重组人白细胞介素2-绿脓杆菌外毒素融合蛋白的纯化及复性

目的探讨该所发明的新方法对重组人白细胞介素2-绿脓杆菌外毒素(IL2-PE664Glu)融合蛋白进行纯化与复性的效果。方法采用该所发明的新方法提纯包涵体,包涵体复性后,样品经DEAE-SepharoseFF离子交换层析,获得融合蛋白纯品。结果获得的具有生物学活性的融合蛋白纯度达到95%,复性回收率为80%。结论此包涵体分离纯化技术简便、实用,可为中试研究和规模化生产提供基础。     

恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶融合蛋白复性及纯化的研究

目的 建立恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶(GDH)融合蛋白质的复性和纯化方法。方法 将含有恶性疟原虫GDH全长基因的融合蛋白表达质粒GDH／pGEX—4T—1转化到宿主菌BL21，该GDH／GST融合蛋白在IPTG的诱导下获得高水平的表达，经SDS—PAGE分析表达产物主要为不溶性的包涵体。经超声酶解法、离心、变性剂／去污剂洗涤后获得包涵体。包涵体经8mol／L尿素变性后分别采用分子筛柱层析、透析和稀释3种方法复性，并通过浊度分析、非还原SDS—PAGE等方法比较、优化复性方法和条件。复性后的GDH／GST融合蛋白经过不同柱层析方法进行纯化。结果 经SDS—PAGE分析表明，GDH／GST融合蛋白表达量可占到菌体总蛋白的25％左右；浊度分析表明：稀释复性法优于其它两种方法，同时20mmol／L，Tris—HCI、1mmoH，EDTA、pH8．5及GSSG／GSH=1：10为该融合蛋白稀释复性的最佳条件，其复性回收率可达90％以上。复性产物采用二步阴离子交换层析可获得较好的纯化效果。结论 通过稀释复性，二步阴离子交换层析可获得高纯度、具有天然空间构象的重组GDH／GST融合蛋白。     

变性再复性方法提取高纯度Cav1.2片段GST-CT1及其生物活性的鉴定

目的 探寻诱导谷胱甘肽转移酶(GST)与Cavl.2钙通道片段CT1重组的易形成包涵体的大分子融合蛋白的提取与纯化的方法.方法 在E.coli BL21中转化入pGEX-6p-3/CT1重组质粒并诱导表达,采用GST包涵体变性复性试剂盒和非离子去污剂B-PER分离纯化GST-CT1融合蛋白,用Pull down assay方法鉴定GST-CT1融合蛋白及其生物活性.结果 应用GST包涵体变性复性试剂盒和非离子去污剂B-PER能够分离得到高纯度的易形成包涵体的GST-CT1融合蛋白,且分离纯化的GST-CT1融合蛋白具有与钙调蛋白结合的生物活性.结论 操作简易的GST包涵体变性复性法能够针对易形成包涵体的GST-CT1融合蛋白进行分离和纯化,且得到的蛋白具有生物学活性.     

重组人白细胞介素-2/ 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的纯化及复性研究

目的研究重组人白细胞介素-2/ 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(IL-2/GM-CSF)融合蛋白纯化及复性的最佳条件。方法常规方法提取包涵体,用本室专利技术提纯,复性后样品经DEAE-Sepharose FF离子交换层析,获得融合蛋白。结果获得具有生物活性的融合蛋白,其纯度达到95%。结论此工艺操作简便,纯化效果好,获得率高。     

重组抑肽酶的生产工艺研究

目的：优化融合表达抑肽酶基因工程菌的发酵奈件，分离纯化抑肽酶。方法：设计3因素3水平的正交实验，考查玉米粉浓度、诱导时间和诱导剂乳糖浓度对菌体生长及蛋白表达的影响；在30L发酵罐中进行中试放大试验；菌体经超声破壁和离心得到融合蛋白包涵体，经Bio-gel P30凝胶过滤纯化复性，用FXa切割，回收目的蛋白，最后用Resouree RPC进行纯度验证。结果：融合蛋白的表达量为45％，包涵体复性率为70％以上，抑肽酶纯度为90％，总收率为32％，比活力为3．1EPU／mg。结论：实现了含抑肽酶融合蛋白的较高表达，复性率及纯度达到较高水平，活力与天然产物相当。     

恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶融合蛋白复性及纯化的研究

目的建立恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶(GDH)融合蛋白质的复性和纯化方法。方法将含有恶性疟原虫GDH全长基因的融合蛋白表达质粒GDH/ pGEX-4T-1转化到宿主菌BL21,该GDH/GST融合蛋白在IPTG的诱导下获得高水平的表达,经SDS-PAGE分析表达产物主要为不溶性的包涵体。经超声酶解法、离心、变性剂/去污剂洗涤后获得包涵体。包涵体经8 mol/L尿素变性后分别采用分子筛柱层析、透析和稀释3种方法复性,并通过浊度分析、非还原SDS-PAGE等方法比较、优化复性方法和条件。复性后的GDH/GST融合蛋白经过不同柱层析方法进行纯化。结果经SDS-PAGE分析表明,GDH/GST融合蛋白表达量可占到菌体总蛋白的25%左右;浊度分析表明:稀释复性法优于其它两种方法,同时20 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L EDTA、pH8.5及GSSG/GSH=1∶10为该融合蛋白稀释复性的最佳条件,其复性回收率可达90%以上。复性产物采用二步阴离子交换层析可获得较好的纯化效果。结论通过稀释复性,二步阴离子交换层析可获得高纯度、具有天然空间构象的重组GDH/GST融合蛋白。     

以包涵体形式表达的6B11卵巢癌抗独特型单链抗体的复性,？…

目的：探讨以细胞胞浆内包涵体形式表达的６Ｂ１１卵巢癌抗独特型单链抗体（６Ｂ１１ｓｃＦｖ）的复性，纯化及其活性，方法：重组质粒ｐＬ－６Ｂ１１ｓｃＦｖ转化大肠杆菌ｐｏｐ２１３６，温度诱导，以包涵体形式获高效表达。超声破碎细菌细胞得包涵体，用８ｍｏｌ．Ｌ＾－１尿素溶解包涵体后直接稀释复性，探讨复性条件并采用了ＤＥＡＥ－ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ离子交换层纯化复合蛋白，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析蛋白纯度     

重组人白细胞介素—2／粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的纯化及复性研究

目的：研究重组人白细胞介素-2/粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（IL-2/GM-CSF)融合蛋白纯化及复性的最佳条件。方法：常规方法提取包涵体,用本室专利技术提纯,复性后样品经DEAE-Sepharose FF离子交换层析,获得副合蛋。结果：获得具有生物活性的融合蛋白,其纯度达到95%。结论：此工艺操作简便,纯化效果好,获得率高。     

以包涵体形式表达的6B11卵巢癌抗独特型单链抗体的复性、纯化和活性研究

目的：探讨以细菌胞浆内包涵体形式表达的６Ｂ１１卵巢癌抗独特型单链抗体（６Ｂ１１ｓｃＦｖ）的复性、纯化及其活性。方法：重组质粒ｐＬ６Ｂ１１ｓｃＦｖ转化大肠杆菌ｐｏｐ２１３６，温度诱导，以包涵体形式获高效表达。超声破碎细菌细胞得包涵体，用８ｍｏｌ·Ｌ－１尿素溶解包涵体后直接稀释复性，探讨复性条件并采用ＤＥＡＥＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ离子交换层析纯化复性蛋白，ＳＤＳＰＡＧＥ分析蛋白纯度，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ、ＥＬＩＳＡ及竞争抑制ＥＬＩＳＡ测活性。结果：复性蛋白质经纯化，纯度达９５％以上。当氧化型谷胱甘肽（ＧＳＳＧ）浓度为５ｍｍｏｌ·Ｌ－１，还原型谷胱甘肽（ＧＳＨ）浓度为０．５ｍｍｏｌ·Ｌ－１，１０℃复性４８ｈ以上时，复性率较高。纯化后的表达蛋白６Ｂ１１ｓｃＦｖ能与ＨＲＰＣＯＣ１６６９卵巢癌单抗反应并与卵巢癌抗原共同竞争结合卵巢癌单抗ＣＯＣ１６６９，抑制率达６７％，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ显示其相对分子质量为２８×１０４，证明纯化后的表达蛋白质，能模拟卵巢癌抗原与卵巢癌单抗特异结合。结论：以包涵体表达的６Ｂ１１ｓｃＦｖ，经溶解复性纯化后，纯度高，活性好。     

从包涵体中纯化重组人幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位

目的：建立一种有效从包涵体中纯化重组人幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位HspA的方法。方法：重组基因工程大肠杆菌发酵后，表达的Hp r HspA包涵体经洗涤，变性，复性，采用Q Sepharose High Performance阴离子交换层析和Superdex75凝胶过滤层析分离纯化，使用SDS－PAGE和HPLC检测纯度，选用ELISA和动物实验对纯化蛋白的免疫学活性和生物学活性进行鉴定。结果：Hp的HspA包涵经洗涤和溶解后，Hp的HspA的纯度＞60％，包涵体溶解液经阴离子交换层析和凝胶过滤层析后纯度超过95％，Hp的HspA纯品经检测具有良好的免疫学活性和生物学活性。结论：本研究建立的分离纯化方法可从包涵体中获得高纯度的重组HspA蛋白，为进一步的动物实验研究奠定了基础。     

大肠埃希菌表达的含PTD穿膜序列的融合蛋白3种复性方法比较

目的:探索融合蛋白PTD-NFATminiDBD-eGFP纯化以及复性的条件,以提高其复性效率,为后续融合蛋白生物学功能的研究做准备。方法:表达、提取并纯化包涵体形式的融合蛋白PTD-NFATminiDBD-eGFP,分别用稀释复性、透析复性、柱上复性的方法,对融合蛋白进行复性,分析不同方法的特点及包涵体复性率,采用流式细胞术检测融合蛋白的穿膜活性。结果:3种复性方法得到的融合蛋白复性率依次为:柱上复性得率最高,其次是透析复性,稀释复性得率最低。柱上复性后蛋白的穿膜效率最高,相对较低的是稀释复性,而未复性的融合蛋白穿膜效率极低。结论:3种复性方法均能对PTD穿膜蛋白复性,但以柱上复性最佳。     

融合表达的副溶血弧菌不耐热性溶血毒素包涵体复性的研究

目的 构建融合表达载体，获得具有生物活性的副溶血弧菌不耐热性溶血毒素。方法 克隆tlh基因，构建表达载体pET32a ／tlh，融合表达副溶血弧菌不耐热性溶血毒素，用8mol／L的尿素溶解包涵体．亲和层析纯化目的蛋白．采取逐步透析、降低蛋白浓度、加人氧化还原剂等复性方法。结果 复性蛋白具有溶血活性及免疫原性。结论 通过克隆tlh基因，构建融合表达载体pET32a -tlh，采取纯化、复性方法，获得具有融血活性及免疫原性的副溶血弧菌不耐热性溶血毒素。     

重组人肝细胞生长因子重链（rhHGF—α）蛋白的表达与纯化

大肠杆菌中表达的rhHGF-α以包涵体形式存在，表达量约占菌体总蛋白的25％。为了建立一条简便的分离纯化生产工艺，我们研究了包涵体溶解及复性条件，并进行了活性测定。结果表明，用含有4mol/L尿素的缓冲液洗涤包涵体，8mol/L尿素溶解包涵体后的上清，经过SephacrylS-200凝胶过滤，复性后，得到纯度达９０％的rhHGF-α、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ测定相对相对分子质量为52000。与rhHGF-β体外共复性后，完整的rhHGF具有明显刺激原代培养大鼠肝细胞生长的活性。     

抗癫痫肽/GST融合表达及包涵体蛋白复性纯化

[目的]获得高纯度的谷胱甘肽硫转移酶/抗癫痫肽(GST-AEP)融合蛋白。[方法]异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组大肠杆菌DH5α表达GST-AEP融合蛋白,融合蛋白包涵体经过洗涤、变性、复性后,通过12%SDS-PAGE凝胶电泳,考马斯亮蓝染色,凝胶薄层扫描检测其纯度,透析管进一步纯化蛋白,BCA法定量。[结果]从融合蛋白包涵体中获得了纯度达90%以上的目的蛋白,定量约0.163μg/μl。[结论]建立了有效纯化融合蛋白包涵体GST-AEP的方法,为对AEP进一步的相关研究奠定了基础。     

基因重组蛋白L243诱导表达包涵体的变性、复性与纯化

目的 对来自于日本七鳃鳗的基因重组蛋白L243包涵体进行变性、复性与纯化,以获得成分均一的活性蛋白.方法 以6 mol/L尿素为变性剂,以0.1 mol/L氧化型谷胱甘肽及0.9 mol/L还原型谷胱甘肽为复性剂,对构建于pET23b的日本七鳃鳗L243基因在大肠杆菌Rosetta中表达的包涵体进行了的变性、复性与组氨酸亲和层析纯化.结果 经变性、复性后,获得了均质的L243纯化蛋白,该蛋白的复性率达80%.结论 成功对上述重组蛋白包涵体进行了变性、复性及纯化,为后续与此蛋白相关的生物活性测定奠定了物质基础.     

屋尘螨变应原Der p 1基因原核表达产物的纯化及特性鉴定

目的建立屋尘螨主要变应原Derp1蛋白原核表达产物的纯化方法,获得理想的表达产物并鉴定其免疫原性。方法大量诱导表达含pET24a-Derp1质粒的BL21工程菌,表达产物以重组蛋白包涵体的形式存在,包涵体经洗涤与溶解后,使用结合6组氨酸的镍柱进行亲和层析纯化蛋白质,用稀释复性方法进行重组蛋白的复性,再用屋尘螨过敏性哮喘患者阳性血清经Dot-ELISA方法分析Derp1纯化蛋白的抗原活性。结果分步洗涤可有效去除重组蛋白包涵体沉淀中混杂的多数杂蛋白成分,亲和层析分离可获得高纯度重组变应原Derp1蛋白。Dot-ELISA法检测结果表明经复性并纯化的Derp1蛋白呈强阳性反应,最佳血清稀释度为1∶64,而重组蛋白与正常人血清呈阴性反应。结论纯化后的融合蛋白Derp1具有较高的纯度及较强的免疫活性,可望作为有效的屋尘螨变应原诊断试剂和疫苗的候选分子。     

重组THANK诱导表达和变性、复性及纯化

目的 :获得较纯的具有生物学活性的 THANK蛋白。方法 :THANK基因在大肠杆菌中高效表达 ,菌体超声破碎后 ,以洗涤剂反复洗涤包涵体。包涵体经 8mol/L尿素变性溶解后 ,再用 Sephacryl S- 2 0 0凝胶过滤层析初步纯化 ,对重组蛋白浓度、氧化还原剂等复性参数进行优化和选择 ,将蛋白稀释复性。复性后组分经 Q Sapharose Fast Flow离子交换层析再次纯化 ,最后以 Sep hadex G- 2 5脱盐。 结果 :得到了纯度 >97%、具有一定生物学活性的 THANK蛋白。 结论 :THANK蛋白变性、复性及纯化方法的建立 ,为 THANK活性蛋白的制备提供了依据     

人重组MPIF-1(25-99)蛋白的纯化

目的：探索截短型髓样造血细胞抑制因子-1(MPIF—1)蛋白纯化的技术路线。方法：构建MPIF—1(25-99)-pMTY4原核表达载体，转化大肠杆菌后，用摇瓶培养，收获诱导菌，经破碎菌体一洗涤包涵体一溶解包涵体一复性初步纯化后，再经二步柱层析纯化。结果：获得了MPIF—1(25-99)的高效表达，表达量约占苗体总蛋白的30％。经纯化后，MPIF—1(25—99)蛋白的纯度达80％以上。结论：获得纯化的MPIF—1(25——99)蛋白。     

恶性疟原虫富组氨酸蛋白(HRP-Ⅱ)的表达和分离纯化

为获得大量具天然抗原活性的恶性疟原虫HRP-Ⅱ抗原,用摇瓶发酵工程菌,诱导β-半乳糖苷酶-HRP-Ⅱ融合蛋白表达;裂菌后,洗涤沉淀2～3次,用6M脲溶解;取上清经Sephacryl-200柱层析分离纯化目的蛋白,然后复性。结果重组蛋白以包涵体的形式高效表达;Sephacryl-200柱层析后,目的蛋白纯度达86％,91.48％被复性,被Dipstick即 ParsSight-F识别,表明该重组抗原纯度高,复性效果好,可用于恶性疟原虫 HRP-Ⅱ抗体的制备等研究。     

抗入结肠癌单链抗体CL—3在大肠杆菌中的表达,复性和纯化

目的：为得到单链抗体高效表达,我们对抗人结脾性癌单链抗体ＣＬ－３在大肠杆菌中的表达、复性和纯化进行了研究。方法：以重组闰表达载体ＰＪＷ２－ＣＬ－３转化大脾性杆菌ＤＨ５α,重组克隆在培基中温控诱导,以包涵体形式表达单链抗体。包涵体经溶解、复性、纯化后,以ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ鉴定表达蛋白,ＥＬＩＳ单链抗体的免疫活性。结果：４２℃诱导５ｈ蛋白表达量占菌体蛋白３０％。８ｍｏｌ／Ｌ尿素