人细胞色素CYP2E1基因重组杆状病毒粘粒构建

目的 构建人细胞色素P450 2E1(CYP2E1)基因cDNA重组的杆状病毒粘粒.方法 采用PCR方法,从国外获赠的含有CYP2E1基因cDNA的质粒中扩增CYP2E1 cDNA.将该基因的cDNA连接到测序载体pCMV-Myc载体上,通过内切酶分析及测序加以鉴定,然后将该基因的cDNA克隆到转座载体pFASTBac1载体,转化入DH10Bac大肠埃希菌感受态细胞中,提取含有CYP2E1基因的重组杆状病毒粘粒,并经PCR鉴定分析.结果 测序结果显示,该克隆片段含有CYP2E1完整的编码区,所获得的重组杆状病毒粘粒含有完整1.5kb大小的该片段.结论 获得重组CYP2E1杆状病毒粘粒,为下一步转染昆虫细胞,利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统大量表达人细胞色素P450 2E1蛋白打下基础.     

卵巢癌相关基因HE4在杆状病毒表达系统的表达与鉴定

目的:使卵巢癌相关基因HE4在杆状病毒表达系统中获得表达。方法:将卵巢癌相关基因HE4克隆到pMagic-his-HE4中,通过转化E.coliDH10B筛选克隆,阳性克隆通过接合转移的方式与杆状病毒框架质粒体外重组,构建Bac-phes-HE4杆状病毒表达载体,后者经Lipofectamine2000介导转染Sf9细胞,获取重组病毒,扩增病毒并感染Sf9细胞进行表达,SDS-PAGE、Western blot分析鉴定表达蛋白。结果:经HE4抗体、6×His单抗鉴定,成功通过杆状病毒表达系统获得重组卵巢癌相关基因HE4。结论:卵巢癌相关基因HE4通过接合转移的方法在杆状病毒表达系统中成功表达。     

甲型H1N1流感病毒核蛋白NP的真核表达

目的构建甲型SWH1N1流感病毒核蛋白(NP)的杆状病毒真核表达载体,转染sf9细胞表达并纯化其编码蛋白。方法从江苏SWH1N1流感病毒毒株(A/Jiangsu/1/2009(H1N1))提取病毒RNA,采用RT-PCR技术扩增NP基因,将其克隆至pMD18-TSimple Vector中构建pMD18-T/NP质粒,双酶切pMD18-T/NP与p-fast后,连接构建真核表达载体p-fast-NP,转化DH10Bac细胞,转座构建杆状病毒NP-Bacmid,经酶切及测序鉴定后将NP-Bacmid转染到sf9细胞中,通过免疫印迹法鉴定NP蛋白的表达,采用亲和层析法纯化NP蛋白。结果经双酶切、测序鉴定证实NP基因的真核表达载体构建成功;免疫印迹法证实NP基因的表达;纯化获得了高纯度的NP蛋白。结论成功克隆了NP基因,并构建了其杆状病毒真核表达载体,该表达载体的构建为后期的流感病毒快速检测以及基因工程疫苗制备奠定了良好的基础。     

汉坦病毒核蛋白在免疫荧光诊断技术中的应用

目的从国内生产肾综合征出血热（HFRS）疫苗Z10株中克隆汉坦病毒核蛋白基因,应用杆状病毒-昆虫细胞表达系统使其在昆虫细胞中表达,制成抗原片,用于检测血清中汉坦病毒抗体.方法从汉坦病毒Z10株感染细胞上清液中提取病毒RNA,应用RT-PCR方法扩增S基因,与穿梭质粒连接并转化大肠杆菌,得到重组穿梭质粒.将其转化含杆状病毒基因组的大肠杆菌,筛选出含S基因的重组杆状病毒DNA的大肠杆菌,提取重组杆状病毒DNA转染昆虫细胞,应用ELISA法及间接免疫荧光法检测重组蛋白的抗原性.结果用RT-PCR方法扩增得到S基因,筛选出的重组杆状病毒感染细胞sf9,制成抗原片.此抗原片仅与HFRS阳性患者血清起反应,而与正常人及其它发热患者血清不起反应.检测浙江省各医院送检的97份疑似肾综合征出血热患者血清及36份正常人血清,与传统的抗原片比较,阳性符合率为100%.结论可以应用杆状病毒-昆虫细胞表达系统表达汉坦病毒重组蛋白.以此制备的抗原片,可用于患者血清中汉坦病毒抗体检测,具有特异性强、敏感性高,试剂制备简单、安全,为诊断肾综合征出血热提供新的途径和手段.     

汉坦病毒全NP蛋白及其型特异区编码基因的克隆及表达

目的：开发简单、可靠的HTN、SEO型血清学分型检测方法。方法：应用RT－PCR法对全NP蛋白基因及其型特异区基因进行扩增，经TA克隆及Cui-SS、Cui-155杆状病毒载体的构件、转座、获重组杆状病毒，再感染Sf9细胞进行表达。结果：克隆与表达了SEO病毒NP蛋白的全蛋白编码区及型特异编码区（155到429氨基酸处的编码基因），全NP蛋白表达产物与病毒株感染VeroE6细胞的反应谱完全一致，型特异区表达产物与相应的型特异McAb结合。结论：建立了SEO型病毒全NP蛋白及NP蛋白型特异区编码基因的克隆和表达方法，为开发简便、可靠的SEO型血清学分型检验方法奠定了基础。     

SEO型汉坦病毒全NP蛋白及NP蛋白型特异区编码基因的克隆、表达

目的：开发简单、可靠的HTN、SEO型汉坦病毒血清学分型检测方法。方法：应用RT－PCR法对全NP蛋白基因及其型特异区基因进行扩增，经TA克隆及Cui-SS、Cui-155杆状病毒载体的构件、转获重组杆状病毒，再感染Sf9细胞进行表达。结果：克隆与表达了SEO病毒NP蛋白的全蛋白编码区及型特异编码区（155到429氨基酸处的编码基因），全NP蛋白表达产物与病毒株感染Vero E6细胞的反应谱完全一致，型特异区表达产物与相应的型特异cAb结合。结论：建立了SEO型病毒全NP蛋白及NP蛋白型特异区编码基因的克隆和表达方法，为开发简便、可靠的SEO型血清学分型检验方法奠定了基础。     

汉坦病毒G2糖蛋白在昆虫细胞中的表达及其在免疫诊断中的应用

目的构建汉坦病毒(HV）Z10株包膜糖蛋白G2基因的重组表达载体，探索其在昆虫细胞中的表达及在免疫荧光诊断中的应用。方法以质粒pUCm—Z10M为模板设计引物，用聚合酶链反应(PCR)扩增Z10株G2基因片段，将G2片段克隆入pUCm—T质粒载体，碱法提取质粒pUCm-Z10-G2，酶切后将回收片段插入杆状病毒转移载体pFastBacHTa，构建重组体pFastBacHTa-Z10-G2，重组体转化感受态细胞E．coli DH10Bac后，经2轮筛选，提取重组质粒转染昆虫细胞sf9，并用间接免疫荧光技术检测表达的G2蛋白。结果获得含有编码HV Z10株的包膜糖蛋白G2基因的重组质粒，转染昆虫细胞表达出G2蛋白，与肾综合征出血热(HFRS)阳性血清反应，昆虫细胞内呈现特异性环状荧光。检测40份HFRS血清，与全病毒细胞抗原片的符合率为95％。结论成功构建HV Z10株包膜糖蛋白G2基因的表达载体，并在昆虫细胞中表达。可利用重组G2蛋白检测HV感染。     

汉坦病毒S基因真核表达载体的构建及表达

目的 将编码汉坦病毒76-118株核蛋白的S基因片段克隆到真核表达载体DTARGET TM，构建含汉坦病毒核蛋白S基因的重组真核表达质粒pTARGET-hans，并在体外进行瞬间表达。方法 采用PCR产物直接克隆方法，将核蛋白S基因插入到真核表达载体pTARGE TM中；酶切鉴定；用电穿孔法将重组质粒转染入Vero-E6细胞；用间接免疫荧光法检测其表达产物。结果 酶切鉴定证实S基因已被正确地插入pTARGET TM中；在部分转染重组质粒的Vem-E6细胞胞质内观察到中等强度的特异性荧光。结论 重组的真核表达载体pTARGET-hans已被成功地构建并可在体外表达．为下一步基因免疫打下基础。     

高致病性禽流感病毒H5N1亚型核蛋白NP真核表达载体的构建、表达与鉴定

目的构建高致病性禽流感病毒H5N1亚型核蛋白(NP)的真核表达载体,并在哺乳动物细胞中表达、鉴定其编码重组蛋白NP。方法采用RT-PCR法扩增NP基因,T-A克隆到pMD18-T载体中构建pMD18-T-NP质粒。经PCR、双酶切鉴定后,双酶切阳性质粒与pXJ40-HA载体,电泳后胶回收,连接目的片段,构建pXJ40-HA-NP质粒,经PCR、双酶切、测序分析鉴定为阳性的质粒即为NP蛋白的真核表达载体。转染293T细胞后,采用免疫印迹法(Western blot)鉴定重组NP蛋白的表达。结果成功构建了高致病性禽流感病毒H5N1亚型NP基因的真核表达载体,并在293T细胞中成功表达出分子量为56kD的重组蛋白。结论成功构建的NP蛋白真核表达载体为进一步研究其功能,研发高致病性禽流感病毒H5N1亚型的诊断、治疗方法和疫苗奠定了基础。     

Ⅰ型流感病毒核蛋白（NP）基因在大肠杆菌中的表达与鉴定

目的：以Ⅰ型流感病毒RNA为模板扩增NP全基因cDNA，并在大肠杆菌中进行表达与鉴定。方法：提取流感病毒RNA，以RT—PCR法扩增编码NP基因cDNA。将扩增所得NP基因克隆于pMD18-T载体，然后定向亚克隆NP基因于原核表达载体pET-28a的多克隆位点中，经酶切鉴定后，将含有NP基因的重组质粒命名为pET-NP。用pET-NP转化受体菌BL21，在大肠杆菌BL21中表达，用诱导剂IPTG以不同浓度进行诱导，并在不同诱导时间收集样品，用SDS-PAGE和Western blot检测表达产物。结果：经SDS-PAGE电泳分析证实NP基因获得了表达，并在终浓度为1mM的IPTG诱导下，6h其表达量达到高峰，经Western—blot分析证实表达的重组核蛋白具有免疫反应活性，大小约为60kd。结论：流感病毒核蛋白基因编码区基因获得成功克隆和构建，为流感病毒诊断试剂及单抗的研制工作提供了基础材料。     

水痘-带状疱疹病毒糖蛋白I基因在昆虫细胞中的表达及纯化

目的 将北京水痘-带状疱疹病毒(VZV)84-7株克隆糖蛋白I(gpI)基因在杆状病毒-昆虫细胞表达系统中表达,并对其表达产物进行纯化。方法 采用PCR方法从VZVDNA中扩增gpI全基因序列,并将其插入杆状病毒转移质粒pBacPAK9中,获得重组转移质粒pBacVZVgpI,对pBacVZVgpI中的插入基因进行测序。重组转移质粒与线性杆状病毒BacPAK6DNA(Bsu36Idigested)共转染Sf9昆虫细胞,获得重组病毒BacPAK-gpI。通过亲和层析纯化重组蛋白,并检测其抗原性。结果 PCR扩增得到gpI基因,测序结果表明克隆的外源基因正确。经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS—PAGE)、免疫印迹(weotem-blot)方法证明gpI基因在昆虫细胞中获得表达,表达产物在培养72h达到高峰,重组蛋白的相对分子质量约为58000和70000,与理论值相符,蛋白质加工与天然蛋白类似。动物实验结果表明,重组蛋白具有较好的免疫原性,可刺激小鼠产生中和抗体。SDS—PAGE检测纯化的重组蛋白,纯度达80％。纯化蛋白经western-blot和ELISA检测后显示,具有特异的抗体结合活性。结论 应用昆虫细胞表达水痘-带状疱疹病毒gpI基因,可为水痘-带状疱疹病毒抗原定量分析、糖蛋白ELISA的研制和制备亚单位疫苗提供基础。     

H7N9亚型禽流感病毒核蛋白NP原核表达载体的构建与表达

目的构建甲型H7N9禽流感病毒NP基因的原核表达载体,并表达其编码重组蛋白。方法 RT-PCR法扩增H7N9病毒NP基因,克隆至原核表达载体PET28a(+)中,构建表达载体PET28a(+)-NP质粒;经PCR、双酶切、测序鉴定后,将PET28a(+)-NP质粒转化表达菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达NP重组蛋白。应用western blot法鉴定NP蛋白的表达。结果成功构建NP基因的原核表达载体,在大肠杆菌中表达出分子量为56kD的NP重组蛋白。结论实现了禽流感病毒H7N9NP重组蛋白在原核系统中的高效表达,为禽流感诊断试剂及单抗的研发工作奠定了基础。     

H5N1禽流感病毒血凝素和神经氨酸酶基因在杆状病毒中的共表达

目的构建共表达H5N1禽流感病毒血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)蛋白的杆状病毒表达系统。方法利用PCR方法分别扩增A/Hubei/1/2010(H5N1)病毒的HA和NA基因,克隆至经改造带有对虾白斑综合病毒(WSSV)早期启动子iel的mpFastBac Dual载体,构建mpFast Bac-HA-NA表达质粒,转化DH10Bac感受态细胞,用获得的Bacmid-HA-NA穿梭质粒转染sf9细胞,获得重组杆状病毒Bac-HA-NA;提取重组杆状病毒Bac-HA-NA的DNA并使用PCR方法检测;利用Western blot检测HA和NA表达,并分别检测重组杆状病毒Bac-HA-NA红细胞凝集能力和神经氨酸酶活性。结果经PCR鉴定,构建的质粒Bacmid-HA-NA正确;Western blot检测表明Bacmid-HANA能在sf9细胞中有效表达HA和NA蛋白,生物活性检测表明Bac-HA-NA能引起红细胞凝集并具有神经氨酸酶活性。结论获得了能同时表达禽流感病毒HA和NA的重组杆状病毒Bac-HA-NA,为进一步研究流感疫苗奠定了基础。     

Recombinant hemagglutinin protein of rinderpest virus expressed in insect cells induces humoral and cell mediated immune responses in cattle.

Rinderpest virus causes a highly contagious and often fatal disease in domestic and wild ruminants. The surface glycoproteins, hemagglutinin (H) and fusion (F) proteins of this enveloped virus are known to confer protective immunity in cattle. We have reported the generation of a recombinant baculovirus expressing H protein and studied its protective properties in cattle. In this report, we demonstrate that the recombinant baculovirus encoded H protein expressed in insect cells gets incorporated into extracellular baculovirus. Single administration of low doses of purified recombinant extracellular virus with or without adjuvant induces virus neutralizing antibody responses and bovine leukocyte antigen (BoLA) class II restricted helper T cell responses in cattle.