重组人白细胞介素-2/ 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的纯化及复性研究

目的研究重组人白细胞介素-2/ 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(IL-2/GM-CSF)融合蛋白纯化及复性的最佳条件。方法常规方法提取包涵体,用本室专利技术提纯,复性后样品经DEAE-Sepharose FF离子交换层析,获得融合蛋白。结果获得具有生物活性的融合蛋白,其纯度达到95%。结论此工艺操作简便,纯化效果好,获得率高。     

恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶融合蛋白复性及纯化的研究

目的建立恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶(GDH)融合蛋白质的复性和纯化方法。方法将含有恶性疟原虫GDH全长基因的融合蛋白表达质粒GDH/ pGEX-4T-1转化到宿主菌BL21,该GDH/GST融合蛋白在IPTG的诱导下获得高水平的表达,经SDS-PAGE分析表达产物主要为不溶性的包涵体。经超声酶解法、离心、变性剂/去污剂洗涤后获得包涵体。包涵体经8 mol/L尿素变性后分别采用分子筛柱层析、透析和稀释3种方法复性,并通过浊度分析、非还原SDS-PAGE等方法比较、优化复性方法和条件。复性后的GDH/GST融合蛋白经过不同柱层析方法进行纯化。结果经SDS-PAGE分析表明,GDH/GST融合蛋白表达量可占到菌体总蛋白的25%左右;浊度分析表明:稀释复性法优于其它两种方法,同时20 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L EDTA、pH8.5及GSSG/GSH=1∶10为该融合蛋白稀释复性的最佳条件,其复性回收率可达90%以上。复性产物采用二步阴离子交换层析可获得较好的纯化效果。结论通过稀释复性,二步阴离子交换层析可获得高纯度、具有天然空间构象的重组GDH/GST融合蛋白。     

重组人白细胞介素2-绿脓杆菌外毒素融合蛋白的纯化及复性

目的探讨该所发明的新方法对重组人白细胞介素2-绿脓杆菌外毒素(IL2-PE664Glu)融合蛋白进行纯化与复性的效果。方法采用该所发明的新方法提纯包涵体,包涵体复性后,样品经DEAE-SepharoseFF离子交换层析,获得融合蛋白纯品。结果获得的具有生物学活性的融合蛋白纯度达到95%,复性回收率为80%。结论此包涵体分离纯化技术简便、实用,可为中试研究和规模化生产提供基础。     

重组人白细胞介素2—绿脓杆菌外毒素融合蛋白的纯化及复性

目的 探讨该所发明的新方法对重组人白细胞介素2－绿脓杆菌外毒素（IL－2－PE66^4lu）融合蛋白进行纯化与复性的效果。方法 采用该所发明的新方法提纯包涵体，包涵体复性后，样品经DEAE＝SepharoseFF离子交换层析，获得融合蛋白纯品。结果 获得的具有生物学活性的融合蛋白纯度达到95％，复性咽收率为80％。结论 此包涵体分离纯化技术简便、实用，可为中试研究和规模化生产提供基础。     

利用CEA694-702-β2m融合蛋白制备HLA-CEA694-702复合体

目的：获得大量CEA694-702-β2-微球蛋白（β2m）融合蛋白,并制备HLA-CEA694-702复合体。方法：通过引物设计在β2m基因的5′端引入CEA694-702序列和L inker序列,并将目的基因克隆到质粒pET28 a中,在BL21（DE3）中表达。CEA694-702-β2m和HLA重链蛋白用金属螯合亲和层析法进行纯化,并经稀释复性法复性。制备的HLA-CEA694-702复合体用PEG20000浓缩,应用ELISA鉴定其构象,并用尺寸排阻色谱纯化和鉴定。结果：HLA重链蛋白和CEA694-702-β2m蛋白经金属螯合亲和层析法纯化后纯度提高。ELISA鉴定结果表明稀释复性后HLA-CEA694-702复合体形成了正确的构象。利用尺寸排阻色谱对HLA-CEA694-702复合体成功地进行了纯化。结论：利用CEA694-702-β2m融合蛋白成功制备出HLA-CEA694-702复合体,为HLA-CEA694-702四聚体的制备奠定了基础。     

恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶融合蛋白复性及纯化的研究

目的 建立恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶(GDH)融合蛋白质的复性和纯化方法。方法 将含有恶性疟原虫GDH全长基因的融合蛋白表达质粒GDH／pGEX—4T—1转化到宿主菌BL21，该GDH／GST融合蛋白在IPTG的诱导下获得高水平的表达，经SDS—PAGE分析表达产物主要为不溶性的包涵体。经超声酶解法、离心、变性剂／去污剂洗涤后获得包涵体。包涵体经8mol／L尿素变性后分别采用分子筛柱层析、透析和稀释3种方法复性，并通过浊度分析、非还原SDS—PAGE等方法比较、优化复性方法和条件。复性后的GDH／GST融合蛋白经过不同柱层析方法进行纯化。结果 经SDS—PAGE分析表明，GDH／GST融合蛋白表达量可占到菌体总蛋白的25％左右；浊度分析表明：稀释复性法优于其它两种方法，同时20mmol／L，Tris—HCI、1mmoH，EDTA、pH8．5及GSSG／GSH=1：10为该融合蛋白稀释复性的最佳条件，其复性回收率可达90％以上。复性产物采用二步阴离子交换层析可获得较好的纯化效果。结论 通过稀释复性，二步阴离子交换层析可获得高纯度、具有天然空间构象的重组GDH／GST融合蛋白。     

融合表达的副溶血弧菌不耐热性溶血毒素包涵体复性的研究

目的 构建融合表达载体,获得具有生物活性的副溶血弧菌不耐热性溶血毒素。方法 克隆tlh基因,构建表达载体pET32a+/tlh,融合表达副溶血弧菌不耐热性溶血毒素,用8 mol/L的尿素溶解包涵体,亲和层析纯化目的蛋白,采取逐步透析、降低蛋白浓度、加入氧化还原剂等复性方法。结果 复性蛋白具有溶血活性及免疫原性。结论 通过克隆tlh基因,构建融合表达载体pET32a+-tlh,采取纯化、复性方法,获得具有融血活性及免疫原性的副溶血弧菌不耐热性溶血毒素。     

幽门螺杆菌HspA-UreB融合蛋白包涵体的纯化及活性鉴定

目的：建立一种有效的纯化幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位-尿素酶B亚单位(HspA-UreB)融合蛋白包涵体的方法。 方法：基因工程重组大肠杆菌BL21(pET-HU27)诱导表达的HspA-UreB融合蛋白包涵体经洗涤、变性、复性,在A¨KTA FPLC上运用HiTrap Chelating HP分离纯化,用SDS-PAGE和Bradford法检测目的蛋白的纯度和含量,用Western blotting对纯化后蛋白进行免疫学活性鉴定。 结果：纯化后HspA-UreB融合蛋白的纯度＞90%,含量达0.25 g•L^-1,并可以被HspA-UreB融合蛋白免疫小鼠血清识别。 结论：成功地建立了从包涵体中纯化高纯度HspA-UreB融合蛋白的方法。     

大肠埃希菌表达的含PTD穿膜序列的融合蛋白3种复性方法比较

目的:探索融合蛋白PTD-NFATminiDBD-eGFP纯化以及复性的条件,以提高其复性效率,为后续融合蛋白生物学功能的研究做准备。方法:表达、提取并纯化包涵体形式的融合蛋白PTD-NFATminiDBD-eGFP,分别用稀释复性、透析复性、柱上复性的方法,对融合蛋白进行复性,分析不同方法的特点及包涵体复性率,采用流式细胞术检测融合蛋白的穿膜活性。结果:3种复性方法得到的融合蛋白复性率依次为:柱上复性得率最高,其次是透析复性,稀释复性得率最低。柱上复性后蛋白的穿膜效率最高,相对较低的是稀释复性,而未复性的融合蛋白穿膜效率极低。结论:3种复性方法均能对PTD穿膜蛋白复性,但以柱上复性最佳。     

变性再复性方法提取高纯度Cav1.2片段GST-CT1及其生物活性的鉴定

目的 探寻诱导谷胱甘肽转移酶(GST)与Cavl.2钙通道片段CT1重组的易形成包涵体的大分子融合蛋白的提取与纯化的方法.方法 在E.coli BL21中转化入pGEX-6p-3/CT1重组质粒并诱导表达,采用GST包涵体变性复性试剂盒和非离子去污剂B-PER分离纯化GST-CT1融合蛋白,用Pull down assay方法鉴定GST-CT1融合蛋白及其生物活性.结果 应用GST包涵体变性复性试剂盒和非离子去污剂B-PER能够分离得到高纯度的易形成包涵体的GST-CT1融合蛋白,且分离纯化的GST-CT1融合蛋白具有与钙调蛋白结合的生物活性.结论 操作简易的GST包涵体变性复性法能够针对易形成包涵体的GST-CT1融合蛋白进行分离和纯化,且得到的蛋白具有生物学活性.     

结核分枝杆菌Ag85B/IL-2融合蛋白的原核表达、纯化、鉴定及活性初步测定

目的:在大肠杆菌中表达结核分枝杆菌Ag85B/IL-2融合蛋白,并对其进行纯化、鉴定和活性初步测定. 方法:将构建的pGEX-Ag85B/IL-2重组菌BL21扩增后接种于LB培养基中,异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组融合蛋白的表达,筛选最适诱导剂浓度和最适诱导时间;梯度浓度尿素复性包涵体,经GST-Sepharose亲和层析、凝血酶切、阴离子交换层析和反相-高效液相(RP-HPLC)层析纯化Ag85B/IL-2融合蛋白,免疫印迹(Western blot)鉴定,并测定其N-末端氨基酸序列和IL-2比活性. 结果:成功在大肠杆菌中高效表达带有GST的Ag85B/IL-2融合蛋白,占菌体总蛋白的30%,主要以包涵体形式表达,于诱导后6 h表达量达最高峰. 对包涵体复性,纯化获得纯度为98.32%的Ag85B/IL-2融合蛋白,Western blot鉴定阳性,N-末端氨基酸测序与理论预期完全一致,IL-2比活性为2500 u/mg. 结论:高效表达并纯化了Ag85B/IL-2融合蛋白,为进一步研究其在膀胱肿瘤免疫治疗中的作用奠定了基础.     

TIMP-4基因的克隆、原核表达及活性测定

目的：采用RT-PCR法获取TIMP-4基因,并通过原核表达获取具有生物活性的TIMP-4融合蛋白。方法：从SD大鼠心肌组织中提取总RNA,利用RT-PCR法扩增出TIMP-4基因,经基因序列分析后构建表达载体PET-28a（＋）-TIMP-4,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导TIMP-4的表达。利用N2＋-NTA纯化和复性后,根据其骨肉瘤细胞迁移能力的影响检测其活性。结果：克隆到编码序列完全正确的大鼠TIMP-4基因,能在大肠杆菌中获得高效表达,表达产物占全菌总蛋白的23.5%,N2＋-NTA纯化和复性后,纯度达90%以上。纯化后的融合蛋白使骨肉瘤细胞株的迁移能力得到显著抑制。结论：通过基因克隆和原核表达的方式可以大量获得具有生物活性的TIMP-4融合蛋白。     

硫氧还蛋白-(His)6融合的瑞替普酶的表达、纯化和活性检测

目的:构建硫氧还蛋白-(His)6-瑞替普酶融合表达载体,提高瑞替普酶在大肠杆菌中的表达量,简化rPA的分离纯化.方法:将rPA基因克隆于原核表达载体pET32a硫氧还蛋白-(组氨酸)6标签下游,在大肠杆菌BL21(DE3)中用乳糖进行诱导表达.采用一步稀释法对融合蛋白体外复性后,使用Ni2 亲和层析柱,对包涵体复性液进行初步纯化.采用体外溶圈法对复性后和纯化后的融合蛋白进行生物活性的测定.结果:得到分子量约为56 kDa的融合蛋白,表达量达到总蛋白的30%以上.比本实验室构建的非融合表达载体表达量提高了约50%.经过一步Ni2 亲和层析,融合蛋白纯度达到80%以上.体外溶圈法实验表明融合蛋白复性后和纯化后具有溶栓活性.结论:与非融合表达相比,融合表达的表达量明显提高.即使N端额外融合一段融合多肽,rPA仍然具有生物学活性.     

hIL-15-SA双功能融合蛋白的制备

目的：对双功能融合蛋白hIL-15-SA的发酵及纯化工艺进行研究。方法：采用发酵罐高密度发酵hIL-15-SA工程菌,通过镍柱亲和层析及阴离子交换层析纯化目的蛋白。免疫印迹分析产物,淋巴细胞增殖试验以及细胞锚定试验检测双功能融合蛋白hIL-15-SA的生物学活性。结果：采用半合成培养基,以3%的接种量,pH值为7.2发酵可得到湿菌47 g/L,21.15 g/L包涵体。经纯化后目的蛋白纯度为97%。细胞增殖试验和细胞表面锚定修饰试验表明,经纯化复性的hIL-15-SA融合蛋白具有双重生物活性。结论：本研究获得了高产量、高纯度的hIL-15-SA双功能融合蛋白,为后续的体内生物学功能研究奠定了基础。     

猪干扰素-γ基因表达产物的纯化与复性研究

目的：纯化、复性猪干扰素-γ基因（poIFN-γ）表达产物并分析其抗病毒活性。方法：用异丙基-β—D-硫代半乳糖苷（Isopropylthio—β—D—galactoside,IPTG）诱导原核表达载体pQE30／poIFN-γ,超声裂解包涵体,尿素溶解、Ni—NTA纯化和透析复性后,对所得的蛋白进行抗病毒活性检测。结果：经复性纯化的目的蛋白纯度达95％以上,在PK15细胞上抗滤泡性口炎病毒比活性为6．2×10^5u／mg。结论：获得PoIFN-γ活性蛋白,为进一步研究应用奠定基础。     

抗癫痫肽/GST融合表达及包涵体蛋白复性纯化

[目的]获得高纯度的谷胱甘肽硫转移酶/抗癫痫肽(GST-AEP)融合蛋白。[方法]异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组大肠杆菌DH5α表达GST-AEP融合蛋白,融合蛋白包涵体经过洗涤、变性、复性后,通过12%SDS-PAGE凝胶电泳,考马斯亮蓝染色,凝胶薄层扫描检测其纯度,透析管进一步纯化蛋白,BCA法定量。[结果]从融合蛋白包涵体中获得了纯度达90%以上的目的蛋白,定量约0.163μg/μl。[结论]建立了有效纯化融合蛋白包涵体GST-AEP的方法,为对AEP进一步的相关研究奠定了基础。     

人转录因子sp1在大肠杆菌中的表达与体外纯化

目的：在大肠杆菌中表达人源转录因子spl蛋白,并进行体外纯化。方法：首先将人源sp1真核表达质粒pCMV-sp1中的sp1 cDNA用限制性内切酶切开,连入原核表达质粒pET28b,构建原核表达重组质粒pET28b-sp1-699c;然后将重组质粒转化入大肠杆菌BL21（DE3）菌株,经IPTG诱导表达带His-Tag的融合蛋白His-sp1（88-786aa）,通过包涵体的变复性和Ni-IDA亲和层析纯化后,SDS-PAGE鉴定纯化后的蛋白。结果：融合蛋白His-sp1在大肠杆菌内得到高效表达,纯化后可得到较高纯度的蛋白。结论：本研究获得了较高纯度的融合蛋白His-sp1,为进一步研究sp1蛋白对靶基因的转录调控奠定了基础。     

小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的表达、纯化与鉴定

目的构建小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(mGM-CSF)工程菌,通过摸索其变、复性和纯化条件,得到高纯度高比活的重组mGM-CSF蛋白。方法以本实验室构建的hIL-2/mGM-CSF融合蛋白表达载体为模板,PCR扩增mGM-CSF基因,克隆入pET-11c表达载体,转化BL21,构建BL21/pET-11c/mGM-CSF工程菌,用本所专利方法提取包涵体,在含低浓度盐酸胍的复性液中复性,采用镍离子亲和层析纯化。结果工程菌采用TH肉汤培养,32℃、0.1mmol/LIPTG双重诱导,表达量达菌体蛋白总量的60.6%。提取包涵体在含1.5mol/L盐酸胍的谷胱甘肽复性液中复性效果最好,比活达4.2×106U/mg。经过亲和层析一步纯化,目的蛋白纯度达95%,比活与标准品相当。结论构建了高效表达mGM-CSF的工程菌,建立了其复性和纯化工艺,为进一步研究DC、GM-CSF体内抗肿瘤功能奠定了基础,并可为IL-2/GM-CSF双功能分子的生物学功能研究提供对照。     

基因重组蛋白L243诱导表达包涵体的变性、复性与纯化

目的 对来自于日本七鳃鳗的基因重组蛋白L243包涵体进行变性、复性与纯化,以获得成分均一的活性蛋白.方法 以6 mol/L尿素为变性剂,以0.1 mol/L氧化型谷胱甘肽及0.9 mol/L还原型谷胱甘肽为复性剂,对构建于pET23b的日本七鳃鳗L243基因在大肠杆菌Rosetta中表达的包涵体进行了的变性、复性与组氨酸亲和层析纯化.结果 经变性、复性后,获得了均质的L243纯化蛋白,该蛋白的复性率达80%.结论 成功对上述重组蛋白包涵体进行了变性、复性及纯化,为后续与此蛋白相关的生物活性测定奠定了物质基础.     

泛素--核糖体蛋白S27a基因的克隆、测序及其原核GST融合表达和纯化

目的：克隆泛素-核糖体蛋白S27a基因并在大肠杆菌细胞内高效表达,并纯化该蛋白.方法：从HL-60细胞中提取总RNA,通过RT-PCR扩增获得泛素/核糖体蛋白S27a的编码区cDNA,将Hind Ⅲ/NdeⅠ双酶切的PCR产物连接到同样双酶切的GST融合表达载体pGEXGST构建为融合表达质粒pGEXGST-S27a,转化感受态的大肠杆菌JM109实现质粒的扩增与纯化,经DNA测序确证后再转化感受态表达菌BL21,表达并纯化出融合蛋白.结果： （1） PCR 扩增获得长约560bp 的泛素-核糖体蛋白S27a 基因片段.（2） SDS - PAGE 证明, 泛素-核糖体蛋白S27a-GST融合蛋白的分子量为43kDa.（3）通过过柱法纯化出泛素-核糖体蛋白S27a-GST融合蛋白.结论：成功克隆出泛素-核糖体蛋白S27a的基因,并在表达菌BL21中可见GST融合表达,并纯化出该融合蛋白,为进一步研究其功能获得了候选蛋白分子.