成年兔雪旺细胞体外培养增殖和纯化的实验研究

目的探讨从成年大白兔周围神经体外分离、纯化、培养的条件，观察雪旺细胞在体外存活、生长情况，目的在于改进雪旺细胞的体外培养条件，寻找一种较好的获取雪旺细胞的方法。方法利用成年兔发生Wallerian变性的双侧坐骨神经，剪碎至1mm的植块，经改良后反复差速贴附法进行培养，应用b-FGF刺激SC增殖；采用相差显微镜下观察雪旺细胞状态计数和S-100细胞免疫组化染色相结合鉴定；绘制生长曲线，按照细胞倍增时间公式计算其倍增时间。结果采用发生Wallerian变性后的兔双侧坐骨神经，经改良后差速贴壁培养方法能够明显抑制成纤维细胞的生长，但对雪旺细胞的生长影响较小，可获得大量高纯度的雪旺细胞，经S-100蛋白免疫组化鉴定，雪旺细胞纯度达94％以上，细胞数量达1×10^6／mL以上；绘制其生长曲线，并计算得出体外培养的第三代雪旺细胞体外倍增时间为3d；一定浓度的b-FGF和NGF可促进雪旺细胞的增殖。结论①联合采用发生Wallerian变性后的神经、改良差速贴壁培养、b-FGF和NGF促进雪旺细胞增殖是一种较经济、简便、实用的方法，可获得较高纯度的雪旺细胞。②本培养方法能够获得大量高纯度的雪旺细胞，可作为周围神经组织工程实验研究的细胞来源。     

新生SD大鼠坐骨神经雪旺细胞传代培养实验研究

目的探索简便可行的、可以获得高纯度的雪旺细胞的培养方法。方法选用4—5d的SD大鼠将双侧坐骨神经进行结扎预变性,术后7d采用在解剖镜下剥离除去神经外膜,剪碎后采用双酶消化法和原代培养4d后G-418纯化法进行雪旺细胞培养,并对培养的细胞进行细胞计数、活力测定和免疫组织化学染色法鉴定。结果从新生鼠可获取近3．84×10^6个雪旺细胞,成活率为95．6％,免疫组织化学染色法鉴定雪旺细胞纯度达94％以上。结论建立的方法可以获得大量纯度高、活性良好的雪旺细胞,值得进一步推广。     

成年大鼠周围神经损伤后远侧端雪旺细胞变化的体外研究

目的:体外观察大鼠坐骨神经损伤不同时间段远侧端雪旺细胞的变化。方法:切断成年SD大鼠坐骨神经,以远侧端为研究对象,术后1、2周和1个月取材,进行雪旺细胞体外培养,倒置相差显微镜,S-100免疫荧光染色及激光扫描共聚焦显微镜观察雪旺细胞的形态,MTT检测细胞活力,流式细胞仪检测细胞周期。结果:神经被切断后,雪旺细胞形态发生改变,1月组最明显;细胞活力和增殖能力也发生变化,切断1周组活力和增殖能力最强,随后逐渐变弱。结论:周围神经损伤后雪旺细胞形态发生变化,细胞的活力和增殖能力随着时间的推移逐渐下降但仍未停止增殖。     

激活态雪旺细胞体外培养与纯化的新方法

目的：探求一种快速培养高纯度激活态雪旺细胞的新方法。方法：wistar大鼠坐骨神经体内切断后7d,取预变性坐骨神经,综合运用混合酶消化、三次组织块移植法,原代提取雪旺细胞,低酶双差速纯化雪旺细胞,不做任何处理的坐骨神经作为对照组。结果：此法培养的雪旺细胞纯度为97．8％左右,细胞增殖能力是未做预变性组的5倍。结论：体内预变性、体外两步酶消化-三次组织块移植结合低酶双差速纯化是一种简便、快速的原代培养、纯化雪旺细胞的方法。     

雪旺细胞移植改善心肌梗死后副交感/交感神经重塑

目的： 对心肌梗死后的心脏进行雪旺细胞（Schwann cells）移植,从而改善心肌梗死的心脏神经的重塑,降低心肌梗死后室性心律失常易感性,以达到雪旺细胞移植治疗心肌梗死后心率失常的目的。方法： 利用结扎Lewis大鼠冠状动脉前降支的方法建立急性大鼠心肌梗死模型,并将心肌梗死的大鼠随机分为细胞移植组（ n=31）和对照组（ n=30）。雪旺细胞取自大鼠坐骨神经,经爬片S100染色鉴定雪旺细胞表面标记物。并将经体外培养扩增后的雪旺细胞（5×106）通过注射的方式移植于心肌梗死周边区,并在细胞移植后的2 周用免疫荧光及免疫组织化学方法检测心肌梗死边缘区副交感、交感神经,动态心电图和程序性电刺激（PES）检测室性心律失常的易感性。 结果： 通过S100染色发现,培养获得的雪旺细胞纯度达到95%以上,在雪旺细胞移植后的2 周,免疫组织化学和免疫荧光结果显示,雪旺细胞移植能够显著改善心肌梗死边缘区副交感/交感神经的比例,并且能够显著降低动态心电图频域检测中低频/高频的比值,同时显著降低了室性心律失常的易感性。结论： 雪旺细胞移植能够有效改善心肌梗死部位副交感/交感神经的比例,从而降低心肌梗死后室性心律失常的发生率。     

兔坐骨神经损伤后许旺细胞的增殖能力及延迟整流钾离子通道活动变化

目的:观察成年兔坐骨神经分别受到75V,125V电压损伤后雪旺细胞增殖及延迟整流K+离子通道的变化情况。方法:建立兔坐骨神经电损伤实验模型,应用双酶消化法分离受损区域神经雪旺细胞,选择损伤后第3天作为观察点,应用细胞计数和同位素H3掺入胸腺嘧啶核苷技术观察雪旺细胞的增殖变化。应用膜片钳全细胞记录雪旺细胞延迟钾整流离子通道的变化并相互比较。结果:125V电损伤后较75V电损伤后雪旺细胞的增殖能力减弱,相应的雪旺细胞延迟整流钾离子通道活动表现出同样的变化趋势。结论:雪旺细胞延迟整流钾离子通道自身受到125V电压损伤后,较75V电损伤造成了更大的功能破坏和活动改变,这种变化影响雪旺细胞的增殖。     

新生大鼠雪旺细胞的体外培养和纯化

目的:探索简单有效获取大量高纯度雪旺细胞的新方法。方法:分离出生3d的新生SD大鼠坐骨神经,使用胰蛋白酶及I型胶原酶混合消化,结合差速贴壁法和G418纯化。四氮唑盐(MTT)比色法测定细胞的生长增殖情况,免疫细胞化学方法计算雪旺细胞的纯度。结果:胰酶和胶原酶混合消化后的活细胞率为94.6±3.4%,纯化后的雪旺细胞纯度为95.6±2.5%。结论:胰酶和胶原酶混合消化结合差速贴壁和G418纯化是获取大量高纯度雪旺细胞的简单有效方法。     

大鼠神经轴索损伤erbB3 mRNA的表达

神经生长调节因子是一个多肽生长因子的家族，它对神经雪旺氏细胞具有重要作用。我们调查了大鼠雪旺细胞神经因子受体的调节作用，发现在成年鼠的坐骨神经中，ｅｒｂＢ３ｍＲＮＡ的表达随神经轴索损伤程度而增加，通过去除神经索上的雪旺细胞表达增加。     

壳聚糖导管复合雪旺细胞修复兔面神经缺损的实验研究

目的：应用壳聚糖导管作为神经再生室, 复合体外培养的雪旺细胞修复兔面神经缺损,观察神经再生的效果。 方法： 用壳聚糖和羧甲基壳聚按3：1的比例采用冷冻干燥法制成壳聚糖复合导管; 取胎兔坐骨神经,经体外增殖培养获得雪旺细胞,复合于壳聚糖导管,修复兔面神经0.8?cm的缺损,并与单用壳聚糖导管作对照,观察修复后4、8、16周的神经电生理及组织学检查情况。结果:术后8周新生面神经纤维已沿管壁通过缺损到达远端,术后16周导管大部分降解,新生神经变粗变直,神经纤维排列整齐规则,神经电生理检查记录到复合动作电位,复合雪旺氏细胞的导管再生神经较粗,动作电位幅值较高。结论：壳聚糖导管可引导神经再生,复合雪旺细胞的壳聚糖导管神经再生效果较好。     

Adeno-X Tet-On系统调控LacZ基因在雪旺细胞中表达的研究

目的　应用Adeno XTet On系统感染雪旺细胞 ,通过四环素衍生物强力霉素 (doxcycline ,Dox)调控LacZ基因产物 (βgal)的表达。方法　①取生后 5～ 6dSD仔鼠坐骨神经进行雪旺细胞培养 ,并进行形态学及S 10 0蛋白相关抗原免疫组织化学染色鉴定。②将Adeno XTet OnVirusStock与Adeno XTRE βgalVirusStock分别感染HEK2 93细胞 ,收获病毒并作滴度测定。③将扩增后的病毒感染雪旺细胞并绘制Dox调控下βgal诱导表达曲线。结果　①由体外培养获得的雪旺细胞纯度可达 90 %以上并且状态良好 ,免疫组织化学染色阳性结果明显。②扩增后的病毒滴度较高 ,分别达 1.2 6× 10 9、1.99× 10 9pfu/ml。　结论　将病毒感染雪旺细胞后 ,经检测发现DOX对 βgal表达调控明显     

双阴性选择法纯化培养人骨髓多能成体祖细胞

目的 建立体外分选纯化及培养人骨髓来源多能成体祖细胞(MAPCs)的方法.方法 取健康成人志愿者适量骨髓采用梯度密度离心法分离获取单个核细胞,贴壁培养后,将获取的骨髓贴壁细胞通过CD45、血糖蛋白A(GlyA)免疫微磁珠(miniMACS)负分选,流式细胞术鉴定分选后细胞纯度;对传代到不同阶段的细胞进行CD45、GlyA流式细胞分析,初步了解MAPCs在培养、增殖过程中的免疫学稳定性.结果 通过miniMACS分选,平均每1×10⁶/ml骨髓贴壁细胞可分选出约(5～10)×10⁴/ml的MAPCs,分选前后细胞活力分别为(96.7±1.7)%和(96.0±2.4)%,无明显差异;自制的培养基培养分选后的MAPCs生长良好,最长传代到第16代;流式细胞仪分析获取的CD45、G1yA-细胞纯度大于98%;流式细胞仪分析传代第4、8、12代MAPCs,CD45^-、G1yA^-细胞纯度大于98%.结论 CD45、GlyA miniMACS负分选可从骨髓中分离高纯度的MAPCs;MAPCs在本室自制的人MAPCs培养基中体外有较强的增殖能力,且能保持较长时间的稳定状态.     

双阴性选择法纯化培养人骨髓多能成体祖细胞

OBJECTIVE: To establish a method for purifying and culturing human multipotent adult progenitor cells (MAPCs) in vitro. METHODS: Mononuclear cells were separated from the bone marrow of healthy adult volunteers by density gradient centrifugation and cultivated in adherent culture. The plastic-adherent cultured bone marrow cells were isolated by magnetic-activated cell sorting with CD45 and GlyA magnetic microbeads, and the purity of CD45-/GlyA- cells evaluated by flow cytometry. Phase-contrast microscopy was used to detect morphological changes of the cells in different stages of culture. RESULTS: Approximately (5-10)x10(4)/ml MAPCs could be separated from every 1x10(6)/ml bone marrow mononuclear cells by magnetic- activated cell sorting. The viability of the cells before and after separation was (96.7+/-1.7)% and (96.0+/-2.4)%, respectively. The isolated MAPCs grew well in a self-prepared culture medium till the16th passage. The purity of CD45-/GlyA- separated from the bone marrow was more than 98% as examined by flow cytomety even till the 12th passage. CONCLUSIONS: MAPCs derived from adult human bone marrow can be purified by magnetic-activated cell sorting with CD45 and GlyA microbeads and retain the undifferentiated state for a long time. The self-prepared culture medium is appropriate for MAPCs cultures in vitro.     

碱性成纤维细胞生长因子缓释微球对许旺细胞在小肠粘膜下层细胞粘附活性的影响

目的观察碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）缓释微球对许旺细胞（SC）在小肠粘膜下层（SIS）上的粘附影响。方法运用双酶两步消化法对SC进行体外分离、培养、纯化,将bFGF-PLGA缓释微球（bFGF-PLGA-MS）与SC及SIS进行体外复合培养,并以游离bFGF组及单纯培养液组进行对比,观察bFGF-PLGA缓释微球对SC在SIS上粘附影响。结果运用双酶两步消化的体外原代培养方法获取的雪旺细胞数量较多,细胞纯度可达90%以上。细胞的体外增殖活性良好,细胞增殖周期约为6～7天,培养后2～7天为对数生长期,第7天后进入生长平台期;bFGF缓释微球能持续地促进雪旺细胞在SIS上的粘附、增殖及迁移;细胞增殖周期缩短,细胞能较稳定地保持着良好的活性;提高了细胞增殖指数,并使SIS上的SC持续保持较高的增殖活性;细胞数量与bFGF含量的相关系数为0.988（P=0.02）,表明两者间有明显正相关关系。结论 bFGF-PLGA微球的药物缓释促进了SC在SIS上持续而稳定的粘附,为以SC复合SIS构建人工神经提供了有利条件。     

碱性成纤维细胞生长因子缓释微球对许旺细胞在小肠粘膜下层增殖活性的影响

目的：观察碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）缓释微球对许旺细胞（SC）在小肠粘膜下层（SIS）上增殖影响。方法运用双酶两步消化法对 SC 进行体外分离、培养、纯化,将 bFGF-PLGA 缓释微球（bFGF-PLGA-MS）与 SC 及 SIS进行体外复合培养,并以游离 bFGF 组及单纯培养液组进行对比,观察 bFGF-PLGA 缓释微球对 SC 在 SIS 上增殖影响。结果运用双酶两步消化的体外原代培养方法获取的许旺细胞数量较多,细胞纯度可达90%以上。细胞的体外增殖活性良好,细胞增殖周期约为6～7d,培养后2～7d 为对数生长期,第7d 后进入生长平台期; bFGF 缓释微球能持续地促进许旺细胞在 SIS 上的增殖;细胞增殖周期缩短,细胞能较稳定地保持着良好的活性;提高了细胞增殖指数,并使 SIS 上的 SC持续保持较高的增殖活性;细胞数量与 bFGF 含量的相关系数为0.988（P =0.02）,表明两者间有明显正相关关系。结论bFGF-PLGA 微球的药物缓释促进了SC 在SIS 上持续而稳定的增殖,为以SC 复合SIS 构建人工神经提供了有利条件。     

大鼠海马神经元及星形胶质细胞的体外培养

目的：改进大鼠海马神经元、星形胶质细胞及两者混合状态的体外培养方法,获得高纯度的海马神经细胞。方法：选取孕期18~20 d 的SD 大鼠胎鼠作为原代海马细胞培养的材料来源。断头后于冰板上剥离双侧海马,去除表面血管及薄膜,利用眼科剪分离为小块。随后使用冷平衡盐溶液洗涤3 次,将海马组织碎块移入酶消化液中。本方法选择Accutase 和0.1% DNase 作为酶消化液,37 ℃消化 15 min,期间轻柔振动。使用冷平衡盐溶液洗涤3 次,终止消化。0.1% DNase 加入Neurobasal 和B-27 的混合液对消化后的海马组织碎块进行轻柔吹打,获得单细胞悬液。将悬液过200 目筛,进行细胞计数。将过筛的单细胞悬液移入DMEM 培养基（DMEM+10%胎牛血清）中,按照每平方厘米2.5×104 的细胞密度进行接种。经PDL 孵育的塑料片置于培养基底部。细胞于37 ℃、5% CO2 培养箱内培养。4 h 后,依据所需细胞种类的不同,更换相应培养基。海马神经细胞于培养后7~10 d 可用于实验。结果：通过本方法可得到高纯度的大鼠海马神经细胞,且根据实验需求,通过更换培养基,可得到纯神经元、纯胶质细胞及两者混合的三种培养状态。培养的神经元及星形胶质细胞纯度均>98%。结论：该文在传统海马神经细胞体外培养方法基础上,进一步降低了实验操作难度,方法稳定有效。     

IL-1受体拮抗剂对培养人肾小管细胞的影响及机制研究

目的:研究IL-1受体拮抗剂(IL-1ra)抗肾缺血再灌流性兔血清致培养人肾小管细胞损伤的作用及机制。方法:健康家兔16只,随机分为对照和缺血再灌流(IR)组,IR组作双肾动脉夹闭1小时再灌流2小时;对照组仅模拟实验过程,不夹闭肾动脉。分别提取其血清。肾小管细胞培养分对照组(DMEM+小牛血清);SC组(DMEM+对照兔血清);SIR组(DMEM+IR肾损伤性兔血清);IL-1ra+SIR组(DMEM+IR肾损伤性兔血清+IL-1ra)。培养96小时时,测定其增殖状况和细胞存活率,细胞或培养液中MDA、SOD、NO、LDH、Na~+-K~+-ATP酶和Ca~(2+)-ATP酶。结果:SIR组MDA、NO含量、LDH活力比对照组、SC组高(P<0.05),对照组、SC组和IL-1ra+SIR组间比较差异无显著性;肾小管细胞中的SOD活力,对照组最高,IL-1ra+SIR组次之,SC组又次之,SIR组最低,除IL-1ra+SIR组与SC组外,其余组间差异均有显著性(P<0.05);Na~+K~+-ATP酶和Ca~(2+)-ATP酶的活力在SIR组均较对照组和SC组低,差异有显著性。对照组、SC组和IL-1ra+SIR组间差异无显著性。结论:IL-1ra具有减轻IR性肾损伤兔血清致培养人肾小管细胞损伤的作用。     

大鼠视网膜共培养诱导神经干细胞分化为视网膜神经节细胞

目的:研究新生大鼠视网膜组织与胚胎上丘源神经干细胞共培养对干细胞分化的影响.方法:采用机械分离、无血清培养基选择培养的方法从孕14 d的胚鼠上丘中获取神经干细胞并传代培养.使用组织-细胞共培养系统将出生4 d的乳鼠视网膜组织与上丘源神经干细胞共培养,观察干细胞分化过程,对分化细胞进行鉴定,并与干细胞的自然分化过程进行比较.结果:从胚鼠上丘中获得的细胞在无血清培养条件下聚集呈球形悬浮生长,可以持续传代培养,具有多向分化能力,经免疫荧光鉴定证实为神经干细胞.新生大鼠视网膜组织与胚胎上丘源神经干细胞共培养促进干细胞的分化,并诱导分化出Thy1.1阳性细胞.结论:从胚胎大鼠上丘可以分离培养神经干细胞,与新生鼠视网膜组织共培养可以诱导上丘源神经干细胞分化出视网膜神经节细胞.     

血清饥饿对原代人脐静脉内皮细胞周期同步化的影响

目的探讨人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells, HUVECs）的最佳饥饿条件,以建立高效稳定的 HUVECs体外分离提取方法,并为HUVECs相关实验提供研究基础。方法用0.1%Ⅱ型胶原酶灌注脐静脉腔消化15 min,收集 细胞并用内皮细胞专用培养基（含5%内皮细胞基础培养基、1%内皮细胞生长因子、1%青链霉素）,置37 ℃,5% CO2培养箱培 养。在倒置显微镜下观察细胞形态特点,并用细胞免疫荧光方法对所得细胞进行鉴定。用流式细胞术检测所得HUVECs的纯 度,并检测0%、0.1%、0.5%、1%血清浓度的培养基饥饿处理0、6、12、18、24 h对细胞周期的影响。结果0.1%Ⅱ型胶原酶消化可 以得到HUVECs,细胞培养呈典型的铺卵石状排列,细胞较密处呈涡旋状排列。免疫荧光检测细胞VIII因子相关抗原表达呈阳 性。流式检测细胞纯度高达99.67%。不同血清浓度培养基培养6 h可获得70%左右的G0/G1期细胞;培养12 h可获得80%~90% 的G0/G1期细胞;培养18、24 h 可获得95%左右的G0/G1期细胞。结论0.1%Ⅱ型胶原酶充盈静脉管腔可以获得高纯度的原代 HUVECs。完全无血清培养基培养12 h即可获得纯度超过80%的G0/G1期HUVECs。     

小鼠胚胎干细胞体外分化为神经前体细胞的研究

目的 探索小鼠胚胎干细胞（Embryonic stem cell,ES cell）体外分化为神经前体细胞（Neural precursor cells,NPC）的无血清培养条件,比较人胚胎成纤维细胞（Human embryonic fibroblasts,HEF）与小鼠胚胎成纤维细胞（Mouse embryonic fibroblasts,MEF）对小鼠ES细胞生长的作用。方法 在MEF或HEF饲养层上培养ES细胞,培养液中含白血病抑制因子。采用无血清方法培养NPC,免疫组化方法检测巢蛋白（Nestin）,用硝基四氮啖蓝/5-溴-4-氯-吲哚基磷酸（NBT/BCIP）显色检测碱性磷酸酶。结果 无血清培养可以获得86%的NPC。HEF与MEF-样能维持ES未分化状态。结论 无血清培养方法有利于ES细胞向NPC分化,HEF可用于小鼠ES细胞的培养,而且比MEF优越。