缺氧时视网膜血管内皮细胞HIF-1α的表达与细胞内ATP含量的相关性研究

目的探讨在缺氧状态下视网膜血管内皮细胞缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)的表达及其与细胞内ATP含量的相关性。方法对体外分离的牛视网膜血管内皮细胞分别进行常规和CoCl2模拟缺氧培养,采用免疫组化法检测HIF-1α的表达,生物荧光法检测细胞ATP含量,分析HIF-1α的表达与ATP含量的相关性。结果正常对照组HIF-1α有极低表达,在缺氧1h时表达量显著上升,4h达到高峰,16h后下降。与对照组比较,各缺氧组HIF-1α的表达差异均有显著性(P<0.01)。HIF-1α的表达与细胞内ATP含量显著正相关(P<0.01)。结论视网膜血管内皮细胞在缺氧早期HIF-1α表达有短暂、迅速的增加,其表达与细胞增殖有关。     

高糖和缺氧对体外培养视网膜M üller细胞VEGF表达的影响

目的 :观察体外培养兔视网膜 Müller细胞在高糖和缺氧条件下血管内皮生长因子( vascular endothelial growth factor,VEGF)表达的变化。方法 :采用免疫细胞化学、原位杂交和ELISA方法对高糖和缺氧条件下体外培养兔视网膜 Müller细胞 VEGF的表达进行定性定量测定。结果 :高糖能刺激 VEGF表达 ,且通过转录水平调节 ,这种调节呈时间和剂量依赖性。 Co Cl2 能造成 Müller细胞不完全缺氧 ,刺激 VEGF的分泌。结论 :Müller细胞在高糖、缺氧条件下 VEGF表达增强 ,VEGF表达水平的升高可能是高糖及缺氧条件下促进糖尿病视网膜病变的因素之一。     

缺氧条件下视网膜微血管内皮细胞中缺氧诱导因子1和血管内皮生长因子m RNA表达的研究

目的 探讨视网膜微血管细胞在缺氧过程中缺氧诱导因子1(HIF1）和血管内皮生长因子(VEGF)基因mRNA水平表达的变化。方法视网膜微血管细胞(RECs)分别在正常氧、缺氧3h不同条件下培养后，应用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法半定量测定HIF1a和VEGF基因的mRNA水平的表达。结果缺氧组RECs HIF1基因的mRNA水平表达为对照组的4．6倍。同时缺氧组RECs细胞的VEGF基因的mRNA水平表达为对照组的3倍。结论缺氧能引起视网膜微血管细胞的HIF-1及VEGF基因mRNA水平高表达，提示缺氧可能通过HIF1基因的转录途径来诱发VEGF基因的高表达导致视网膜新生血管形成。     

血管抑素体外对兔视网膜微血管内皮细胞增生的抑制

目的 观察血管抑素对体外培养的兔视网膜微血管内皮细胞生长的抑制作用及对细胞外信号调节蛋白激酶1(ERK-1)活化的影响。方法 利用L-Lysine耦联的Sepharose 4B亲和层析柱从血浆中分离和纯化血管抑素。原代培养兔视网膜微血管内皮细胞，MTT法检测不同浓度的血管抑素对其生长的抑制作用，Western blot检测血管抑素对血管内皮细胞生长因子刺激的视网膜微血管内皮细胞ERK-1水平的影响。结果 血管抑素在体外能显著抑制视网膜微血管内皮细胞增生，其ED50约为160μg／ml。VEGF刺激兔视网膜微血管内皮细胞后，ERK-1被迅速激活，而血管抑素能使其表达量降低35．6％。结论 血管抑素有望成为极有临床价值的防治视网膜新生血管形成的新药。     

PKC信号传导通路对缺氧人视网膜色素上皮细胞表达VEGF的作用

目的 :探讨蛋白激酶C(PKC)信号传导通路对缺氧状态下培养的视网膜色素上皮 (retinalpigmentepithelium ,RPE)细胞表达VEGF的作用 .方法 :在缺氧状态下分别培养人RPE细胞 6 ,1 2和 2 4h ;将不同浓度的PKC激动剂佛波醇 1 2 豆蔻酰 1 3乙酸 (phorbol 1 2 myristate 1 3 acetate,PMA)及PKC抑制剂Chelerythrine分别加入人RPE细胞培养液 ,在缺氧状态下培养 2 4h .用免疫组化方法检测各组RPE细胞中VEGF的表达 ,经计算机图像处理 ,定量分析 .结果 :在缺氧状态下 ,RPE细胞对VEGF的表达较非缺氧组RPE细胞显著增加 (P <0 .0 1 ) ;较对照组 ,PMA可增强缺氧状态下RPE细胞VEGF的表达 (P <0 .0 1 ) ,Chelerythrine则减弱VEGF的表达 (P <0 .0 1 ) .结论 :缺氧诱导VEGF在RPE细胞中的表达 ,其信号传导途径部分是通过PKC通路实现的     

缺氧对Müller细胞水通道蛋白4及血管内皮生长因子的影响

目的:观察缺氧条件下,体外培养的人视网膜Müller细胞上水通道蛋白4(AQP4)和血管内皮生长因子(VEGF)的表达情况。方法:酶消化法培养人视网膜Müller细胞,免疫荧光和透射电镜进行细胞鉴定,CoCl2诱导细胞缺氧,RT-PCR测定视网膜Müller细胞AQP4和VEGF基因的表达。结果:免疫荧光显示95%以上细胞谷氨酰胺合成酶、神经胶质纤维酸性蛋白、α-平滑肌肌动蛋白、中间丝波形蛋白呈阳性。Müller细胞AQP4 mRNA和VEGFmRNA的表达在缺氧条件下均升高,VEGF更明显,且呈部分浓度和时间相关性。缺氧12 h时VEGF mRNA表达达高峰,24 h时AQP4 mRNA达高峰。结论:AQP4和VEGF均与缺氧时的细胞水肿有关,二者关系密切,VEGF的作用较早且强。     

川芎嗪对缺氧时视网膜血管内皮细胞ATP分泌的影响

目的探讨川芎嗪对缺氧牛视网膜血管内皮细胞中ATP含量的影响。方法用酶消化法分离牛眼视网膜血管内皮细胞,进行形态学的观察并用Ⅷ相关免疫组化法鉴定。取3代的细胞用于实验。细胞分组：取常规培养的第3代细胞,分为5组：正常对照组（F12培养基常规培养）,缺氧组（加入终浓度125μmmol/L的CoCl2）和缺氧加药物组（加入含20、40、120μg/ml川芎嗪）。免疫组化法和生物荧光法分别检测川芎嗪对CoCl2诱导的缺氧的牛视网膜血管内皮细胞中ATP含量。结果缺氧BREC细胞ATP含量增加,而川芎嗪可减少缺氧引起的ATP浓度升高,且呈剂量依赖性。当川芎嗪浓度为20μg/ml时,其ATP含量水平已显著下降（P〈0.01）。结论川芎嗪可减少缺氧诱导的血管内皮细胞ATP含量增加。     

HIF-1α反义寡核苷酸脂质体的制备和对视网膜血管内皮细胞HIF-1α表达的影响

目的应用HIF-1αASODN处理牛眼视网膜微血管内皮细胞,观察细胞摄取ASODN的情况和对缺氧时细胞HIF-1α表达的影响.方法对分离的牛视网膜血管内皮细胞进行HIF-1α反义寡核苷酸的转染,CoCl2模拟缺氧培养,采用免疫组化检测不同缺氧时间HIF-1α的表达.结果硫代化修饰的标有FAM的HIF-1α反义寡核苷酸能被Lipofectin转染进BREC细胞.转染6 h后,在荧光显微镜下可观察到细胞内的绿色荧光斑.计算细胞转染率为(93.8±3.4)%.未转染组开始时HIF-1α有极低表达,在缺氧1 h时表达量显著上升,4 h达到高峰,16h后下降.而ASODN转染组HIF-1α的表达始终在极低水平,两组间有显著性差异(P＜0.01).结论以脂质体为载体能高效率地将HIF-1αASODN转染至视网膜血管内皮细胞内,明显抑制HIF-1α蛋白质的表达,这可能为HIF-1αASODN用于视网膜新生血管的治疗提供理论依据.     

缺氧条件下谷氨酸对鼠脑星形胶质细胞血管内皮生长因子表达的影响

目的观察谷氨酸在缺氧条件下对星形胶质细胞血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。方法原代培养SD大鼠星形胶质细胞,传代后分为4组:①对照组;②谷氨酸组(1μmol/L);③缺氧组;④缺氧+谷氨酸组。缺氧条件为:(94%N2,5%CO2和1%O2),每组包括6个时相点:0、2、4、6、8、12h(以缺氧后开始计时),②和④组加入1μmol/L的谷氨酸。在不同时间点提取细胞总RNA,用Real time FQ-PCR法检测VEGF mRNA表达变化;ELISA法检测培养上清液VEGF蛋白表达变化。结果对照组和谷氨酸组(1μmol/L)各实验时相点星形胶质细胞VEGF mRNA和蛋白表达无明显变化。而缺氧组和缺氧+谷氨酸组VEGF mRNA和蛋白表达却随实验时相逐步增高,分别在6和8h达最高,之后渐下降。缺氧+谷氨酸组VEGF mRNA和蛋白表达上调较单纯缺氧组更为显著。结论谷氨酸(1μmol/L)可在缺氧条件下增强星形胶质细胞VEGF mRNA和蛋白表达上调,这可能与缺氧状态下星形胶质细胞表面谷氨酸受体的表达变化有关。     

体外诱导成人外周血干细胞向血管内皮细胞分化

目的研究人外周血干细胞(PBSC)向血管内皮细胞分化。方法以血管内皮细胞生长因子(VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对经重组人粒细胞集落刺激因子刺激后采集的PBSC进行诱导培养,观察细胞形态的变化,运用流式细胞术检测诱导后的细胞表达CD31和vWF情况,并用透射电镜观察细胞的超微结构。结果经VEGF和bF-GF诱导后的细胞形态上表现内皮细胞特征,经流式细胞仪测定表达血管内皮细胞特有表面标志CD31和vWF,透射电镜细胞胞浆内可见特征性Weible-Palade小体。结论外周血干细胞在VEGF和bFGF诱导下,可分化为内皮细胞。     

肺纤方提取物对肺间质纤维化大鼠肺微血管VEGF、VEGFR2、PAI-1、VCAM-1mRNA表达的影响

目的通过观察肺纤方提取物干预体外培养肺微血管的血管内皮细胞生长因子(VEGF)、血管内皮细胞生长因子受体2(VEGFR 2)、纤溶酶原激活物抑制物1(PAI-1)、血管细胞黏附因子1(VCAM-1)基因表达的影响,探讨肺纤方干预肺纤维化微血管生成的机制。方法从肺纤维化模型大鼠分离培养肺微血管内皮细胞,将其等量分为模型组,氯沙坦组,泼尼松组,肺纤方大、中、小剂量组。模型组加入含20%胎牛血清的DMEM培养基,氯沙坦组加入含20%胎牛血清及10 mg/L氯沙坦的DMEM培养基,泼尼松组加入含20%胎牛血清及5 mg/L泼尼松的DMEM培养基,肺纤方大、中、小剂量组分别加入含20%胎牛血清及100、60、20 mg/L肺纤方提取物的DMEM培养基,分别作用24 h。双链嵌合荧光染料SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR法检测VEGF、VEGFR 2、PAI-1与VCAM-1的mRNA转录水平。结果与模型组比较,肺纤方大、中、小剂量组VEGF基因表达水平均显著降低,而VEGFR2无显著差异;肺纤方大剂量组PAI-1 mRNA表达显著降低;肺纤方大、中剂量组VCAM-1 mRNA表达显著降低(P0.05)。结论肺纤方可通过抑制肺微血管VEGF、PAI-1及VCAM-1的表达改善血凝及纤溶,抑制血管形成而发挥抗肺纤维化作用。     

缺氧和高浓度葡萄糖对体外培养人视网膜色素上皮衍生因子表达的影响

目的　探讨缺氧和高糖对体外培养的人视网膜色素上皮 (RPE)细胞血管内皮生长因子(VEGF)和色素上皮衍生因子 (PEDF)的影响。方法　我们通过实验性研究在氧正常或缺氧 (1%O2 )加或不加高浓度葡萄糖的条件下 ,培养的人RPE细胞 ,通过反转录PCR和实时定量分析检测PEDF和VEGF的表达 ,使用Western印迹分析检测PEDF和VEGF蛋白水平。结果　缺氧情况下 ,VEGF表达和蛋白水平增加 (P =0 .0 0 1) ;缺氧加 2 5mmol/L葡萄糖后增加更加明显 (P <0 .0 0 1)。缺氧情况下PEDF表达水平与正常氧环境比较无统计学意义 (P =0 .2 5 1) ;但加葡萄糖后PEDFmRNA表达水平低于正常对照。结论　体外培养的人RPE细胞在缺氧条件下PEDF表达降低不明显 ,这提示缺氧间接影响体外RPE细胞的PEDF下调 ,高葡萄糖直接下调PEDF的表达 ,同时增加VEGF的表达 ,这可能支持体内高血糖是糖尿病最危险的“糖毒性”观点。     

低氧对人脐带间充质干细胞活性和内皮分化能力的影响及VEGF的干预作用

目的: 探讨低氧对人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)的活性及向内皮细胞分化能力的影响,并进一步探索外源性VEGF对低氧损伤的保护作用。方法: 在体外对hUC-MSCs进行分离培养。对hUC-MSCs的形态学和表型特征进行分析。在添加/不添加50 ng/mL VEGF的情况下,对hUC-MSCs分别进行不同时间的低氧诱导后,对细胞凋亡率、ROS生成及细胞增殖能力进行检测,并对hUC-MSCs的内皮分化能力进行评估。结果: 低氧诱导早期(6, 12 h),hUC-MSCs的凋亡及ROS生成显著增加,增殖能力显著下降;晚期(24,72 h),细胞的增殖及凋亡水平与对照组间无明显差异;高浓度(50 ng/mL)外源性VEGF抑制低氧诱导早期出现的凋亡增加及增殖下降;外源性VEGF存在的情况下,低氧诱导14 d,hUC-MSCs表达早期内皮细胞表型,并能获得部分内皮细胞功能。结论: 低氧早期造成hUC-MSCs急性损伤,晚期通过逐步适应恢复细胞活性并保持了其分化潜能。VEGF能够保护急性缺氧对细胞的损伤,并能诱导其向内皮样细胞分化。     

血管抑素抑制鼠视网膜微血管内皮细胞增生及视网膜新生血管形成的研究

目的　探讨血管抑素蛋白对体外培养的鼠视网膜微血管内皮细胞 (REC)生长的抑制作用及其抑制视网膜新生血管形成的效果。方法　从血浆中分离血管抑素。原代培养鼠视网膜微血管内皮细胞 ,四甲基偶氮唑盐 (MTT)比色法检测不同浓度的血管抑素对其生长的抑制作用。高浓度氧诱导C57BL/ 6J小鼠建立视网膜缺血性病变动物模型。将 30只小鼠分为 5组 :正常组 ;高氧对照组 ;实验Ⅰ组 (血管抑素浓度 15 0 μg/ μl) ;实验Ⅱ组 (血管抑素浓度 2 0 0 μg/ μl) ;实验Ⅲ组 (血管抑素浓度 30 0μg/ μl) ,计数各组小鼠视网膜新生血管内皮细胞核数 ,并加以比较。 结果　血管抑素在体外能显著抑制视网膜微血管内皮细胞增殖 ,其半数有效剂量 (ED50 )约为 130 μg/ml。吸入高氧的鼠不论是对照组还是血管抑素治疗组每只眼均可见突出内界膜的新生血管内皮细胞 ,发生率为 10 0 %。实验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组与高氧对照组相比小鼠视网膜新生血管细胞核数分别减少了 4 2 %、5 7%、82 %。结论　血管抑素在体外能有效地抑制视网膜微血管内皮细胞增殖。血管抑素能有效抑制高氧诱导的小鼠视网膜新生血管形成     

慢性低氧性肺动脉高压大鼠肺内血管内皮生长因子表达的变化

为了解低氧对肺内血管内皮生长因子（ＶＥＧＦ）基因表达的影响及ＶＥＧＦ在肺动脉闹压发生中的作用，以常压低氧建立大鼠肺动脉高压模型，采用Ｅｌｉｓａ检测大鼠肺动脉血血清ＶＥＧＦ的含量改变，以体外转录并用ＤＩＧ－ＵＴＰ标记的ＶＥＧＦ ｃＲＮＡ探针进行肺组织原位杂交，检测大鼠肺内ＶＥＧＦ ｍＲＮＡ表达的变化。结果发现：低氧３周后，大鼠形成明显的肺动脉高压；大鼠肺动脉血血清中ＶＥＧＦ含量在低氧３周组为４２０．