人源肺腺癌单链抗体基因文库的构建

目的:制备人源抗肺腺癌单链抗体(Single-chain variable fragment,scFv)基因文库.方法:利用肺腺癌患者癌旁淋巴组织提取总RNA,通过RT-PCR分别扩增VH和VL基因片断,再将经纯化的VH和VL基因片断通过"剪切重叠延伸PCR"(Splicingover-lapping extend PCR,SOE-PCR)而形成scFv基因片断.将scFv基因克隆入噬菌粒栽体pCANTAB-5E电转入Ecoli TG1.PCR法鉴定抗体基因插入率,1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆酶切产物.结果:肺腺癌周围淋巴结的提取总RNA琼脂糖电泳结果中可见清晰的28 S、18 S条带;VH基因的大小约为370 bp,VL基因为350 bp,组装后的scFv基因约为750 bp.PCR连接产物的转化效率为2.2×107 CFU/μg,scFv的阳性插入率为83.3%(20/24).结论:成功地构建了人源抗肺腺癌scFv基因片断,为进一步筛选人源抗肺腺癌scFv库提供了试验基础. 入噬菌粒栽体pCANTAB-5E电转AEcoh TG1.PCR法鉴定抗体基因插入率,1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆酶切产物. 果:肺腺癌周围淋巴结的提取总RNA琼脂糖电泳结果中可见清晰的28 S、18 S条带;VH基因的大小约为370 bp,VL基因为350 bp,组装后的scFv基因约为750 bp.PCR连接产物的转化效率为2.2×107 CFU/μg,scFv的阳性插入率为83.3%(20/24).结论:成功地构建了人源     

人源抗狂犬病毒免疫型抗体库的构建及特异性抗体筛选与鉴定

目的:利用噬菌体展示技术,构建人源抗狂犬病毒单链抗体库,筛选特异性的抗狂犬病毒糖蛋白人源单链抗体(scFv)并对其进行初步鉴定。方法:从接种狂犬疫苗的志愿者外周血中提取总RNA,RT-PCR扩增VH和VL基因,并利用重叠扩增PCR将VH和VL拼接为scFv。将纯化后的scFv克隆至噬菌体载体pComb3XSS构建人源抗狂犬病毒单链抗体库,以狂犬病毒糖蛋白(RABVG)为抗原,从抗体库中筛选抗RABVG的scFv。通过phage-ELISA验证噬菌体单链抗体的结合特异性,将阳性克隆转化E.coliTOP10F′进行表达。结果:构建了人源抗狂犬病毒抗体库,抗体库的库容为3.29×109。经过5轮筛选,获得43株与RABVG特异结合的噬菌体单链抗体,其中15个A450值较高的克隆序列分析结果显示,有3个正确的单链抗体基因。单链抗体基因转化TOP10F′构建工程菌,表达纯化后的单链抗体,经ELISA检测能够与RABVG特异性结合。结论:从构建的人源免疫型抗狂犬病毒单链抗体库筛选出的能与RABVG特异性结合的scFv,为进一步制备抗RABVG的治疗性人源化抗体奠定了基础。     

利用噬菌体表面展示技术克隆抗人DR5抗体可变区基因

目的:利用噬菌体表面展示技术制备抗人DR5单链抗体.方法:从抗DR5杂交瘤细胞中提取总RNA,RT-PCR扩增VH和VL基因,并利用重叠扩增PCR将VH和VL拼接为scFv基因.将scFv与PAK100载体通过相同的酶切位点连接后,转化大肠杆菌XL1-Blue,经VSCM13辅助噬菌体拯救,构建成鼠抗人DR5单链抗体库...     

大容量人天然噬菌体单链抗体库的构建

目的：构建大容量和具有良好多样性的人天然噬菌体单链抗体库。方法：从人外周血分离淋巴细胞，提取mRNA后用RT—PCR技术采用新设计的引物扩增VH和VL基因片段，两者分别与Linker连接后，采用改进的重叠延伸PCR法将VH基因和VL基因连接成人单链抗体（scFv）基因（VH—Linker—VL片段），继而连接到噬菌粒载体pCANTAB5E中，连接产物通过电转化方法转入大肠杆菌TG1，构建噬菌体scFv抗体库。结果：所有VH、VL亚类基因都得到了扩增和有效的连接．经电转化E.coli TG1和噬菌体的超感染，构建了总库容达到了6×10^8的单链抗体库。结论：成功地构建了一个多样性良好的人源天然噬菌体抗体库，可用于制备具有应用前景的人源抗体。     

大容量人天然噬菌体单链抗体库的构建

目的：构建大容量和具有良好多样性的人天然噬菌体单链抗体库。方法：从人外周血分离淋巴细胞,提取mRNA后用RT-PCR技术采用新设计的引物扩增VH和VL基因片段,两者分别与Linker连接后,采用改进的重叠延伸PCR法将VH基因和VL基因连接成人单链抗体（scFv）基因（VH-Linker-VL片段）,继而连接到噬菌粒载体pCANTAB5E中,连接产物通过电转化方法转入大肠杆菌TG1,构建噬菌体scFv抗体库。结果：所有VH、VL亚类基因都得到了扩增和有效的连接,经电转化E.coliTG1和噬菌体的超感染,构建了总库容达到了6×10^8的单链抗体库。结论：成功地构建了一个多样性良好的人源天然噬菌体抗体库,可用于制备具有应用前景的人源抗体。     

人源性抗乳腺癌HER-2噬菌体单链抗体库的构建与筛选

目的：构建人源性抗乳腺癌噬菌体单链抗体（scFv）库,筛选和鉴定抗乳腺癌人类表皮生长因子受体2（HER2）特异性scFv,为HER2和CXC趋化因子受体4（CXCR4）双靶向融合蛋白的研制提供靶向HER2的高亲和力序列。 方法：取已确诊的乳腺癌患者癌旁淋巴组织,提取总RNA;构建可变区基因的T载体库,将重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）基因与pCANTAB连接肽连接,获得pCANTAB-scFv,电转化感受态大肠杆菌TG1;以M13K07辅助噬菌体进行感染,获噬菌体抗体库;利用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测筛选后获得的噬菌体抗体活性,以免疫组织化学法检测抗体亲和力,并通过测序进一步鉴定。 结果：成功构建大容量pCANTAB-scFv抗体库,获得的scFv长度为750 bp,VH和VL长度分别为375和330 kb;电转化大肠杆菌TG1后酶切验证插入片段大小正确,得到库容为2.48×108的大容量抗体库;通过噬菌体展示和淘洗筛选,富集针对乳腺癌细胞株SKBR-3表面抗原的抗体库;所得抗体对HER2有高度的亲和力和特异性,对乳腺癌组织HER2抗原也具有较高的亲和力;测序结果与人IgG抗体进行对比,所获得的scFv具有高度的人源性。 结论：主要构建了大容量人源性抗乳腺癌细胞的噬菌体scFv库,并筛选获得可特异性识别人乳腺癌HER2的高亲和力scFv,为制备以HER2为靶点的抗肿瘤HER2和CXCR4双靶向融合蛋白提供了载体。     

抗人β-淀粉样肽特异性单链抗体的噬菌体抗体库的构建与初步鉴定

目的:运用噬菌体展示技术构建抗人β-淀粉样肽(Aβ)特异性单链抗体的抗体库并进行初步鉴定.方法:从Aβ免疫的BALB/c小鼠脾淋巴细胞中提取总RNA,分离纯化mRNA,经逆转录合成其总cDNA.以PCR方法分别扩增出抗体的重链(VH)和轻链(VL)可变区基因片段,再经重组PCR将两基因片段由编码十五肽(Gly4Ser)3的接头连在一起,克隆到噬菌粒载体pCANTAB 5E中,转化至大肠杆菌TG1,经辅助噬菌体M13K07超感染后回收全部重组噬菌体,构建噬菌体抗体库,SDS-PAGE鉴定纯度.结果:经琼脂糖凝胶电泳分析,RT-PCR方法扩增的抗体VH和VL基因片段大小约350bp和325 bp,与预期VH,VL基因片段理论值相符.经重组PCR得到大小约750 bp的ScFv基因片段.ScFv基因片段经双酶切后成功定向克隆到噬菌粒载体,回收后构建成库容量为1.1×10<'8>的噬菌体抗体库,经SDS-PAGE鉴定,得到M,约为30000 ku,纯度较好的scFv抗体.结论:成功构建了库容量大的特异性噬菌体抗体库,为抗人Aβ特异性抗体的筛选、生物活性鉴定、临床实验诊断方法建立和治疗应用打下基础.     

人源抗Peroxiredoxin Ⅰ肺腺癌噬菌体抗体的制备及鉴定

目的构建人源噬菌体抗体库,从中筛选出抗PeroxiredoxinⅠ(PrxⅠ)肺腺癌人源单链抗体。方法提取肺癌患者癌旁淋巴结组织,通过RT-PCR扩增出重链可变区基因(VH)和轻链可变区基因(VL),再经剪切-重叠-延伸PCR(SOE-PCR)将VH和VL连接得到单链抗体(ScFv);将双酶切后的ScFv基因片段克隆入噬菌体表达载体pCANTAB5E,得到初级噬菌体抗体库。PCR检测TG1中ScFv基因插入率;1%琼脂糖凝胶电泳鉴定SfiI和NotI双酶切质粒的结果;以肺腺癌细胞株D549及在肺癌中高表达的抗氧化蛋白PrxI为靶抗原对抗体库进行筛选富集。将阳性克隆用IPTG诱导表达。用SDS-PAGE及Westernblotting鉴定该抗体;用ELISA法、免疫细胞化学法鉴定该抗体与人肺腺癌细胞的结合特异性。结果成功构建噬菌体单链抗体库。ScFv基因插入率为77%,双酶切鉴定检测到目的条带。在亲和筛选过程中,肺癌单链抗体得到富集,收获率逐轮提高,第6轮为第1轮的180倍。随机选取10个克隆,通过ELISA法检测到其中6个与A549细胞呈阳性反应,阳性率为60%。SDS-PAGE及Westernblottin...     

新式SOE PCR高效组装人单链抗体在高容量人天然噬菌体抗体库中的应用

目的探讨新式SOEPCR高效组装人单链抗体在高容量人天然噬菌体抗体库中的应用。方法通过引物设计的改变,将6种人VH基因和11种人VL基因利用两步法直接互相两两连接为人scFv基因,并且与传统的SOE法进行对比。scFv基因用于构建噬菌体单链抗体库。结果新式SOEPCR法成功的将6种人VH基因和11种人VL基因连接成66种不同的人scFv基因,与传统的SOEPCR法相比,效率高且方法简便,经过约130次电转化后,抗体库的总库容为5·58×109。结论成功地改进了传统的SOEPCR方法,高效组装了66种不同的人scFv基因,提高了抗体库的多样性。     

噬菌体展示技术构建重组人TNF-α单链抗体库

目的 应用噬菌体展示技术构建抗重组人肿瘤坏死因子-α(rhTNF-α)的单链抗体库.方法 利用噬菌体表面展示技术、绕过杂交瘤技术,提取经免疫BALB/c小鼠淋巴细胞总RNA,用相应引物扩增小鼠免疫球蛋白VH基因和VL基因,构建VH、VL抗体库.由Linker-primer mix经重叠延伸反应将重链可变区基因与轻链可变区基因拼接成单链抗体.再用RS primer mix以单链抗体为模板进行第二次聚合酶链反应,从而获得全套抗rhTNF-α的单链抗体基因.以SfiⅠ/NotⅠ,位点定向插入pCANTAB-5E噬菌粒载体,转化大肠杆菌TG1后,经M13KO7辅助噬菌体拯救,构建成全套抗rhTNF-α单链抗体表面展示文库.结果 成功构建了rhTNF-α全套单链抗体噬菌体表面展示文库.经M13KO7超感染后,噬斑计数滴度为2.1×1011 pfu.结论 rhTNF-α全套单链抗体噬菌体表面展示文库的构建,为研究rhTNF-α抗体结合位点,了解其结构与功能的关系以及研究用于临床免疫治疗的新型抗体打下了基础.