转sck基因水稻种子中外源蛋白含量的检测

目的　检测转sck基因水稻T6代种子中外源蛋白CpTI及HPT的表达量。方法　对转基因水稻种子进行PCR检测;取外源基因PCR检测阳性植株的叶、茎杆、根部、种子等不同部位对CpTI和HPT蛋白表达进行Westernblot分析,并对PCR检测阳性植株的种子进行双夹心ELISA检测,以同种非转基因水稻M86种子作对照。结果　在转sck基因水稻T6代种子中扩增出sck和hpt基因;Westernblot结果显示转基因水稻的叶片、茎杆和根部的蛋白出现特异的杂交条带,种子蛋白中未出现特异杂交条带。ELISA检测结果显示,转基因水稻种子中CpTI蛋白低于双夹心ELISA的检测低限(<14 μg L) ,HPT蛋白没有被检出。结论　转基因水稻种子中CpTI蛋白含量低于检测低限,不能被定量,并且不含有可检测水平的HPT蛋白。     

豇豆胰蛋白酶抑制剂单克隆抗体的制备及初步应用

目的　检测转豇豆胰蛋白酶抑制剂 (CpTI)基因水稻叶片中CpTI蛋白 ,来对转CpTI基因作物的检测建立初步的方法。方法　目前国际上主要通过基因检测的方法 ,而基因的检测可能存在假阳性的结果 ,而且基因的导入并不一定代表功能蛋白的表达 ,表达含量也为未可知。因此 ,通过检测转基因蛋白含量的多少是最直接和明确的方法。通过体外基因重组技术制备的CpTI蛋白来免疫动物得到单克隆抗体 ,就可通过westernblotting法检测转基因作物中的CpTI。结果　得到三株抗CpTI的单克隆抗体 ,利用这三种单克隆抗体的混合物对转CpTI蛋白的水稻叶片进行初步检测 ,得到了较为满意的结果。结论　利用抗CpTI的单克隆抗体混合物对转CpTI的水稻叶片进行westernblotting的检测方法较好     

转基因水稻中标记基因hpt表达行为的研究

目的探讨转sck基因水稻中标记基因hpt的表达行为。方法对经潮霉素抗性筛选的转基因水稻4个生长发育时期、不同组织的hpt基因进行PCR检测;提取4个生长发育时期PCR检测阳性植株的叶片总RNA,以hpt基因片断为探针进行Northernblot分析,并对不同生长时期的叶片和成熟期的茎部、根部、种子进行双夹心ELISA检测,以同种非转基因水稻M86相应时期的相应部位作阴性对照。结果转基因水稻不同生长时期、不同组织中均能扩出特异的hpt(832bp)片段;Northernblot结果显示,在4个生长发育时期的hpt基因在转录水平均有表达,但是表达水平较低,且不同生长发育时期之间无明显差别;ELISA检测结果显示HPT蛋白在4个生长时期的叶片和成熟期的茎部和根部均有表达,种子中HPT蛋白的含量不超过负对照,不能被检测。结论不同生长发育时期的叶片中hpt基因在转录水平和翻译水平表达均能稳定表达。成熟的种子中不含有可检测水平的HPT蛋白。     

转sck基因水稻中标记基因表达蛋白HPT食用安全性的初步研究

目的针对抗虫转sck基因水稻中标记基因表达蛋白HPT的食用安全性开展初步研究,主要包括该蛋白在大米中的定性、定量研究、可能的膳食摄入量估计及其潜在致敏性评估等。方法将HPT的编码序列插入带有组氨酸标签(His-tag)的原核表达载体PBV222中进行融合表达,通过脲变性和镍柱亲和层析的方法纯化融合蛋白。用纯化后的6His-HPT蛋白免疫家兔和小鼠,分别制备相应的抗HPT多克隆和单克隆抗体,进一步将这两种抗体组成双抗夹心酶联免疫检测体系,用于检测HPT在转sck基因水稻中的表达水平。在致敏性评估方面,首先将HPT序列与已知的致敏原数据库进行比较,再利用模拟的胃肠液环境进行体外消化稳定性实验。结果重组体经表达纯化后获得了高纯度(95%)的6His-HPT融合蛋白,免疫动物后获得了高效价的抗HPT多克隆及单克隆抗体,经免疫印迹检测证明所制备的抗体可与转基因水稻中及纯化出的HPT蛋白形成特异结合带。由这两种抗体组成的双抗夹心酶联免疫检测体系用于检测HPT抗原时的灵敏度为30ng/ml,可检测出转sck基因水稻叶片中HPT蛋白的表达量约为80~150ng/ml;而在相应的转基因大米中未能检出。HPT序列经与已知的致敏原数据库进行比较未见同源性,但在体外消化稳定性实验中,HPT蛋白在模拟的胃肠液环境中均迅速降解。结论就目前的检测水平来看,转sck基因大米中所含的HPT蛋白水平极低,且对消化环境不稳定,推测该标记基因表达蛋白不易引起可观察到的食用安全性问题。但利用表达的HPT蛋白直接进行动物急性毒性及致敏性实验的工作仍有待进行,有关的结果将进一步报道。     

胶体金探针对HBV全基因转染滋养细胞中HBsAg的示踪研究

目的通过胶体金探针标记乙肝病毒（HBV）全基因转染的人胎盘滋养细胞（HPT-8-HBV）,示踪乙肝表面抗原（HBsAg）在HPT-8-HBV细胞中的分布。方法通过脂质体介导的方法将HBV全基因转染HPT-8细胞,G418筛选,通过ELISA、免疫组化对转染细胞进行检测;采用胶体金标记的HBsAg单克隆抗体作为探针（简称胶体金探针）对转染细胞中的HBsAg进行标记示踪。结果成功将质粒pcDNA3—3HBV转染到HPT-8,转染后第1、2代培养上清ELISA检测显示HBsAg阳性,免疫组化检测第2代转染细胞中HBsAg阳性;通过胶体金探针标记发现HBsAg存在于转染滋养细胞中的粗面内质网、分泌泡、空泡和溶酶体内,以及细胞膜和绒毛上。结论可以从重组质粒pcDNA3—3HBV转染的滋养细胞的树脂切片中获得HBsAg的超微结构定位。     

孤核受体NR4A1通过线粒体机制调控细胞凋亡

孤核受体NR4A1参与调节细胞生存和凋亡。亚细胞定位研究发现,NR4A1定位于细胞核,表明其核因子的功能;在细胞质中也存在NR4A1,主要定位在线粒体,提示其通过线粒体机制调节细胞凋亡和自噬功能。在细胞核内,NR4A1作为一种促进细胞增殖的核因子发挥功能;在细胞质中,NR4A1与Bcl-2家族基因相互作用,通过直接或间接影响线粒体功能,导致细胞色素C释放入胞质,经线粒体相关的信号机制促进细胞凋亡,或在细胞自噬过程中发挥作用。现综述NR4A1通过线粒体参与细胞内的凋亡和自噬过程,探讨NR4A1在细胞质中的功能。     

还原型谷胱甘肽对~(60)Coγ射线激活核转录因子-κB影响研究

目的探讨还原型谷胱甘肽(GSH)对60Coγ射线引起的人肺腺癌A549细胞中p65蛋白表达情况的影响。方法按处理方法不同将人肺腺癌A549细胞分为假照组、单纯照射组、GSH组、GSH+照射组。免疫印迹法检测各组细胞质和细胞核中p65蛋白的表达情况;免疫荧光法检测各组细胞中p65在细胞质和细胞核中的定位变化。结果 60Coγ射线照射后,p65蛋白在细胞核中的表达量随着吸收剂量的增加逐渐增多;GSH+照射组与单纯照射组相比,细胞核中p65的表达明显减少;但p65在细胞总蛋白中的表达没有明显变化。免疫荧光法检测到单纯照射组与假照组比较,细胞核内p65的表达量增多;GSH+照射组细胞核内p65的表达量相对单纯照射组明显减少。结论γ射线照射后人肺腺癌A549细胞核内p65的表达量增多,但GSH可以减少p65在细胞核内的表达,抑制p65的入核。     

还原型谷胱甘肽对60Co γ射线激活核转录因子-кB影响研究

目的 探讨还原型谷胱甘肽(GSH)对<'60>Co γ射线引起的人肺腺癌A549细胞中p65蛋白表达情况的影响.方法 按处理方法不同将人肺腺癌A549细胞分为假照组、单纯照射组、GSH组、GSH+照射组.免疫印迹法检测各组细胞质和细胞核中p65蛋白的表达情况;免疫荧光法检测各组细胞中p65在细胞质和细胞核中的定位变化.结果 <'60>Co γ射线照射后,p65蛋白在细胞核中的表达量随着吸收剂量的增加逐渐增多;GSH+照射组与单纯照射组相比,细胞核中p65的表达明显减少;但p65在细胞总蛋白中的表达没有明显变化.免疫荧光法检测到单纯照射组与假照组比较,细胞核内p65的表达量增多;GSH+照射组细胞核内p65的表达量相对单纯照射组明显减少.结论 γ射线照射后人肺腺癌A549细胞核内p65的表达量增多,但GSH可以减少p65在细胞核内的表达,抑制p65的入核.     

LYRM1基因绿色荧光蛋白融合载体的构建及表达

[目的]构建LYRM1基因绿色荧光蛋白融合载体,进而观察LYRM1基因编码蛋白在细胞内的定位情况.[方法]运用RT-PCR技术从人网膜脂肪组织中分离LYRM1基因的完整编码框,将其亚克隆到绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-N2,脂质体转染3T3-L1前体脂肪细胞,激光共聚焦显微镜下观察融合蛋白的表达情况.[结果]PCR、酶切鉴定及测序结果表明重组质粒构建正确.激光共聚焦显微镜下观察到pEGFP-N2转染的细胞中绿色荧光均匀分布于整个细胞,而pEGFP-LYRM1转染的细胞中绿色荧光主要集中在细胞核区域.[结论]成功构建了LYRM1绿色荧光蛋白融合载体,LYRM1编码蛋白在细胞中定位于胞核中.     

石棉暴露下内质网应激在肺泡上皮细胞凋亡中的作用机制

目的探讨石棉暴露下内质网应激在细胞凋亡中的作用机制。方法应用石棉处理A549细胞,免疫荧光染色免疫法和免疫印迹法观察内质网应激(ERS)相关蛋白与促凋亡基因的变化。结果石棉暴露下,ERS相关蛋白Bip、IRE-1α和GRP94,以及促凋亡基因BAX、BAK蛋白表达均上调,且与石棉暴露时间呈正相关。结论内质网应激参与了石棉诱导的细胞凋亡。     

转豇豆胰蛋白酶抑制剂大米的致畸作用研究

目的　用表达杀虫蛋白CpTI(豇豆胰蛋白酶抑制剂 )的大米喂养Wistar大鼠 ,研究其是否具有致畸作用。方法　将断乳的Wistar大鼠随机分为 4组 ,转基因大米组、非转基因大米组、阴性对照组和阳性对照组 ,敌枯双为阳性对照物。转基因大米组含 78 3%转基因大米 ,非转基因大米组含 74 7%与转基因大米同品系的非转基因大米 ,两个对照组的饲料为AIN93G ,三种饲料的宏量及微量营养素的含量相同。大鼠性成熟后 ,进行传统的致畸实验 ,观察母鼠及胎鼠的情况。结果　转基因大米组的孕鼠增重、胎鼠体重、身长和尾长显著高阳性对照组 ,畸形率 (包括外观畸形、骨骼畸形和内脏畸形 )显著低于阳性对照组 (P <0 0 1) ,转基因大米组、非转基因大米组及阴性对照组间的所有指标均无显著性差异 (P >0 0 5 )。结论　此种转CpTI基因的大米对大鼠无母体毒性、胚胎毒性和致畸作用。     

过氧化物还原酶4蛋白对小鼠卵巢颗粒细胞凋亡的影响及机制

目的:探讨过氧化物还原酶4(Prdx4)蛋白对小鼠卵巢颗粒细胞凋亡的影响及相关机制.方法:免疫荧光明确Prdx4在人卵巢颗粒细胞(KGN)中的定位;利用Prdx4小干扰RNA(siRNA)转染小鼠卵巢颗粒细胞,以空白组作为对照,蛋白质印迹法检测Prdx4表达水平以验证干扰效果,并检测2组颗粒细胞凋亡相关因子[B细胞淋巴...     

胶体金免疫层析法检测葡萄球菌B型肠毒素

目的通过优化制备中各关键步骤的实验条件,建立快速检测葡萄球菌B型肠毒素的胶体金免疫层析法。方法采用柠檬酸三钠还原氯金酸法制备直径16nm的胶体金溶液,葡萄球菌B型肠毒素多克隆抗体制备免疫胶体金复合物,组装胶体金免疫层析快速检测试纸条。结果用柠檬酸三钠还原法制备的16nm胶体金溶液呈亮红色,其颗粒大小比较均一。胶体金标记抗体蛋白的最低稳定量为15μg／mL,最适稳定量为18μg／mL,标记的最适pH为7．8。此方法检测限为0．2μg/mL,准确度为94．9％。结论制备了葡萄球菌B型肠毒素胶体金免疫试纸条,该方法简便、快速,而且灵敏度高、稳定性强,适用于食品中葡萄球菌B型肠毒素的快速检测。     

金标测试条与EIA检测HBsAg结果比较

目的观察金标测试条检测ＨＢｓＡｇ的效果。方法应用金标测试条和ＥＩＡ同时检测４０８份健康体检血清。结果金标测试条和ＥＩＡ检测血样中ＨＢｓＡｇ的符合率为９９．２６％,金标测试条的特异性和敏感性分别为９９．５０％和９９．０３％。另外检测甲型肝炎血清,没有发现交叉阳性。结论金标测试条快速简便,适用于各级医疗单位,特别是紧急情况及单个样品的使用。     

转CpTI基因大米在五指山小型猪体内消化稳定性的初步研究

目的建立五指山小型猪在体消化稳定性模型,评价转CpTI大米的胃肠消化稳定性。方法在五指山成年猪体内同时安置胃、肠瘘管,通过经口喂饲途径,以大豆作为阳性对照,测定不同时间点消化液的pH,采用蛋白凝胶电泳法分析测定不同时间点消化产物中的蛋白片段,比较转CpTI大米和亲本大米消化产物的区别。结果给样后胃液pH迅速中和至6.0左右,以后逐步降低,在4～6h后又开始回升,大豆引起胃液pH下降和回升时间均较米粉晚;13×103、17×103、34×103和50×103是大豆中几种相对消化稳定的蛋白片段,在5～6h的胃肠液中仍然能检测出高表达,其中50×103、34×103、17×103三个蛋白片段呈现胃液、肠液消化稳定性,而13kD呈现胃液消化稳定性;米粉给样0.25h后胃液中未检出任何耐受蛋白酶消化的片段或亚基,而亲本明恢86米粉和转CpTI基因米粉比较,无论是胃液或肠液中蛋白消化情况均无明显区别。结论利用五指山小型猪建立的在体消化稳定性模型是可行的,转CpTI基因米粉与亲本米粉在五指山小型猪胃液、肠液中的消化稳定性具有等同性。     

Effect of zinc deficiency on the ultrastructure of the pancreatic acinar cell and intestinal epithelium in the rat.

Ultrastructural changes in the pancreatic acinar cell and intestinal epithelium were studied in rats fed a zinc-deficient diet as compared with those of pair-fed and ad libitum fed zinc-supplemented controls. The pancreatic acinar cells of zinc-deficient rats showed marked cellular alterations: a reduction in zymogen granules, rupture of zymogen granules, basal accumulation lipid droplets, prominent lysosome-like bodies, focal degradation of the cytoplasm, and intracistenal granules within the dilated cisternae of the endoplasmic reticulum. The Golgi complex appeared inactive, and nuclear pyknosis was noted. Defects in the endoplasmic reticulum and ribosomes were shown by their presence in the foci of cytoplasmic degradation, which were subsequently subject to lysosomal digestion and degeneration. The microvilli of the intestinal epithelium in the zinc deficient rats were well organized and normal in size, demonstrating a typical geometric array when cross-sectioned. The intercellular boundaries, the junctional complexes, and the terminal web were well developed and appeared intact. However, the cell cytoplasm showed prominent cellular changes: an abundance of lysosome-like bodies, membrane-bound autopraphic vacuoles, sparse endoplasmic reticulum, a quiescent-appearing Golgi complex with tightly packed lamellae containing few vacuoles, pyknotic nuclei, and a dilated nuclear periphery.     

The effects of the anthocyanin-rich extract from red cabbage leaves on Allium cepa L. root tip cell ultrastructure

The effect of exogenously applied 250 μM anthocyanin-rich (ATH-rich) extract from red cabbage leaves on the ultrastructure of Allium cepa root meristematic cells was investigated. The tested extract slightly affected mitochondria, endoplasmic reticulum (ER), Golgi apparatus and vacuoles. In the presence of ATH, 62% of mitochondria converted to condensed type. In addition swollen, circular ER cisternae were sporadically observed. In the ATH-treated roots, one third of Golgi structures was characterized by the reduced number of vesicles. Moreover in 54% of vacuoles, the electron-dense granular and circular material appeared. Additionally, in the cytoplasm, the presence of numerous multivesicular bodies (MVB) was noticed.The observed ultrastructural modifications of mitochondria, and presumably also ER, probably resulted from the ability of an ATH to affect mitochondrial respiratory activity. The other changes in A. cepa root meristematic cell ultrastructure were connected with the transport of exogenously applied ATH into vacuoles. It seems that they are transported from the plasmolemma to the vacuole by multvesicular bodies (MVB), and there trapped by anthocyanic vacuolar inclusions (AVIs).However, none of the observed ultrastructural changes seemed to disturb cell functions, therefore the ATH-rich extract from red cabbage leaves may be regarded as cell-friendly and can be safely used as a detoxifying agent against heavy metal poisoning, as it is more and more often postulated.