腺星形细胞(α-SMA阳性细胞)激活、增生,并使Collagen -Ⅰ逐渐生成沉积,提示胰腺的纤维化进程的启动,且随时间延长胰腺星形细胞激活逐渐增多,相关纤维化组分沉     

糖尿病患者血尿转化生长因子β1变化及其意义

目的　观察2型糖尿病患者血、尿转化生长因子-β1 (TGF -β1 )变化,探讨TGF- β1与糖尿病肾病关系及其检测的临床意义。方法　对79例2型糖尿病患者和2 0例健康人,采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验(ELASIA)同时检测血和尿中TGF β1浓度。结果　与正常对照比较,糖尿病患者血TGF β1 ( 4 5 .57±2 1 . 78vs 2 4 . 58±1 2 .6 1ng/ml)、尿TGF- β1 ( 6 1 . 6 8±35 .92vs 1 9 .89±1 3 0 6ng/mmol Cr)均增高,差异有显著意义,随肾病进展血、尿TGF- β1增高愈明显。在正常、微量和大量白蛋白尿糖尿病患者之间,血、尿TGF- β1水平存在显著差异;血TGF -β1、尿TGF -β1与2 4h尿白蛋白排泄率呈正相关(r =0 . 397,P <0 . 0 5;r =0 . 537,P <0 .0 5)。结论　糖尿病患者血、尿TGF -β1明显升高,并与糖尿病肾病进展一致。血、尿TGF- β1可以作为糖尿病肾病敏感的早期诊断指标之一。     

荧光定量逆转录聚合酶链反应检测慢性肝病患者单个核细胞中TGF-β1的表达水平

目的建立荧光定量逆转录聚合酶链反应(FQRTPCR)方法,检测慢性肝病患者外周血单个核细胞(PBMC)中TGFβ1表达水平。方法构建TGFβ1质粒克隆,以T7RNA聚合酶体外转录合成带有目的片断的cRNA作为标准品,在PCR反应体系中加入与模板互补的TaqManMGB探针建立荧光定量RTPCR,检测PBMC中TGFβ1mRNA含量,并对本方法进行方法学评价;同时检测血浆TGFβ1水平。结果重组质粒测序证明插入的片断为TGFβ1特异性片断,荧光定量RTPCR检测TGFβ1mRNA的灵敏度达6.81拷贝,线性范围为6.81～6.81×108拷贝,批内、批间变异系数分别为1.28%～2.27%和2.56%～2.61%,临床应用显示,慢性乙型肝炎中、重度患者及肝炎后肝硬化患者PBMC中TGFβ1mRNA含量及血浆TGFβ1水平均显著高于正常(P<0.05)。结论荧光定量RTPCR检测TGFβ1mRNA具有敏感、特异、快速等特点,为TGFβ1mRNA作为肝纤维化的诊断指标提供方法学依据。     

牛磺酸对扩张型心肌病大鼠左心室肌转化生长因子β_1表达的影响

目的　探讨牛磺酸对转化生长因子 β1(TGF β1)在扩张型心肌病大鼠左心室肌表达的影响。方法　将 60只大鼠分为三组 ,即正常对照组 (N组 )、扩张型心肌病模型组 (D组 )和牛磺酸治疗组 (T组 ) ,每组 2 0只 ,N组按常规喂养 ,D组在饮水中加呋喃唑酮饲养 ,T组除加呋喃唑酮饲养外同时注射牛磺酸 ,饲养 4周和 8周后分两批超声心动图检测大鼠心功能 ,病理学测量大鼠左心室内径和左心室游离壁厚度 ,HE和VG染色分别观察大鼠心肌细胞和间质胶原纤维的变化 ,免疫组化检测左心室肌TGF β1表达水平。结果　D组大鼠左心室内径增大、游离壁变薄 ,左心室收缩功能下降 ;心肌细胞肥大、间质纤维明显增生 ;左心室肌组织TGF β1表达水平明显增高 ,而T组大鼠左心室结构和功能正常 ,TGF β1表达水平较D组大鼠明显降低。结论　牛磺酸能下调扩张型心肌病大鼠左心室肌TGF β1水平 ,抑制心肌间质纤维化     

移植肾TGF-β1表达与远期肾功能关系的临床研究

【目的】探讨移植肾早期转化生长因子beta1(TGF β1)表达与移植肾远期功能的关系。【方法】2 0 0 0年 9月至 2 0 0 1年 10月 ,对 37例肾功能正常肾移植后达 1年时的患者检测了血、尿TGF β1浓度和移植肾组织TGF β1mRNA和TGF β1蛋白的表达 ,以后连续进行了至少 3年的随访。随访期内有 7例因肾功能不全诊断为慢性移植肾肾病 (CAN)。将上述 37例患者的尿TGF β1浓度与各自移植肾内TGF β1的表达量以及 3年后的肾功能作相关性分析 ;将 7例CAN患者与 30例非CAN(N CAN)患者的血、尿TGF β1浓度分别进行比较。【结果】肾移植患者于术后达 1年时 ,尿TGF β1浓度与移植肾内TGF β1的表达 (TGF β1mR NA、TGF β1蛋白 )以及 3年后肌酐清除率 (CCr)之间有显著的相关性 (均P <0 .0 1) ;CAN与N CAN患者于肾移植达 1年时血TGF β1浓度分别为 :(39.1± 11.7)和 (38.7± 12 .0 )ng/ml,两者差异无显著性 (P >0 .0 5 )、尿TGF β1浓度分别为 :(371.6± 73.5 )和 (192 .7± 88.2 ) pg/ (mg .Cr) ,两者有显著差异 (P <0 .0 1)。【结论】尿TGF β1与CAN的发生有着密切的关联 ;尿TGF β1与肾TGF β1的分泌有关 ;肾移植后早期尿TGF β1浓度明显升高的患者 ,远期肾功能差。     

ROX参比荧光在实时荧光定量RT-PCR检测Nrf2mRNA中的应用

目的 建立大鼠Nrf2 mRNA实时荧光定量RT-PCR检测方法,评价ROX参比荧光在其分析中的归一化校正作用.方法 采用Taq Man探针法构建大鼠Nrf2 mRNA实时荧光定量RT-PCR检测方法;取大鼠混合cDNA的Nrf2 PCR产物,经凝胶电泳和测序鉴定反应特异性;取PCR标准品10个浓度梯度(2.0×109～2.0×100)各1份进行实时荧光定量RT-PCR检测,分析ROX参比荧光校正与否的标准曲线的线性范围的变化;取高、中、低值重组质粒样本各1份进行批内重复20次和批间连续20次实时荧光定量RT-PCR检测,分析ROX参比荧光校正与否的批内、批间重复性差异.结果 成功建立大鼠Nrf2 mRNA实时荧光定量RT-PCR检测方法;大鼠混合cDNA的Nrf2 PCR扩增片段与预期122 bp相符,测序结果扩增片段序列正确,PCR特异性好;标准品PCR扩增结果的标准曲线线性范围未经ROX参比荧光校正为2.0×109～2.0×102拷贝/μl(R2＞0.99),校正后为2.0×109～2.0×100拷贝/μl(R2＞0.99),校正后线性范围变宽100倍.高、中、低值样本重复性分析结果显示未经ROX参比荧光校正批内Ct变异系数(CV)为4.1%、2.7%、2.1%,批间CV为4.3%、3.0%、2.4%,校正后批内CV为0.7%、0.5%、0.4%,批间CV为1.0%、0.8%、0.7%,ROX参比荧光校正后样本Ct离散程度均低于未校正组,批内、批间的高值、中值浓度样本(高值组批内和批间t值分别为4.843、2.566,中值组批内和批间t值分别为4.293、4.423,P均＜0.05),但低浓度组的Ct离散度的差异无统计学意义(低值组批内和批间t值分别为0.753、1.279,P均＞0.05).结论 在构建大鼠Nrf2实时荧光定量RT-PCR检测方法中,加入ROX参比荧光,可加宽PCR标准曲线的线性范围,提高检测重复性,为准确分析大鼠模型Nrf2 mRNA表达水平奠定了基础.     

巢式实时荧光定量PCR检测RA患者外周血单个核细胞TGF-βRⅡmRNA

目的建立检测人外周血单个核细胞(PBMC)中转化生长因子βⅡ型受体(TGF-βRⅡ)mRNA实时荧光定量PCR方法,并探讨其在RA中的临床意义。方法跨内含子设计外引物,并根据扩增片段,设计一对内引物,采用巢式实时荧光定量PCR(nested-real-time-PCR)方法。首次扩增采用减少引物、酶浓度、及循环次数的方法保持扩增片段的高度特异性,再进行第二次PCR扩增作实时荧光定量检测,同时以β-actin作内参,二者比值作为TGF-βRⅡ表达水平指标。结果Ct值和模板起始浓度对数值之间具有良好的线性关系(r2=0.999);检测最低浓度可达101拷贝。RA患者组和健康对照组的TGF-βRⅡ与β-actin的比值分别为0.45±0.11和0.37±0.10,两者有显著差异(P<0.01);RA治疗前、后两者比值分别为0.46±0.11和0.40±0.11,治疗后下降13.0%。结论巢式实时灾光定量PCR检测PBMC中TGF-βRⅡmRNA的方法简便,特异,重复性好,可信度高,其表达水平对RA具有一定的诊断价值,并可作为评价该病治疗效果的一种方法。     

TaqMan实时荧光定量逆转录聚合酶链反应检测新型趋化因子巨噬细胞炎症蛋白-2γmRNA表达水平

目的　建立TaqMan实时荧光定量逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)法检测新型趋化因子巨噬细胞炎症蛋白 2γ(MIP 2γ)mRNA表达水平 ,并对方法进行评估。方法　TaqMan实时荧光定量RT PCR检测MIP 2γmRNA的表达。结果　线性检测范围达 6个数量级 ,最低检测下限为 6× 10 2 拷贝 ,最高检测上限为 6× 10 7拷贝 ,批间及批内变异 <12 2 %。正常Balb/c小鼠心脏、肝脏、肾脏组织均可检测到MIP 2γmRNA表达 ,以心脏表达水平最高。结论　采用TaqMan实时荧光定量RT PCR检测MIP 2γmRNA表达水平准确、特异、灵敏、快速、操作简便 ,具有临床推广价值。     

荧光定量逆转录-聚合酶链反应检测白血病bcr/abl mRNA

目的　建立荧光定量RT PCR法检测白血病融合基因bcr ablmRNA的方法 ,为白血病临床诊断及微量残留病监测提供有用工具。方法　RT PCR扩增培养的K5 6 2细胞bcr abl融合基因 ,A T载体克隆法构建定量标准模板 ,用PE770 0型检测仪 ,建立荧光定量RT PCR方法 ,对方法的灵敏性、稳定性、重复性进行测定 ;定量检测 14例慢性髓细胞白血病 (CML)患者和 4例急性淋巴细胞白血病(ALL)患者外周血样本。结果　建立的荧光定量RT PCR方法 ,可检测出约 10 - 5μgK5 6 2总RNA中的bcr abl融合基因和 10个bcr abl重组质粒拷贝 ,重复性的CT值 (Cyclethreshold)管间、批间变异系数 (CV)分别为 :2 0 % ,3.7%。 14例CML患者bcr abl融合基因表达量中位数为 5 .15× 10 4 拷贝 μgRNA ,产物经电泳分析 ,其中 11例为b2a2 ,3例为b3a2 ,1例 12× 10 4 拷贝 μgRNA的CML患者 ,骨髓移植后 1个月变为 0 .2 3× 10 4 拷贝 μgRNA。 4例ALL患者中 1例有bcr abl融合基因的表达 ,为b2a2 ,表达量为 8.2×10 5拷贝 μgRNA。 结论　建立的荧光定量RT PCR方法灵敏、特异、重复性好 ,结果用拷贝数表示 ,准确可靠 ,利于统一标准。该方法能检测出b2a2、b3a2两种类型的融合基因 ,可广泛用于CML的诊断和微量残留病的检测     

分子信标荧光定量PCR检测结核分枝杆菌的反应体系优化方法对比研究

目的建立分子信标荧光定量PCR检测结核分技杆菌的最佳反应体系,探讨影响分子信标荧光定量PCR扩增结果的多个因素。方法利用单因素法和正交实验法,从MgCl2,引物,分子信标探针,dNTP,Taq DNA聚合酶5种因素对分子信标荧光定量PCR反应体系进行优化,并对这两种方法所得的最优体系进行比较。结果单因素法得到的最优反应体系（25μl）为：4mmol／L MgCl2,上、下游引物各0．3μmol／L,分子信标探针0．1μmol／L,200μmol／L dNTP,2U Taq DNA;正交法得到的最优反应体系（25μl）为：6mmol／L MgCl2,上、下游引物各0．2μmol／L,分子信标探针0．1μmol／L,100μmol／L dNTP,3U Taq DNA聚合酶,正交法得到的最优反应体系的荧光定量PCR扩增曲线形状更好,Q值较小,△Rn较大。结论采用正交法得到的荧光定量PCR反应体系优于单因素法,进行实时荧光定量PCR反应体系优化时,正交实验设计是一条科学、可靠、高效、快捷的途径。     

SYBR Green Ⅰ Real time PCR检测胃癌组织中LIN28基因方法的建立

目的 建立SYBR Green Ⅰ荧光染料实时定量PCR方法,测定LIN28基因在胃癌组织中的表达水平,并进行实验室方法学评价.方法 采用RT-PCR扩增LIN28 基因片段 ,将该片段克隆到质粒载体PMD18-T上, 转化入大肠埃希氏菌(DH5a)中,PCR鉴定后,提取重组质粒,以阳性质粒为模板,建立SYBR-Green I荧光定量PCR标准曲线,以β-actin为内参,运用Rotor-Gene 6000series software做相对定量分析,检测30例胃癌患者的癌组织中LIN28的表达水平.结果 用重组质粒制作的标准曲线循环阈值与模板浓度有良好的线性关系,内参β-actin和LIN28标准曲线相关系数分别为0.999 7和0.999 1,其最低的检测拷贝数为1,LIN28溶解曲线呈单个特异峰.结论 成功地构建了LIN28的原核表达载体.建立的SYBR Green Ⅰ荧光染料实时定量PCR法特异度、敏感度高,稳定性好,可用于定量测定胃癌组织中LIN28的表达水平.     

荧光定量RT—PCR实时检测心脏移植患者外周血单核细胞16种免疫排斥基因整体表达变化的初步研究

目的探讨外周血单核细胞免疫排斥相关基因的检测对心脏移植排斥反应的诊断价值。方法采取心脏移植术患者外周血，应用实时荧光定量RT-PCR技术，观察心脏移植术后不同时期外周血单个核细胞中与免疫排斥相关多个基因系统的mRNA表达水平，并与术前和正常组的基因表达水平对照。结果心脏移植术前外周血单个核细胞16种与免疫排斥相关候选基因的mRNA的相对表达量与正常对照组比较差异无统计学意义（P〉0．05）。初步筛选出与机体免疫排斥状态有更大相关性的7种基因，术后3个月内心脏功能稳定组较术前和正常对照组ITGA4、FKB、ILlR-2mRNA表达水平上调，PF4、ITGAM、TGFβ1、RHOU表达水平降低。这与临床观察的移植术后1～3个月免疫排斥概率最大相吻合。结论检测外周血单个核细胞基因mRNA表达水平的荧光定量RT—PCR方法简便快速、特异、重复性好、可信度高，但在检测心脏移植排斥反应方面值得进一步深入研究。     

大鼠脊髓Ⅰ型白细胞介素1受体mRNA定量检测方法的建立

目的:建立一种方便可靠的方法定量检测大鼠脊髓Ⅰ型白细胞介素1 受体mRNA。方法:实验于2004-09／2005-01在南通大学基因诊断实验室和上海第二医科大学神经生物学实验室完成。雌性SD大鼠15只。随机分为5组, 正常对照组3只,脊髓损伤4 h组3只,脊髓损伤4 h假手术组3只,脊髓损伤24 h组3只,脊髓损伤24 h假手术组3只。利用LightcCycler荧光定量聚合酶链反应仪和荧光染料SYBR green Ⅰ对聚合酶链反应条件进行优化后,对用重物坠落诱导的脊髓损伤模型大鼠的脊髓组织中Ⅰ型白细胞介素1受体mRNA进行实时荧光聚合酶链反应,通过标准曲线法进行绝对定量分析或通过比较Ct(△△Ct)法进行相对定量分析。结果:15只大鼠均进入结果分析。①聚合酶链反应特异性:熔点曲线分析和琼脂糖凝胶电泳表明每个聚合酶链反应都获得了特异性的扩增产物。②聚合酶链反应扩增线形与效率:该方法能够检测到最低100个拷贝的模板,对含有1 000或更多拷贝模板的常规检测可获得较好的定量数据。Ⅰ型白细胞介素1受体和次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶的扩增效率分别是0．962,0．973。③定量计算公式的有效性:以cDNA稀释倍数对数值为X轴,以相应目的基因和看家基因的ΔCt为Y轴得到直线的斜率为0．084,可以应用公式2-ΔΔQ。④初步应用:脊髓损伤4 h,24 h后其Ⅰ型白细胞介素1受体mRNA表达水平分别有2．6倍(P<0．05)和 7．8倍的增加(P<0．01)。结论:应用SYBRgreen Ⅰ实时荧光定量方法具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点,非常适合于对表达低水平Ⅰ型白细胞介素1受体mRNA的组织进行定量分析。