扎伊尔型埃博拉病毒型特异性标签序列鉴定及其荧光定量PCR检测

目的 建立一种快速准确检测扎伊尔型埃博拉病毒(Zaire ebola virus,ZEBOV)的方法.方法 以2014年西非新分离的3株ZEBOV全基因组参考序列及1976年从Mayinga分离的ZEBOV株(NC_002549)为目标,基于Insignia系统算法与GenBank中Nt库比对,求出ZEBOV特异性核酸标签序列.设计引物、TaqMan探针和优化反应条件,以10倍系列稀释的阳性质粒做标准曲线,做准确性、重复性实验.并以其余4个亚型的埃博拉病毒、马尔堡病毒、西尼罗河热病毒、东方马脑炎病毒、西方马脑炎病毒等8种病毒对照及临床48例患者复杂样本为对照做特异性检测.结果 选择比对得到的特异性标签序列(KJ660348,11331-11514)设计探针引物,标准曲线相关系数＞0.99,灵敏度可达5×101拷贝.准确性重复性实验结果批内变异系数(CV)为0.88％～ 2.50％、批间CV为1.75％ ～3.31％.8种病毒及临床48例患者复杂样本对照均为阴性.结论 ZEBOV核酸标签(KJ660348,11331-11514)在非编码区,在此基础上建立的荧光定量PCR方法可特异性检测ZEBOV,且灵敏、重复性好.     

猴免疫缺陷病毒(SIV)实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立快速、敏感、特异的猴免疫缺陷病毒(SIV)TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法,对SIV病毒核酸进行定量检测。方法 RT-PCR扩增SIVmac251保守gag基因序列796 bp片段,进行TA克隆,构建标准品质粒pMD-SIVgag。通过对SIV定量外标准品的定量分析,优化反应体系,检测TaqMan探针实时荧光定量PCR方法的灵敏度、特异性和重复性。结果所建立的SIV QPCR检测方法,质粒DNA模板在107～102拷贝之间表现较好线性和相关性,标准曲线所得斜率为-3.26,相关系数为0.999。检测灵敏度达到200拷贝,方法重复性测试,检测25份临床样品CV%均小于1%。结论建立的SIV QPCR检测方法特异性、敏感性高,稳定性好,可用于定量测定猴免疫缺陷病毒(SIV)核酸拷贝量。     

猫疱疹病毒Ⅰ型实时荧光定量PCR方法的建立及初步应用

目的建立猫疱疹病毒I型(FHV-1)实时荧光定量PCR检测方法,应用于实验用猫及临床患猫FHV-1的快速检测。方法根据已发表的FHV-1 TK基因序列设计特异引物和Taq Man探针,使用分子生物学方法制备质粒标准品,建立FHV-1实时荧光定量PCR方法,并对方法的线性、特异性、敏感性、及稳定性等进行测定。用建立的方法对48份猫临床样品进行检测。结果成功建立FHV-1实时荧光定量PCR方法;该方法的线性范围为(1×102~1×109)copies/μL,与单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-1)、犬疱疹病毒(CHV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猫细小病毒(FPV)均无交叉反应,检测灵敏度可达到10 copies/μL。批内变异系数均小于5%。应用该方法从48份猫临床样本中检测出33份FHV-1核酸阳性。结论建立的FHV-1PCR检测方法具有特异、敏感及稳定的特点,适合于临床FHV-1的快速定量检测。     

埃博拉病毒核酸快速检测技术应用及展望

埃博拉病毒(EBOV)是引起人类及哺乳动物高致死性出血热的病原体,2013~2014年已引起了严重的西非埃博拉出血热。快速检测确证病原对于防止疾病的进一步扩散至关重要。目前,实时荧光定量PCR技术及环介导等温扩增技术(LAMP)已经应用于EBOV的核酸快速检测,依赖核酸序列的扩增技术(NASBA)及重组聚合酶扩增技术(RPA)有望成为EBOV新型核酸快速现场检测技术。本文对几种核酸快速检测方法进行综述。     

埃博拉病毒病之病原学

埃博拉病毒病(Ebola virus disease,EVD),以往称埃博拉出血热(Ebola haemorrhagic fever,EHF),是迄今发现的凶猛烈性传染病之一。自1976年发现于非洲的扎伊尔和苏丹后,至今已有8次较大规模的人群流行,均发生在非洲,平均病死率高达67.98%。EVD的病原体埃博拉病毒(Ebola virus,EBOV)是一种人兽共患病原体,虽然其自然储存宿主尚不完全清楚,但EBOV能造成非人灵长类动物(如黑猩猩、猴等)感染,并具有致死性。EBOV在分类上属于丝状病毒科(Filoviridae)的埃博拉病毒属(Ebolavirus),属内有5个种。各种间的毒力存在差异,以扎伊尔埃博拉病毒(Zaire-EBOV)致病性最强,也是引起2014年西非大规模流行的元凶。EBOV呈丝状,形态多样,以长丝分枝状为常见;病毒体由核心、核衣壳和包膜3部分构成,病毒基因组为单股负链RNA,可编码7种结构蛋白,在病毒复制、感染和致病中发挥重要作用。EBOV主要通过接触传播,目前对其致病机制尚不完全清楚。EBOV为生物危害度最高的4级病原体,与活病毒相关的检验和实验必须在生物安全4级(BSL-4)实验室中进行,其感染的临床诊断以检测血清中抗体、抗原和核酸为主,实时荧光定量反转录PCR检测阳性可作出诊断。EVD尚无特效治疗方法,疫苗尚在研制之中,临床上以辅助性支持疗法为主。     

柯萨奇B组3型病毒SYBR Green Ⅰ RT-PCR 检测方法的建立

目的 建立一种灵敏、特异的柯萨奇B组3型(CV-B3)病原SYBR Green Ⅰ RT-PCR实时荧光定量检测方法,用于快速、准确地检测CV-B3。方法 设计柯萨奇B组病毒通用引物以及VP1基因的T7启动子特异性引物,以体外转录获得的RNA为标准品,绘制标准曲线,建立CV-B3的荧光定量PCR检测方法;对检测方法的敏感度、特异性、重复性进行评价。结果该检测方法在10～10⁹ 拷贝/微升范围内具有良好的扩增效率和线性关系,最低检测限为10拷贝/微升,标准曲线r2=0.999, 扩增效率为95.7%;且对柯萨奇病毒A组6型(CV-A6)、柯萨奇病毒A组10型(CV-A10)、肠道病毒71型(EV-71)均无交叉反应,重复性实验变异系数(CV%)<2%。结论 本实验建立的检测方法敏感度较高,同时具备良好的特异性及重复性,可用于CV-B3病原的临床及实验室样本的定性定量检测。     

荧光定量PCR与免疫荧光法定量定性检测牛血清中呼肠孤病毒

目的采用TaqMan荧光探针定量PCR技术与免疫荧光技术定量定性检测牛血清中呼肠孤病毒。方法以携带有Reovirus保守系列的重组质粒作为标准品,优化定量PCR体系,建立标准曲线,用Vero细胞培养不同病毒评价方法的特异性;用FITC标记的抗Reovirus病毒蛋白单克隆抗体对感染不同滴度Reovirus的Vero细胞培养物进行直接免疫荧光检测,用Vero细胞培养不同病毒评价方法的特异性。结果 Taq Man Real-time PCR方法检测灵敏度可达1.0×102拷贝/l,线性范围为109～103;免疫荧光法对Reovirus检测具有很高的特异性。结论以TaqMan荧光探针检测Reovirus荧光定量PCR方法,灵敏度高、特异性强,辅以免疫荧光定性检测方法,可以作为牛血清感染Reovirus的定量和定性检测。     

鹅源星状病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

目的建立一种可快速诊断鹅源星状病毒的荧光定量PCR方法。方法分析比对NCBI下载的鹅源星状病毒全基因组序列,在其ORF1a保守区设计一对特异性引物及Taq Man探针,优化反应条件,建立标准曲线,并验证其特异性,敏感性和稳定性。结果该方法最低检测线限为1.50×10²copies/μL,批内和批间检测变异系数分别小于0.5%和4%,且对其他常见水禽病毒无特异性扩增。临床应用结果显示检出率明显高于常规RT-PCR方法。结论建立了一种鹅源星状病毒的Taq Man荧光定量PCR方法,该方法特异性强,灵敏度高且重复性良好,适用于鹅源星状病毒的早期检测和定量分析。     

H7N9禽流感病毒实时荧光RT-PCR检测方法的建立与评价

目的应用Taq Man探针实时荧光RT-PCR技术,建立一种快速检测H7N9禽流感病毒的方法。方法针对H7N9禽流感病毒的HA和NA基因分别设计特异性引物和Taq Man-LNA探针,建立H7N9禽流感病毒特异性实时荧光RT-PCR快速检测方法。结果本研究建立的方法对检测H7N9禽流感病毒株的灵敏度达到10 PFU/ml。该方法特异性强,与其他亚型流感病毒株及呼吸道病原体无交叉反应。与对照方法相比,本研究方法的检测阳性符合率为99.07%,阴性符合率为100%,Kappa值为0.993。结论建立的检测试剂盒具有快速灵敏、结果准确可靠等优点,适用于H7N9禽流感病毒的分子生物学检测和监测。     

基孔肯雅病毒定量反转录聚合酶链式反应绝对定量检测方法的建立

目的 建立检测基孔肯雅病毒实时荧光定量RT-PCR快检方法，为其实验室诊断与定量分析提供技术方法。方法 基于基孔肯雅及其相近虫媒病毒基因组序列的系统比对分析，筛选、鉴定基孔肯雅病毒特异性核酸序列，并以人GAPDH基因为内参照，设计引物、探针，采用L₉(3⁴)正交实验确定最佳反应条件，建立基于TaqMan探针法的基孔肯雅病毒qRT-PCR快检方法，并详细分析所建立方法的灵敏度、特异度、重复性及覆盖面。以克隆的检测靶标核酸片段为阳性品，制作标准曲线，建立绝对定量方法。结果 经系统优化，建立了基孔肯雅病毒实时荧光定量RT-PCR定性、定量检测方法，反应体系包括：基孔肯雅病毒、GAPDH内参照检测引物探针，RT/Taq酶混合液，反应缓冲液及阴阳性参考品。所建立方法与ECSA亚型ROSS株、IOL分支LR2006株，亚洲型181/25株以及2010东莞流行株均可获得阳性结果，而与所试其他18种黄病毒、甲病毒、布尼安属相近虫媒病毒无交叉反应，检测下限为580拷贝/mL。定量分析表明，在5.80×10²～5.80×10^10<...     

埃博拉出血热及埃博拉病毒的研究进展

埃博拉病毒可以引起一种人畜共患烈性传染病,即埃博拉出血热,此病于1976年始发于埃博拉河流域,并且于该区域严重流行,故而得名。人类一旦感染埃博拉病毒,死亡率可高达88%,从而引起医学界的广泛关注,世界卫生组织已将埃博拉病毒列为对人类危害最为严重的病毒之一。深入地了解埃博拉出血热及埃博拉病毒,及其致病机理,对于埃博拉出血热的预防和控制具有非常重要的意义。     

埃博拉病毒病——病死率极高的人畜共患病

埃博拉病毒病是由埃博拉病毒感染引起人和灵长类动物的一种以发热和出血为主要临床特征的烈性传染病。本病于1976年首次发现于非洲的扎伊尔和苏丹地区,此后在非洲造成多次大规模流行,其中2014—2016年西非暴发的疫情是有史以来规模最大、最复杂的埃博拉疫情,导致的病例和死亡人数超过了历次疫情病例和死亡人数的总和,截至2022年共报告约3.5万例埃博拉病毒病病例,死亡约1.5万例。埃博拉病毒病在非洲大流行期间还外溢至美洲和欧洲等非洲大陆以外地区,成为世界关注的公共卫生问题。2022年在非洲乌干达和刚果共和国再次出现该病流行,引起了全世界的广泛关注。本文对埃博拉病毒病的历史、流行病学分布、病毒感染途径、患者临床症状、诊断、治疗以及预防与控制等方面进行系统总结,为国内相关工作者提供参考。     

The Ebola virus: a review of progress and development in research

The Ebola virus was identified in the year 1976 and has caused periodic outbreaks in West African countries. The disease has a case fatality rate up to 90%. Ebola has been classified as a biosafety level four pathogen and there is no currently approved vaccine or treatment for the virus. However, remarkable progress has been demonstrated by researchers in understanding the pathogenicity of the Ebola virus. Several animal models have been cultivated to develop diagnostics, vaccines and therapeutic drugs.     

浅析埃博拉病毒致病机制

埃博拉病毒（Ebola virus,EBOV）属于丝状病毒科的单股负链RNA病毒,人体感染后可导致致命的埃博拉病毒病（Ebola viral disease,EVD）。当前EBOV广泛流行于非洲大陆,传染性强、致死率高、曾造成多次大暴发,严重威胁着疫区人们的健康和生命。然而目前EBOV的致病机制尚不明确,本文仅就EHF发病机制的最新进展做一综述,供广大同行参考。     

华北地区埃博拉病毒莱斯顿亚型的流行病学调查

目的 了解华北地区埃博拉病毒莱斯顿亚型的分布和流行情况, 为埃博拉病毒病的防控提供理论依据。方法 采集华北地区动物园及养殖场的多种哺乳动物血清, 对其进行埃博拉病毒莱斯顿亚型的检测。结果 采集各种哺乳动物血清共109份, 经Real-time PCR方法检测未检出阳性样品。结论 埃博拉病毒尚未在华北地区流行, 应加强对埃博拉病毒病的知识宣传, 并做好安全防护工作。     

Key features of Ebola hemorrhagic fever: a review

The current outbreak of Ebola virus in West Africa has become a devastating problem, with a mortality rate around 51%; over 3 132 deaths have been confirmed and even more are expected in this case. The virus causes a characteristic disease known as hemorrhagic fever. Its symptoms range from nonspecific signs such as fever, to more specific problems such as serious bleeding. Transmission occurs easily when a person comes in contact with contaminated fluids. Treatment is supportive because there are still no specific drugs for use. The present review focuses on the main features related to the Ebola virus, its transmission, pathogenesis, treatment and control forms. There is little in-depth knowledge about this disease, but its severity requires attention and information to prevent a worse scenario than the current.     

实验室检测埃博拉病毒对诊疗的临床意义

【】目的 分析中国人民解放军援利埃博拉诊疗中心(China Ebola Treatment Unit, China ETU),实验室检测结果对埃博拉阳性患者诊疗的临床意义。方法 在2014年11月14日至2015年3月15日期间,中心共收治住院患者101例,送检172份标本,通过实验室RT-PCR检测病毒RNA及CT值。结果 共有10例埃博拉阳性患者,死亡4例,治愈6例,4例死亡病例中,PCR CT值均较低,表明其体内病毒载量较高,在6例治愈病例中,随着病情的好转,其埃博拉病毒核酸PCR CT值逐渐升高,表明病毒载量逐渐降低。结论 实验室检测结果及PCR CT值为临床诊断、治疗提供了指导意义。     

抗埃博拉病毒小分子抑制剂的研究进展

埃博拉病毒(EBOV)是导致人和灵长类动物发生埃博拉出血热的烈性RNA病毒,感染者死亡率极高。目前临床上对于EBOV感染以支持治疗为主,尚无经系统临床验证有效的特异性治疗手段。处于研发阶段的抗EBOV药物主要包括小分子抑制剂、蛋白和核酸等三大类,其中小分子抑制剂类药物的种类最多,作用机制最为多样。本文针对EBOV的感染复制周期中的病毒及宿主靶标,总结了临床前和处于临床试验阶段的抗EBOV小分子抑制剂的研究进展。     

埃博拉病毒的防治进展

2014年2月,埃博拉病毒在西非爆发,短短几个月内蔓延至多国,引起世界卫生组织的高度关注。目前还没有有效的针对
埃博拉病毒感染的防治疫苗及药物。本文综述了埃博拉病毒的流行情况,生物学特性,可能的药物靶点以及研究中的疫苗和药
物,期望对埃博拉病毒的防治研究进展有一个较全面的认识。