结核分枝杆菌KatG-ACT271CCT(Thr271Pro)突变与异烟肼耐药关系的研究

目的 探讨结核分枝杆菌katG ACT271CCT(Thr271Pro)基因点突变对异烟肼耐药性的影响方法 应用基因克隆技术合成野生型katG、突变型katG(AGC315ACC)和katG(ACT271CCT)基因片段,分别重组至质粒pET22b(+),转入表达菌BL21(DE3)pLySs,IPTG诱导目的蛋白表达,亲和层析法对目的蛋白分离纯化。最终检测重组katG蛋白过氧化物酶及过氧化氢酶活性。此外,通过软件AutoDock4.0采用半柔性对接方式分别模拟野生型katG蛋白、Thr271Pro突变型katG蛋白与异烟肼相互作用结果 成功获得纯化katG重组蛋白。相比野生型katG蛋白(过氧化氢酶活性361.5 U/mg和过氧化物酶活性77.6 U/mg),Thr271Pro突变型katG蛋白过氧化氢酶和过氧化物酶活性分别下降56%和63%(158.8 U/mg和28.7 U/mg),而Ser315Thr突变型katG蛋白过氧化氢酶和过氧化物酶活性分别下降74%和75%(96.2 U/mg和19.7 U/mg)。分子对接结果提示,异烟肼与Thr271Pro突变型katG蛋白结合自由能较野生型升高,Thr271Pro突变蛋白与异烟肼结合的亲和性降低。271位氨基酸突变后, Thr271Pro突变型katG蛋白氧化反应活性空腔发生一定的变形结论 katG Thr271Pro基因突变引起katG蛋白酶活性部分缺失和氧化反应活性空腔发生变形,导致异烟肼耐药。     

结核分枝杆菌katG Asn329Val突变导致异烟肼耐药

摘要：目的 研究结核分枝杆菌katG基因Asn329Val突变导致异烟肼耐药的机制。方法 扩增含有突变位点和野生型的全长katG基因,经TA克隆、定向克隆构建表达载体,原核表达KatG蛋白,纯化后比较重组KatG酶活性。结果 获得了katG基因的高效表达。重组蛋白酶活性显示,Asn329Val突变导致重组KatG过氧化氢酶活性完全丧失,但仍保持一定的过氧化物酶活性;Ser315Thr突变导致重组KatG过氧化氢酶和过氧化物酶活性部分丧失;Arg463Leu突变对过氧化氢酶活性和过氧化物酶活性影响均不大。结论 katG Asn329Val突变引起了KatG过氧化氢酶活性的完全丧失,可能是导致菌株对异烟肼耐药的机制。     

耐多药结核分枝杆菌异烟肼耐药相关基因katG突变分析

异烟肼(isoniazid, INH)是一种重要的抗结核药物,其在细菌体内被过氧化氢酶-过氧化物酶KatG氧化为乙酰异烟肼自由基和活性氧自由基等活性物质,进而攻击结核分枝杆菌多个靶位点来发挥杀菌作用。Zhang等通过Southern印迹杂交（Southern blot）发现结核分枝杆菌katG基因缺失和异烟肼耐药相关。研究表明,异烟肼耐药与许多基因相关,发生频率最高的为katG编码区和inhA启动子区的突变,katG315位突变最常见,有30%～94%的耐药株发生该突变,但国内对于该基因其他位点的突变研究较少。本研究通过对河南省耐多药(multidrug resistant,MDR)结核分枝杆菌katG编码区全长突变进行分析,进一步分析异烟肼的耐药机制。     

KatG基因点突变与结核分枝杆菌异烟肼耐药相关性研究

目的　探讨过氧化氢酶编码基因 (KatG)基因点突变和结核分枝杆菌异烟肼 (INH)耐药性之间的关系 ,筛选相关位点用于筛查临床INH耐药株基因型。方法　采用三步法聚合酶链反应(PCR)对临床耐异烟肼菌株中发现的 6个位点进行定点诱变 ,用含诱变基因的 pET2 4b质粒转化大肠埃希菌BL2 1菌株 ,在异丙基硫代 β D半乳糖苷 (IPTG)诱导下表达 ,使用镍亲和柱和Q 琼脂糖快速流动凝胶纯化各KatG诱变蛋白并测定其过氧化氢酶和过氧化物酶活性。结果　完成KatG基因 6个位点的诱变及相应诱变蛋白的表达和纯化 ,过氧化氢酶、过氧化物酶活性测定发现 ,3个诱变蛋白[KatG(W32 1G)、KatG(R4 18Q)和KatG(A4 5 6S) ]基本失活 ,其余 3个诱变蛋白的活性亦有不同程度下降。结论　所引入的 6个突变均可造成KatG蛋白过氧化氢 过氧化物酶活性下降 ,与结核分枝杆菌INH耐药有关 ,可用于筛查临床INH耐药株基因型     

利用荧光偏振技术检测耐异烟肼结核分枝杆菌KatG 315点突变

目的 应用模板指导的荧光染料终止物掺入反应-荧光偏振检测技术(templatedirected dye-terminator incorporation with fluorescence polarization detection，TDI-FP)分析结核分枝杆菌KatG 315点突变与异烟肼耐药性的关系，并建立一种准确、快速的诊断结核分枝杆菌异烟肼耐药性的新方法。方法 对临床82例耐多药结核病患者所感染的结核分枝杆菌菌株进行常规培养和药敏实验；提取结核分枝杆菌DNA，并经聚合酶链反应(PCR)扩增271bp的KatG基因片段，PCR产物经消化处理清除残余dNTPs和引物，进行TDI反应，应用Victor2测定荧光偏振值，分析所有样品的KatG基因315位点的基因型。结果 29例异烟肼高度耐药患者的结核分枝杆菌中有15例发生KatG 315的G→C突变，其中4例为KatG 315突变和未突变的混合感染，突变率为52％；32例异烟肼低度耐药患者的结核分枝杆菌中有15例为KatG 315突变和未突变的混合感染，突变率为47％；21例异烟肼敏感患者的结核分枝杆菌未发现KatG 315突变。结论 KatG 315突变与结核分枝杆菌对异烟肼产生耐药性密切相关；应用TDI-FP技术检测KatG 315突变具有准确、快速、简便以及高通量等优点，在结核分枝杆菌耐异烟肼的临床诊断中有着广阔的应用前景。     

应用基因芯片方法检测结核分枝杆菌利福平和异烟肼的耐药性

目的 应用基因芯片方法检测结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)对利福平和异烟肼的耐受性,评价其临床应用价值。方法 应用聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）扩增-基因芯片杂交的方法检测经常规药敏实验证实的30株Mtb利福平和异烟肼敏感株和50株耐利福平和异烟肼分离株的rpoB基因及katG和inhA基因突变,同时以PCR-直接测序法为对照。结果 应用PCR-基因芯片与基因测序方法检测30株Mtb利福平敏感株rpoB基因和异烟肼敏感株katG基因和inhA基因均为野生型。50株Mtb利福平耐药株中,PCR-基因芯片与基因测序分析3株rpoB基因均为野生型,41株均为突变型;6株PCR-基因芯片与基因测序结果不一致。50株Mtb异烟肼耐药株中,PCR-基因芯片与基因测序分析16株katG基因和30株inhA基因均为野生型,31株katG基因均为315位密码子突变,7株inhA基因均为15位突变型,其中2株为katG和inhA双重突变;3株katG和13株inhA PCR-基因芯片与基因测序结果不一致。结论 应用PCR-基因芯片方法可快速、有效地检出大多数Mtb耐多药分离株,指导临床用药。     

基因芯片快速检测结核分枝杆菌katG基因突变及其与异烟肼耐药相关性

目的了解结核分枝杆菌katG基因S315突变与异烟肼（isoniazid,INH）耐药相关性,建立快速简便的katG基因S315突变基因芯片检测方法。方法采用二倍稀释法检测123株结核分枝杆菌临床分离菌株对INH的耐药性。PCR及测序确定上述结核分枝杆菌katG基因S315位点突变率及突变类型。根据PCR及测序结果,设计Cy3荧光标记探针并制备katG基因S315位点突变检测基因芯片。基因芯片检测结果与PCR及测序结果进行对比分析。结果 123株结核分枝杆菌临床菌株中,39.0%（48/123）菌株对INH敏感,61.0%（75/123）菌株对INH耐药。结核分枝杆菌H37Rv株及所有临床菌株均能扩增出katG基因片段。75株INH耐药菌株中,69.3%（52/75）菌株katG基因出现S315位突变,其中25株突变类型为S315N（AGC→AAC）、12株为S315T（AGC→ACC）、7株为S315I（AGC→ATC）、各有3株分别为S315T（AGC→CGC）和S315R（AGC→AGA）、2株为S315G（AGC→GGC）。所制备的基因芯片对123株结核分枝杆菌katG基因S315野生型或突变型检测结果与PCR及测序结果完全一致。结论结核分枝杆菌katG基因S315突变与INH耐药密切相关。本研究中制备的基因芯片可快速、简便、准确、敏感和特异地检测结核分枝杆菌katG基因S315突变及其类型。     

结核分枝杆菌异烟肼耐药基因katG的检测

目的探讨结核分枝杆菌异烟肼(INH)耐药的分子机制,建立快速检测结核分枝杆菌INH耐药性的方法。方法应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术检测105株结核分枝杆菌临床分离株的katG基因,运用DNA测序和生物信息分析比对进行验证。结果以H37Rv标准株为对照,34株敏感株中5株(14.7%)存在KatG基因异常,105株耐药株中55株(52.4%)存在KatG基因异常。结论结核分枝杆菌对INH耐药与KatG基因突变有关,PCR-RFLP技术可快速、准确地检测结核分枝杆菌对INH的耐药性。     

耐异烟肼结核分枝杆菌临床分离株耐药基因突变及其分子流行病学调查研究

目的阐明结核分枝杆菌耐异烟肼临床分离株katG基因突变特点以及Spoligotyping分型和结核病流行关系。方法对123株结核分枝杆菌临床分离株，其中有药敏结果的98株，（耐异烟肼菌株45株；异烟肼敏感株53株）的katG基因进行DNA片断扩增然后进行SSCP分析；同时对其中的121株菌株进行Spoligotyping分型。结果45株耐INH结核杆菌株中，27株（60％）第315位点突变，低耐药菌株（1mg／L）第315位点突变率显著高于高耐药菌株（10mg／L；53株敏感株中无KatG基因315位密码子突变。对121株临床株的Spoligotyping DNA指纹分析，1型，（北京型）103株占84％（103／121），其它基因型18株，分散在13种基因型中。结论本项研究进一步证实了结核分枝杆菌耐异烟肼与katG基因突变之间的关系；北京型感染是北京地区结核病流行的重要原因。     

六安地区结核分枝杆菌耐药基因katG 和rpoB 的突变特征

目的 分析临床分离的结核分枝杆菌katG 和rpoB 基因的突变情况与耐药之间的关系,了解六安地区耐药结核分枝杆菌的基因突变特征。方法 采用比例法对六安地区65 株结核分枝杆菌临床分离株进行药敏试验;通过特异性引物,对目的基因片段katG 和rpoB 进行扩增、测序后进行分析。结果 60 株结核分枝杆菌中分别有有9 株耐异烟肼和14 株耐利福平,其中同时耐异烟肼和利福平的6株。9 株耐异烟肼菌株中,4 株katG 在315（Ａ GC→ACC 或ACA）位点发生突变,占44.4％;14 株耐利福平菌株中,11 株rpoB 分别在516（GAC→GTC）、526(CAC→CGC 或TAC)和531(TCG→TTG)位点发生突变,占总耐药菌株的78.6％;6 株同时对利福平和异烟肼耐药,其中5 株katG 或rpoB 基因发生突变,占83.3％。结论 六安地区结核分枝杆菌耐异烟肼和耐利福平分别主要是由katG 和rpoB 基因突变引起,其中耐异烟肼主要在315（AGC→ACC 或ACA）位,而耐利福平在516（GAC→GTC）、526(CAC→CGC或TAC)和531(TCG→TTG)位,都发生了突变。     

定向诱变方法研究结核分支杆菌KatG基因突变与异烟肼耐药机制的关系

目的：探讨结核分支杆菌KatG基因的常见点突变是否会导致与产生异烟肼耐药性相关的过氧化氢酶活性降低。方法：用定向诱变方法产生耐异肼的结核分支杆菌中最常见的KatG基因315突变体,造成该位点从丝氨酸（AGC）到苏氨酸（ACC）的突变,随后构建含KatG基因S315T突变体的质粒,转化进入大肠菌并实现高表达,对表达的蛋白进行过氧化氢酶活性的测定。结果：通过定向诱变方法成功获得KatG基因S315T突变体,并通过pET24b质粒转入大肠杆菌,KatG基因S315T突变体蛋白在大肠杆菌中得到高表达,对DatG S315T表达产物的过氧化氢酶活性进行检测,发现比野生株KatG基因表达产物酶活性下降了50％左右。结论：KatG基因315位从丝氨酸（AGC）到苏氨酸（ACC）的突变造成过与异烟肼耐药产生直接相关的氧化氢酶活性的下降。     

31株结核分枝杆菌异烟肼耐药相关基因检测及序列分析

目的了解贵阳地区分离的结核分枝杆菌katG基因、inhA启动子和oxyR-aphc间隔区基因突变特征。方法对31株结核分枝杆菌临床分离株（异烟肼耐药株17株,异烟肼敏感株14株）的katG基因、inhA启动子和oxyRaphc间隔区进行DNA片段的PCR扩增,并进行测序分析。结果 17株异烟肼耐药菌株中有16株检出katG基因突变,其中70.5%（12/17）为315位密码子变异,且变异类型均为AGC→ACC,敏感株未发现315位点突变。11株敏感菌和4株耐药菌在463位密码子发生变异,变异类型均为CGG→TGG,变异率分别为78.6%（11/14）和23.5%（4/17）,差异无统计学意义。有12株耐药株的变异类型为katG基因双重位点突变,其中10株为katG315（AGC→ACC）和463（CGG→TGG）位变异,463（CGG→TGG）和299（GGC→AGC）变异及463（CGG→TGG）和419（GAC→CAC）位变异各1株。2株异烟肼耐药菌检出oxyR-aphC启动区G32A突变,其中1株为联合katG463和299位突变。结论贵阳株结核杆菌菌株异烟肼耐药基因突变具有多态性,主要的变异类型为katG315位点突变。     

高分辨率熔解曲线技术用于结核分枝杆菌临床分离株异烟肼耐药性的快速检测

目的评价高分辨率熔解曲线分析技术(high-resolution melting curve,HRM)检测结核分枝杆菌异烟肼耐药性的应用价值。方法 1)通过传统比例法药敏实验对本实验室保存的49株结核分枝杆菌进行异烟肼耐药性分析。2)进一步对该结核分枝杆菌进行异烟肼耐药相关基因KatG基因和inhA基因进行异烟肼耐药决定区测序分析,筛查突变位点。3)根据筛查到的突变位点设计高分辨率熔解曲线分析所用的特异性引物,对异烟肼耐药基因耐药决定区进行高分辨率熔解曲线分析检测DNA突变,评估用高分辨率熔解曲线分析技术对结核分枝杆菌异烟肼耐药性检测的效率。结果 1)比例法药敏结果显示,49株实验菌株中20株为异烟肼耐药株,29株为异烟肼敏感株。2)测序分析结果显示:(1)KatG基因出现了4种突变形式,分别是234单位点突变;234、315双位点突变;234、463双位点突变;234、315、463三位点联合突变。(2)inhA基因检测到3种突变,即-8位、-15位、-152位。3)(1)对耐药株的基因突变进行分析发现:20株异烟肼耐药株中11株存在KatG基因第315位密码子的突变、占异烟肼耐药株的55%;6株存在inhA基因-15(4株)位碱基、-8(1株)位碱基、-152(1株)位碱基的突变,共占异烟肼耐药株的30%;2株同时存在基因KatG315密码子和inhA-15位碱基的突变,占异烟肼耐药株的10%;1株均未检测到KatG基因和inhA基因的突变,占异烟肼耐药株的5%。通过基因突变检测结核分枝杆菌异烟肼耐药性的敏感性为95%、特异性为100%。(2)用高分辨率溶解曲线检测实验菌株耐药基因突变的结果显示,18株存在基因突变,24株不存在基因突变,检测的灵敏度为94.7%、特异性为80%。(3)以高分辨率熔解曲线检测到突变为耐药的判断标准,检出19株为耐药株,24株为敏感株。以比例法药敏结果为参照,检测的灵敏度为95%、特异性为82.76%。结论高分辨率溶解曲线用于结核分枝杆菌对异烟肼耐药性的检测具有较好的灵敏度,耗时短,在异烟肼耐药结核病的快速诊断方面具有一定的应用价值。     

Mtb耐异烟肼基因变异株的体外最小抑菌浓度研究

目的 研究Mtb耐INH临床分离株katG基因、inhA基因、ahpC基因突变对其体外最小抑菌浓度（MIC）的影响。方法 对临床分离的耐INH的160株Mtb及对INH敏感的40株Mtb进行耐药基因芯片检测;并对所有标本进行INH MIC测定,比较不同变异株的MIC结果,其数据采用t检验进行比较,以P＜0.05为差异有统计学意义。结果 Mtb耐INH株katG 315基因变异占68.8%（110/160）,katG 315基因变异株的MIC为（20.20±19.46 μg/ml）,高于inhA变异株（0.73±0.82 μg/ml）（t′=10.9171,t′_α=1.9807,P＜0.05）;低于katG 315+inhA变异株（69.33±32.45 μg/ml）,（t′= 7.164,t′_α= 2.0627,P＜0.05）。结论 Mtb耐INH基因有不同的突变模式,各模式存在不同的耐药程度,此可以给临床用药进一步提供参考。     

耐异烟肼结核分枝杆菌临床分离株耐药相关基因突变研究

目的阐明结核分枝杆菌耐异烟肼临床分离株katG、inhA、ahpC、kasA及oxyR基因突变特点。方法对144株结核分枝杆菌临床分离株(耐异烟肼菌株101株;异烟肼敏感株43株)的katG、inhA、kasA、ahpC及oxyR基因进行DNA片断扩增及DNA序列分析,与GeneBank中结核分枝杆菌标准序列进行比较。结果(1)耐异烟肼菌株中未发现katG完全缺失,81株耐药株(80.2%)katG存在点突变、缺失或插入,其中16个突变位点未见报道;39株(38.6%)耐药株第315位点突变,低耐药菌株(1μg/ml)第315位点突变率显著高于高耐药菌株(10μg/ml;χ2=9.31,P<0.05);58株(57.4%)耐药株第463位点突变。23株(53.3%)敏感株第463位点突变。(2)5株(4.9%)耐药株inhA发生突变。敏感株inhA无突变。(3)3株(2.9%)耐药株ahpC发生突变。敏感株ahpC无突变。(4)17株(16.8%)耐药株kasA发生突变。敏感株中3株菌株Gly312Ser突变。(5)在全部菌株中未发现oxyR基因突变。(6)综合本项研究中各基因的突变情况,共有91株耐异烟肼菌株发生与异烟肼耐药相关的突变。结论本项研究进一步证实了结核分枝杆菌耐异烟肼与katG、inhA、ahpC及kasA基因突变之间的关系,并且提示还有其他机制参与异烟肼耐药。     

Prevalence of S315T mutation within the katG gene in isoniazid-resistant clinical Mycobacterium tuberculosis isolates from Dubai and Beirut.

OBJECTIVE: To determine the prevalence of S315T mutation within the katG gene that confers clinically significant resistance to isoniazid in isoniazid-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates recovered from tuberculosis patients in Dubai and Beirut. METHOD: A total of 28 and 17 isoniazid-resistant and seven and six susceptible clinical M. tuberculosis isolates from Dubai and Beirut, respectively, were tested. The presence of S315T mutation in the katG gene was detected by amplification of the DNA region around codon 315 by polymerase chain reaction followed by restriction digestion with Msp I to generate restriction fragment length polymorphism. The genotyping of the isolates carrying S315T mutation was carried out by touchdown double-repetitive-element PCR (DRE-PCR). RESULTS: The mutation S315T was detected in 18 (64%) of 28 isoniazid-resistant isolates from Dubai and in six (35%) of 17 resistant strains from Beirut. None of the susceptible strains contained this mutation. The genotyping studies showed that the majority of the isolates carrying the S315T mutation exhibited unique DNA banding patterns. CONCLUSION: The data show a varying prevalence of S315T mutation within the katG gene in M. tuberculosis strains isolated from the two geographical locations, Dubai and Beirut.     

124例耐多药结核分枝杆菌基因突变特征分析

目的对临床分离的耐多药结核分枝杆菌相关基因的突变特征进行分析。方法对124例耐多药结核分枝杆菌以及50株敏感株的耐药相关基因(包括异烟肼inh A、kat G、oxyR-ahp C间隔区以及利福平rpo B)进行序列测定,分析其基因突变情况。结果异烟肼耐药inh A基因突变率为14.5%;kat G基因突变率为70.2%(87/124),主要位于315位;oxyR-ahp C间隔区突变率为15.3%;inh A、kat G两种基因同时突变率75.0%,三种基因同时突变率为89.5%。利福平rpo B基因突变的检出率高达95.2%,突变主要发生在531、526、516位点。结论我省耐多药菌异烟肼耐药相关基因最常见突变为kat G 315、inh A C-T(-15)、axyR-ahp C间隔区(-10)C-T,利福平为rpo B531、526、516。结合MDR-TB耐药相关基因的特征分析,可以建立一种快速、准确、特异的适合于我省的检测结核菌耐多药性的新方法。     

结核分枝杆菌对异烟肼和利福平的耐药水平与其耐药基因突变的相关性研究

目的 探讨Mtb耐药相关基因katG、inhA、oxyR-ahpC突变与对INH的耐药水平及rpoB突变与对RFP的耐药水平的关系。 方法 采用微孔板Alamar blue显色法分别检测59株耐INH的Mtb临床分离株对INH和30株耐RFP菌株对RFP的最低抑菌浓度（the minimum inhibitory concentration,MIC）,同时用直接测序法检测对INH耐药菌株katG、inhA、oxyR-ahpC和对RFP耐药菌株rpoB的突变情况。 结果 INH MIC为0.2500~1.0000 μg/ml（低水平耐药菌株）和 MIC≥2.0000 μg/ml（高水平耐药菌株）的INH耐药株,inhA启动子突变率前者高于后者［53.8% (7/13),4.3% (2/46)］,katG 315突变率前者低于后者［15.4% (2/13),76.1% (35/46)］,χ²值分别为15.57和13.48,P值均为0.000。RFP MIC为0.5000～16.0000 μg/ml和MIC≥32 0000 μg/ml的RFP耐药株,rpoB 531和526位总突变率前者低于后者［62.5% (5/8),95.5%(21/22)］,P_确切概率＝0.048。 结论 INH耐药菌株inhA启动子突变与INH低水平耐药有关,katG 315突变与INH高水平耐药有关;rpoB 531和526位突变与RFP高水平耐药有关。