PPARγ2表达诱导NIH3T3成纤维细胞向脂肪细胞分化

目的应用重组逆转录病毒载体介导小鼠过氧化物酶体增殖体激活的受体γ2(mPPARγ2)基因在NIH3T3成纤维细胞中表达,并进一步研究其功能.方法从经荧光测序证实含正确mPPARγ2 cDNA序列的重组质粒pcDNA3/mPPARγ2中,双酶切下mPPARγ2全长cDNA序列,亚克隆入逆转录病毒载体pGCEN中,构建重组逆转录病毒载体pGCEN/mPPARγ2.用PA317细胞对pGCEN/mPPARγ2及pGCEN进行包装,并用G418进行PA317细胞抗性克隆筛选,收集病毒上清,感染靶细胞NIH3T3成纤维细胞.表达mPPARγ2的NIH3T3成纤维细胞在含PPARγ激活物5,8,11,14-二十碳四烯酸(ETYA)等分化介质中培养,可被诱导向脂肪细胞分化.结果构建了含mPPARγ2全长cDNA重组逆转录病毒载体pGCEN/mPPARγ2,获得了较高pGCEN/mPPARγ2及pGCEN的逆转录病毒上清.重组逆转录病毒载体可介导mPPARγ2在NIHT3T3成纤维细胞胞核中表达.油红O染色证实,表达mPPARγ2的NIHT3T3成纤维细胞在分化介质中培养分化10天后,胞浆中明显积聚了较多的中性脂肪,其细胞形态也与体内成熟脂肪细胞相似,而且这些细胞表达脂肪细胞特异性标志基因如AP2和leptin.结论本研究在体外成功地建立了由PPARγ2诱导NIH3T3成纤维细胞向脂肪细胞分化的模型,为进一步研究PPARγ2诱导脂肪细胞分化的分子机制奠定了基础.     

IL-6对NIH3T3细胞MMP-3和TIMP-1表达影响

目的探讨白细胞介素-6(IL-6)对小鼠NIH3T3成纤维细胞中基质金属蛋白酶-3(MMP-3)、金属蛋白酶组织抑制剂1(TIMP-1)表达的影响。方法应用不同浓度(0、5、10、15、20 mg/L)的IL-6刺激NIH3T3成纤维细胞,共同培育12 h收集细胞。应用Western blot和RT-PCR方法分别检测细胞内MMP-3和TIMP-1的表达。结果 MMP-3表达随着IL-6浓度的升高而上升,TIMP-1表达随着IL-6浓度的升高而下降。结论 IL-6能影响MMP-3和TIMP-1的表达平衡,可能是影响硬膜外瘢痕形成的机制之一。     

桂皮醛对小鼠成纤维细胞瘤NIH3T3细胞碱性成纤维细胞生长因子及转化生长因子β1表达的影响

目的 研究桂皮醛刺激小鼠成纤维细胞瘤NIH3T3细胞后碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)及转化生长因子β1(TGF-β1)蛋白在不同时相点表达的规律,探讨桂皮醛促进成纤维细胞增殖及胶原合成的机制.方法 采用MTT法观察不同质量浓度桂皮醛对NIH3T3细胞增殖的影响;利用羟脯氨酸(Hyp)测试法测定细胞上清中胶原水平;利用免疫细胞化学技术检测桂皮醛对NIH3T3细胞bFGF、TGF-β1蛋白表达的影响.结果 桂皮醛作用NIH3T3细胞48 h后,细胞增殖速度和细胞上清中的胶原量均较对照组明显增加.桂皮醛刺激后,bFGF和TGF-β1蛋白表达增加,其中bFGF蛋白表达高峰在18 h,TGF-β1蛋白在刺激后12 h达到峰值.结论 桂皮醛可以上调内源性生长因子bFGF、TGF-β1蛋白的表达,这可能是桂皮醛体外促进NIH3T3细胞增殖及胶原合成,以及在创伤愈合、组织修复方面发挥作用的分子生物学机制.     

受体介导甲胎蛋白对NIH3T3细胞增殖的促进作用

目的:探讨甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)促新生细胞增殖作用的分子机理。方法:从人脐带血中提取的AFP作用于体外培养的NIH3T3细胞;用3H-TdR参入法观察AFP对细胞DNA合成的影响以及放射受体分析法分析NIH3T3细胞膜表面AFP受体分布;观察在AFP作用下细胞内的第二信使物质环磷酸腺苷(cAMP)浓度及依赖cAMP激活的蛋白激酶A(PKA)活性的改变;Westernblot分析AFP对增殖相关的P21ras表达的影响。结果:10～80mg/L的AFP对NIH3T3细胞的DNA合成有明显的促进作用,与对照组比较最大增幅为121.9%;在NIH3T3细胞膜表面存在2种不同解离平衡常数(KD)的AFP受体,KD1=2.722nmol/L(12810位点/细胞);KD2=89.305nmol/L(119700位点/细胞);AFP能显著提高NIH3T3细胞内的cAMP浓度及PKA活性;对P21ras的表达也有明显的促进作用。结论:AFP促NIH3T3细胞增殖是通过细胞膜表面受体介导,经跨膜cAMP-PKA信号转导途径,影响基因表达来实现的。     

Ca2+在紫外线诱导成纤维细胞凋亡中的作用

目的了解细胞内外钙离子浓度对紫外线(UVB)辐射诱导成纤维细胞(NIH3T3)凋亡作用的影响.方法 UVB照射成纤维细胞10 min,培养12 h后,用流式细胞仪测定凋亡率. 结果 UVB照射组比UVB不照射组凋亡率有明显增加;UVB照射组内各组间凋亡率因细胞内外Ca2+浓度不同存在明显差异. 结论 UVB辐射诱导成纤维细胞发生凋亡与胞内外Ca2+浓度有关,Ca2+参与了凋亡的信号转导.UVB诱导成纤维细胞发生的凋亡,主要通过Ca2+转导凋亡信号这一途径,还反映出胞浆Ca2+升高既来源于胞内钙池,又来源于胞外游离Ca2+.     

Piwil2基因表达诱导NIH3T3细胞恶性转化

目的 通过建立稳定表达外源Piwil2基因的NIH3T3细胞,初步探讨Piwil2基因对NIH3T3细胞生物学特性的调控作用.方法 通过脂质体介导的方法和G418的筛选,建立稳定表达Piwil2基因的NIH3T3细胞株,之后利用细胞集落形成实验、细胞增殖实验、细胞周期分析和裸鼠成瘤实验,观察Piwil2基因表达对NIH3T3细胞的生物学特性的影响.结果 建立了稳定过表达Piwil2基因的NIH3T3细胞株.与对照组空白载体细胞系相比,过表达Piwil2基因的NIH3T3细胞增殖和集落形成能力增强;细胞周期G0/G1期减少、S期明显升高;接种裸鼠后形成的肿瘤体积显著大于对照组.结论 Piwil2基因在NIH3T3细胞中稳定表达具有诱导正常NIH3T3细胞发生恶性转化的重要生物功能.     

钒化钠对小鼠成纤维细胞NIH3T3细胞株增殖影响的研究

目的探讨不同浓度钒化钠(sodium vanadate,SV)对小鼠成纤维细胞NIH3T3细胞株增殖作用的影响。方法将培养的NIH3T3细胞给予不同浓度及时间的SV刺激,以噻唑蓝(MTT)比色法检测小鼠成纤维NIH3T3细胞增殖及增殖抑制情况。结果与对照组比较,0.1μM对细胞增殖无影响(P>0.05);1.0、5.0、10.0μM SV可以促进细胞增殖,而200μM SV抑制其增殖(P<0.01),不同处理时间变化趋势一致;100μM SV对细胞作用随处理时间不同而不同。结论SV对NIH3T3细胞增殖作用因处理剂量和时间不同而呈现差异。     

苦参素对NIH/3T3成纤维细胞增殖及细胞外基质合成的影响

目的 观察苦参素对NIH／3T3成纤维细胞增殖及其细胞外基质(ECM)合成的影响,探讨苦参素抗肝纤维化的可能作用机制。方法 采用噻唑蓝比色法、流式细胞技术检测苦参素对NIH／3T3成纤维细胞增殖及细胞周期的影响,采用放射免疫方法检测苦参素对其合成透明质酸(HA)、Ⅳ型胶原(Ⅳ-C)等ECM的影响。结果 苦参素可抑制NIH／3T3成纤维细胞的增殖,减少S期细胞,降低细胞增殖指数,抑制ECM的合成,并呈剂量依赖关系。结论 苦参素可能通过影响成纤维细胞的增殖、抑制成纤维细胞的分裂和ECM的合成发挥其抗肝纤维化作用。     

乙醇对NIH 3T3成纤维细胞成脂分化的影响

目的观察乙醇对NIH 3T3成纤维细胞分化为脂肪细胞的作用,及其对成脂转录因子PPARγ表达的影响.方法以不同浓度乙醇作为诱导剂处理NIH 3T3成纤维细胞14 d,苏丹Ⅳ染色,采用电子计算机图像分析软件Image Pro Plus 4.1,确定脂肪细胞百分比.采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,检测细胞PPARγ mRNA的表达.结果以递增浓度(0.03 mol/L、0.06 mol/L、0.09 mol/L、0.15 mol/L、0.21 mol/L)乙醇处理NIH 3T3成纤维细胞14 d,在0.06 mol/L、0.09 mol/L、0.15 mol/L、0.21 mol/L乙醇组中,脂肪细胞百分比和PPARγ mRNA表达均比对照组明显增高,差异均有统计学意义(P<0.001).0.03 mol/L乙醇组与对照组间的脂肪细胞百分比和PPARγ mRNA表达差异均无统计学意义(P>0.05).结论乙醇能够直接诱导NIH 3T3成纤维细胞大量分化为脂肪细胞,这可能是乙醇性骨坏死时骨髓内脂肪增多的原因之一.     

视交叉上核脑片诱导NIH/3T3成纤维细胞中分子时钟的节律性表达

目的 研究视交叉上核(suprachiasmatic nucleus,SCN)脑片对共培养的NIH/3T3成纤维细胞中分子时钟的诱导作用.方法 10d龄SD大鼠,取SCN脑片,与NIH/3T3成纤维细胞共培养.连续24h,间隔6h收获细胞,抽提细胞总RNA,实时定量RT-PCR检测时钟基因Per1和Rev-erbα mRNA表达规律.结果 10张SCN脑片与NIH/3T3细胞共培养6d可诱导细胞中Rev-erbα和Per1节律性表达(P<0.01);Rev-erbα和Per1的表达高峰分别为CT5和CT11.减少共培养时间至2d或脑片数量至2片,仍可诱导Rev-erbα的节律性表达(P<0.05).而诱导per1的节律性表达至少需要6d共培养时间和6张脑片(P=0.031).结论成功建立SCN脑片与细胞共培养模型,为研究SCN对外周组织细胞的调控打下基础,Rev-Erbα和Per1的波动表达并非同时发生,前者对SCN信号更加敏感.     

血小板生长因子对肌醇磷酸代谢的影响

血小板生长因子（ＰＤＧＦ）能明显地影响细胞肌醇磷酸代谢，在亲代ＮＩＨ３Ｔ３成纤维细胞（简称ＮＩＨ３Ｔ３细胞）和多瘤病毒ｍｉｄｄｌｅＴ抗原转化的ＮＩＨ３Ｔ３成纤维（简称ＭＴ３细胞）中，表现出不同的应答。在ＮＩＨ３Ｔ３细胞中，ＰＤＧＦ刺激１ｍｉｎ时，表现为肌醇－１、４、５－三磷酸［Ｉｎｏｓｉｔｏｌ１，４，５－Ｔｒｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ；Ｉｎｓ（１，４，５）Ｐ３］明显地增加并达到峰值，持续时间的３￣４ｍ     

桂皮醛对NIH3T3细胞增殖和细胞周期的影响

目的观察肉桂主要成分桂皮醛对NIH3T3细胞增殖的影响。方法采用MTT法观察不同浓度桂皮醛对NIH3T3细胞增殖的影响,并采用流式细胞仪检测桂皮醛对NIH3T3细胞周期的影响。结果桂皮醛作用NIH3T3细胞48 h后,细胞增殖速度较对照组明显增加,增殖率为15%(P<0.01)。流式细胞仪检测结果显示,桂皮醛作用24 h后NIH3T3细胞S期比例上升了3%(P<0.05),G2/M期比例无明显升高,细胞增殖指数(PrI)增加了3.5%(P<0.01)。结论桂皮醛可促进NIH3T3的增殖,这种促增殖作用可能是通过调节细胞周期使更多细胞进入S期而实现的。     

分泌性hrCEMP1在NIH3T3细胞中的表达

目的:通过转基因技术建立稳定表达hrCEMP1的成纤维细胞株.方法:利用高效率的阳离子聚合物,将含有hrCEMP1编码序列的真核表达质粒pcDNA3.1-hrCEMP1转染入NIH3T3细胞中,用G418筛选获得稳定转染细胞株,以RT-PCR检测hrCEMP1基因转录,以酶联免疫吸附试验(ELISA)检测hrCEMP1...     

人VEGF在NIH3T3细胞中的基因转移和表达

目的研究人血管内皮细胞生长因子(human VEGF)在体外培养的小鼠成纤维细胞(NIH3T3细胞)中的基因转移及表达,为血管化组织工程、缺血性疾病的治疗奠定实验基础。方法应用脂质体介导的基因转移技术,将含有人VEGF165编码序列的真核表达载体pcDNA/V转染至体外培养的NIH3T3细胞系中。G418筛选出稳定表达重组质粒的细胞克隆,转接于细胞瓶中,培养72 h,同时以G418筛选的pcDNA3.1(+)阳性细胞克隆和未转染的NIH3T3细胞为阴性对照,取细胞培养上清及细胞裂解液样品进行Western blotting检测。用细胞免疫组织化学染色检测人VEGF165基因在NIH3T3细胞中的表达情况,不着色者为阴性,细胞胞质着色呈棕黄(褐)色者为阳性。结果Western blotting结果显示在转染pcDNA/V质粒的NIH3T3细胞培养上清中,可以检测到相对分子质量为22 000的反应条带,与预计的人VEGF165单体蛋白的相对分子质量相符。细胞免疫组织化学染色检测结果显示,转染pcDNA/V质粒的NIH3T3细胞呈阳性。结论人VEGF165能够在NIH3T3细胞中有效表达,并获得了稳定表达人VEGF165基因的NIH3T3细胞株。     

核仁磷酸蛋白突变基因表达对NIH3T3细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨核仁磷酸蛋白(nucleophosmin,NPM)突变基因对小鼠NIH3T3成纤维细胞系体外增殖和凋亡的影响以及其分子机制。方法通过脂质体介导将真核表达载体pEGFP-C1-NPMc+转染NIH3T3细胞,G418筛选稳定表达NPM突变蛋白细胞株,RT-PCR和Western blot检测NPM突变基因和蛋白的表达。MTT、克隆形成实验检测细胞体外增殖能力;FCM检测细胞周期分布及凋亡水平的改变,并通过对周期调控因子p21及凋亡相关分子Caspase-3活性检测,初步探讨NPM突变参与细胞恶性增殖的分子机制。结果建立了稳定表达NPM突变基因的NIH3T3细胞株。NPM-mA实验组细胞较对照组细胞增殖能力及平板克隆形成率明显增高(P<0.05);甲基纤维素集落形成实验显示各组细胞在甲基纤维素上均不能形成集落;与对照组比较,NPM-mA实验组细胞中G1期细胞比例(42.27±0.86)%显著减低(P<0.01),S期细胞比例(43.08±0.74)%显著增加(P<0.01),同时伴有p21 mRNA水平下降,稳定表达NPM突变基因的NIH3T3细胞凋亡率(1.00±0.13)%明显降低(P<0.01),C...     

Effects of secretive bone morphogenetic protein 2 induced by gene transfection on the biological changes of NIH3T3 cells

Background Bone morphogenetic proteins (BMPs), which belong to the transforming growth factor beta superfamily, are powerful regulators of cartilage and bone formation. This study investigated the biological changes of NIH3T3 cells incubated with secretive BMP2 that was induced by gene transfection through transwell. Methods Eukaryonic expression vector (pcDNA3.1-B2) was transfered into NIH3T3 cells with Sofast&#8482;,a positive compound transfection agent. The positive cell clones were selected with G418. The cytoplasmic and extracellular expressions of BMP2 were determined by immunohistochemical stain and enzyme-linked immunosorbent assay. NIH3T3 cells were co-cultured with hBMP2 gene transfecting cells through transwell, and the ultrastructure, alkaline phosphatase activity and the expression of osteocalcin (the marker of osteogenetic differentiation) changes were observed. Results There were cytoplasmic and extracellular expressions of BMP2 in transfecting NIH3T3 cells. The ultrastructural changes, the high activity of alkaline phosphatase and the positive stain of osteocalcin suggested the osteogenetic differentiation tendency of NIH3T3 cells co-cultured with transfecting NIH3T3 cells. Conclusion Secretive BMP2 that is induced by gene transfection could promote the osteogenetic differentiation of fibroblast cells.     

视交叉上核脑片与NIH/3T3成纤维细胞共培养模型的建立

目的建立视交叉上核(suprachiasmatic nucleus,SCN)脑片与NIH/3T3成纤维细胞共培养的分子时钟诱导模型。方法选用7日龄SD大鼠,分离SCN脑片或皮层脑片,分别与NIH/3T3细胞共培养,分为SCN共培养组和对照组皮质共培养组,6d后连续24h每间隔6h收集NIH/3T3细胞,抽提细胞总RNA,实时定量RT-PCR检测时钟基因Per1mRNA水平。结果SCN共培养组Per1的表达均表现明显的节律性(P=0.001),对照组大脑皮质共培养组Per1基因表达均无明显节律性变化。结论成功建立SCN脑片与NIH3T3细胞共培养模型并诱导细胞内分子时钟的节律性表达,为研究SCN调控外周组织细胞生物节律提供有力工具。     

MTT法检测博莱霉素对小鼠肺成纤维细胞增殖的影响

目的：观察不同浓度和时间的博莱霉素对小鼠肺成纤维细胞（NIH3T3细胞）增殖的影响。方法：取对数生长期的NIH3T3细胞,用10%胎牛血清培养制成的细胞悬液加入96孔培养板中培养。以NIH3T3细胞为观察对象,分别给予不同浓度（0.1~10 000 mU/mL）博莱霉素处理,于给药后12 h、36 h、48 h后采用4-甲偶氮唑蓝（MTT）法检测细胞增殖。结果：与空白对照组比较,1~10 mU/mL浓度的博莱霉素,可促进NIH3T3细胞增殖（P〈0.05）。其余浓度博莱霉素对细胞增殖无影响。结论：1~10mU/mL浓度的博莱霉素能够促进NIH3T3细胞的增殖。     

人乳头瘤病毒16型基因组体外转化活性的研究

目的应用重组的人乳头瘤病毒16型（HPV－16）基因组体外转化NIH／3T3细胞，以评价HPV－16的转化活性。方法将HPV－16基因组正向括人pSV2／neo质粒，构建成pSV2－neo／HPV－16真核细胞表达质粒；用磷酸钙转染法，将其导人体外培养的NIH／3T3细胞；对经转化的细胞进行G418选择培养和核酸杂交分析。结果经选择培养获得了具有恶性表型的转化细胞，其主要表现为接触性抑制消失和非锚地依赖性生长；核酸杂交证明，转化细胞内含有HPV—16DNA序列。结论HPV—16基因组具有体外转化NIH/3T3细胞的活性。