从包涵体中纯化重组人幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位

目的：建立一种有效从包涵体中纯化重组人幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位HspA的方法。方法：重组基因工程大肠杆菌发酵后，表达的Hp r HspA包涵体经洗涤，变性，复性，采用Q Sepharose High Performance阴离子交换层析和Superdex75凝胶过滤层析分离纯化，使用SDS－PAGE和HPLC检测纯度，选用ELISA和动物实验对纯化蛋白的免疫学活性和生物学活性进行鉴定。结果：Hp的HspA包涵经洗涤和溶解后，Hp的HspA的纯度＞60％，包涵体溶解液经阴离子交换层析和凝胶过滤层析后纯度超过95％，Hp的HspA纯品经检测具有良好的免疫学活性和生物学活性。结论：本研究建立的分离纯化方法可从包涵体中获得高纯度的重组HspA蛋白，为进一步的动物实验研究奠定了基础。     

抗癫痫肽/GST融合表达及包涵体蛋白复性纯化

[目的]获得高纯度的谷胱甘肽硫转移酶/抗癫痫肽(GST-AEP)融合蛋白。[方法]异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组大肠杆菌DH5α表达GST-AEP融合蛋白,融合蛋白包涵体经过洗涤、变性、复性后,通过12%SDS-PAGE凝胶电泳,考马斯亮蓝染色,凝胶薄层扫描检测其纯度,透析管进一步纯化蛋白,BCA法定量。[结果]从融合蛋白包涵体中获得了纯度达90%以上的目的蛋白,定量约0.163μg/μl。[结论]建立了有效纯化融合蛋白包涵体GST-AEP的方法,为对AEP进一步的相关研究奠定了基础。     

重组THANK诱导表达和变性、复性及纯化

目的 :获得较纯的具有生物学活性的 THANK蛋白。方法 :THANK基因在大肠杆菌中高效表达 ,菌体超声破碎后 ,以洗涤剂反复洗涤包涵体。包涵体经 8mol/L尿素变性溶解后 ,再用 Sephacryl S- 2 0 0凝胶过滤层析初步纯化 ,对重组蛋白浓度、氧化还原剂等复性参数进行优化和选择 ,将蛋白稀释复性。复性后组分经 Q Sapharose Fast Flow离子交换层析再次纯化 ,最后以 Sep hadex G- 2 5脱盐。 结果 :得到了纯度 >97%、具有一定生物学活性的 THANK蛋白。 结论 :THANK蛋白变性、复性及纯化方法的建立 ,为 THANK活性蛋白的制备提供了依据     

重组人淋巴毒素α的高密度发酵、复性和纯化

目的建立和优化重组人淋巴毒素α(rhLT-α)工程菌高密度发酵方法以及目的蛋白的复性和纯化方法,得到高纯度的重组人淋巴毒素α。方法高密度发酵rhLT-α工程菌,超声破碎细胞提取包涵体,经过复性后,用DEAE Sepharose FF,Phenyl Sepharose FF(LS)进行分离纯化。结果重组人淋巴毒素α以包涵体形式表达,经过破碎离心收集包涵体,洗涤后包涵体纯度达到85%以上。复性后,经两步纯化,最终目的蛋白纯度达98%以上。活性达6×108U/mg以上。结论建立了高效简便的淋巴毒素生产工艺,为淋巴毒素的规模生产打下了基础。     

BCR/ABL-OD结构域重组蛋白的表达和纯化

目的：制备BCR／ABL-0D结构域-HIS的重组蛋白．方法：用RT-PCR方法扩增BCR／ABL-0D结构域的基因片段,测序正确后将其克隆入原核表达载体pET16b中,并进行酶切鉴定,鉴定正确后转化大肠杆菌B121,构建表达His-OD融合蛋白的菌株．经IPTG诱导表达后,镍-次氮基三乙酸(Ni-NTA)琼脂糖进行亲和层析纯化,用SDS-PAGE对该融合蛋白的表达产率及蛋白纯度进行了分析．结果：获得了His-OD重组融合蛋白,纯度在95%以上,产物得率约75％．结论：成功制备高纯度His-OD融合蛋白,为进一步研究OD结构域的生物学功能奠定了基础。     

乙脑病毒 E蛋白的原核表达、纯化及初步鉴定

目的:构建乙脑病毒(JEV)E蛋白重组载体并在原核细胞BL21(DE3)中表达. 方法:采用RT-PCR扩增片段,定向克隆入pET28a( )中;重组载体pET28a-6His-E转化BL21(DE3),通过酶切、SDS-PAGE和Western Blotting检测其载体构建和蛋白表达;表达产物包涵体经Ni-NTA亲和层析纯化. 结果:构建得到原核融合重组载体pET28a-6His-E;诱导后表达得到6His-E融合蛋白,纯化得到表达产物并进行了初步的鉴定. 结论:表达并纯化得到JEV E蛋白原核表达产物.     

重组人白细胞介素2-绿脓杆菌外毒素融合蛋白的纯化及复性

目的探讨该所发明的新方法对重组人白细胞介素2-绿脓杆菌外毒素(IL2-PE664Glu)融合蛋白进行纯化与复性的效果。方法采用该所发明的新方法提纯包涵体,包涵体复性后,样品经DEAE-SepharoseFF离子交换层析,获得融合蛋白纯品。结果获得的具有生物学活性的融合蛋白纯度达到95%,复性回收率为80%。结论此包涵体分离纯化技术简便、实用,可为中试研究和规模化生产提供基础。     

重组人白细胞介素-2/ 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的纯化及复性研究

目的研究重组人白细胞介素-2/ 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(IL-2/GM-CSF)融合蛋白纯化及复性的最佳条件。方法常规方法提取包涵体,用本室专利技术提纯,复性后样品经DEAE-Sepharose FF离子交换层析,获得融合蛋白。结果获得具有生物活性的融合蛋白,其纯度达到95%。结论此工艺操作简便,纯化效果好,获得率高。     

重组抑肽酶的生产工艺研究

目的：优化融合表达抑肽酶基因工程菌的发酵奈件，分离纯化抑肽酶。方法：设计3因素3水平的正交实验，考查玉米粉浓度、诱导时间和诱导剂乳糖浓度对菌体生长及蛋白表达的影响；在30L发酵罐中进行中试放大试验；菌体经超声破壁和离心得到融合蛋白包涵体，经Bio-gel P30凝胶过滤纯化复性，用FXa切割，回收目的蛋白，最后用Resouree RPC进行纯度验证。结果：融合蛋白的表达量为45％，包涵体复性率为70％以上，抑肽酶纯度为90％，总收率为32％，比活力为3．1EPU／mg。结论：实现了含抑肽酶融合蛋白的较高表达，复性率及纯度达到较高水平，活力与天然产物相当。     

单纯疱疹病毒Ⅰ型Stocker株糖蛋白G基因在PBV221原核表达载体的表达与纯化

目的：构建Ⅰ型单纯疱疹病毒型特异性包膜糖蛋白G基因片段的表达载体，进行原核表达，并纯化目的蛋白。方法：用PCR法扩增HSV1-gG强抗原决定簇的基因片段，将该段基因克隆于PBV221表达载体。转化大肠杆菌DH5α，温控诱导目的蛋白表达，表达产物以包涵体形式存在。用SDS-PAGE和Western blot鉴定目的蛋白，经离子交换纯化获得较纯的目的蛋白。结果：获得了重组的原核表达载体及相对分子质量为14．7kD的重组蛋白，并纯化获得了纯度大于90％的目的蛋白抗原。结论：成功克隆和表达了高纯度的HSV1-gG蛋白。     

幽门螺杆菌HspA-UreB融合蛋白可溶性表达产物的纯化及活性鉴定

目的 :建立一种有效的纯化幽门螺杆菌HspA UreB融合蛋白可溶性表达产物的方法。方法 :基因工程重组大肠杆菌BL2 1(pET HU2 7)诱导表达产物 ,超声破碎后收集上清 ,上清经盐析初步纯化后 ,在 ¨AKTAFPLC上运用HiTrapChelatingHP分离纯化 ,用SDS PAGE和Bradford法检测目的蛋白的纯度和含量 ,用West ern blot对纯化后蛋白进行免疫学活性鉴定。结果 :纯化后HspA UreB融合蛋白的纯度 >90 % ,含量达 0 15mg/ml,并可以被免疫小鼠血清识别。结论 :建立了从BL2 1(pET HU2 7)可溶性表达产物中纯化高纯度HspA UreB融合蛋白的方法 ,为进一步的动物实验研究奠定了基础。     

幽门螺杆菌HspA-UreB融合蛋白的诱导表达与活性鉴定

目的：优化幽门螺杆菌HspA-UreB融合蛋白诱导表达的条件,以提高目的蛋白的产量。方法：表达幽门螺杆菌HspA-UreB融合蛋白的重组基因工程菌BL21（pET-HU27）在不同温度下（25℃、37℃）以不同的IPTG浓度（0.3、1.0和2.0 mmol·L^-1）和不同的培养基（LB、SOC）中分别诱导表达不同时间,表达产物经超声破碎后,进行融合蛋白可溶性分析,并用Western blotting 对表达产物进行鉴定。结果：SDS-PAGE结果显示,37℃时,LB培养基中,0.3 mmol·L^-1的IPTG浓度诱导5 h时,融合蛋白的含量最高为21.51%;25℃,SOC培养基中,1.0 mmol·L^-1的IPTG浓度诱导8 h时,可溶性HspA-UreB融合蛋白含量最高为34.58%,表达产物能够被免疫小鼠血清识别。结论：实现了幽门螺杆菌HspA-UreB融合蛋白在原核细胞中的高效表达,并具有良好的免疫活性,为进一步开发应用以该融合蛋白为抗原的幽门螺杆菌疫苗打下了坚实的基础。     

幽门螺杆菌融合蛋白HspA-UreB在pMAL-C2x中的表达与免疫学活性研究

目的:在pMAL-C2x中表达幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)融合蛋白HspA-UreB,探索其免疫学活性,为Hp基因工程疫苗的研究奠定基础。方法:从重组质粒pNHA27和pNUB27中纯化回收hspA和ureB基因片段,并以hspA-ureB的顺序连接后插入原核表达载体pMAL-C2x中,表达麦芽糖结合蛋白(MBP)与HspA-UreB的融合蛋白。采用亲和层析法纯化融合蛋白MBP-HspA-UreB,并辅以弗氏佐剂皮下免疫小鼠,蛋白印迹法对免疫小鼠血清进行检测。结果:特异PCR法和酶切鉴定证实融合基因hspA-ureB克隆入表达载体,并以融合蛋白形式MBP-HspA-UreB高效表达,相对分子量为119 000,约占细胞总蛋白的31%。通过大肠杆菌抗原吸收法纯化免疫小鼠血清后,与纯化的融合蛋白进行杂交,结果显示在119 000处出现特异杂交带。结论:融合蛋白HspA-UreB具有良好的免疫原性和免疫反应性。     

幽门螺杆菌融合基因hspA-ureB重组质粒的构建及其编码蛋白抗原性预测

目的：构建幽门螺杆菌(H．pylori)郑州分离株MEL-HP27的hspA-ureB融合基因的克隆,并运用生物信息学软件预洲融合蛋白HspA-UreB的空间结构和抗原性。方法：从重组质粒pNHA27和pNUB27分别纯化同收hspA和ureB基因片段,并以hspA-ureB的顺序插入温控表达载体pBV220中,用质粒酶切电泳和特异PCR方法鉴定重组质粒。利用生物信息学软件和Genbank数据库分析hspA-ureB表达蛋白的抗原性和空间结构。结果：质粒酶切电泳和特异PCR均可见2．06kb的融合基因片段。生物学软件分析显示：MEL-HP27融合蛋白HspA-UreB的长度为689个氨基酸,蛋白相对分子质量为76500,等电点为5．79,具有5个抗原活性结构域。结论：成功构建了MEL-HP27融合蛋白HspA-UreB的重组表达质粒,编码融合蛋白具有典型抗原分子的结构特征,有望成为H.pylori疫苗候选抗原。     

重组钩端螺旋体多抗原位点同源合成基因的表达及其抗原性鉴定

目的：构建重组钩端螺旋体(钩体)优势抗原表位原核表达系统,以期获得高纯度的钩体优势抗原表位重组融合蛋白,为进一步研究钩体快速检测方法奠定基础。方法：利用基因重组的方法构建表达质粒pET-rLP。经IPTG诱导后,获得高效表达带组氨酸标签的以包涵体形式存在的融合蛋白,包涵体蛋白经尿素变性溶解,采用镍离子亲和纯化,利用SDS-PAGE、Western blotting和间接ELISA法鉴定。结果：在相对分子质量为20 000处有1条特异性蛋白条带,为重组钩体优势抗原表位融合蛋白;ELISA结果显示其可与钩体阳性血清特异性结合,而与其他血清无交叉反应。结论：成功构建重组钩体优势抗原表位原核表达系统,并获得高纯度的重组钩体优势抗原表位融合蛋白。     

巢蛋白样结构域蛋白的表达?纯化与鉴定

目的:重组构建原核表达载体以正确表达巢蛋白样结构域(nidogen domains,NIDO)蛋白,并进一步纯化与鉴定?方法:PCR法拼接NIDO基因,经T-A连接亚克隆至pMD19-T载体,测序鉴定?采用质粒抽提?纯化?酶切?连接?感受态细胞制备和转化等技术,构建并鉴定原核表达载体pGEX-4T-1-NIDO?药物诱导方式诱导NIDO-GST融合蛋白的表达?对表达产物进行分离,用SDS-PAGE检测上清与包涵体沉淀中目的蛋白的表达量?对包涵体进行变性和透析复性后,进行GST亲和层析纯化?采用SDS-PAGE和质谱分析,鉴定纯化的目的蛋白?结果:测序证实了NIDO基因的正确合成和pMD19-T-NIDO克隆载体的构建?原核表达系统pGEX-4T-1-NIDO构建成功,在大肠杆菌BL21中被诱导,获得高表达量的N-末端带有GST标签序列的重组融合表达蛋白(30%)?超声裂菌法分离的结果显示,目的蛋白在菌体沉淀中以包涵体形式居多?将包涵体变性?复性后用GST亲和层析纯化,纯化蛋白> 80%并经质谱鉴定证实?结论:成功构建原核表达载体pGEX-4T-1-NIDO,能正确表达NIDO-GST融合蛋白,GST亲和层析对于NIDO-GST融合蛋白有较好的纯化效果?     

蜱传森林脑炎病毒非结构蛋白1原核表达载体的构建

目的：构建蜱传森林脑炎病毒（TBEV）非结构蛋白1(NS1)的原核表达载体,以期获得其高纯度的表达,为制备多克隆抗体及其功能的研究奠定实验基础。方法：根据目的基因序列设计PCR引物,利用基因重组技术构建原核表达载体pEASYTM-E1-NS1。将重组后质粒pEASYTM-E1-NS1转化至BL21细胞,经异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导后进行镍离子亲和纯化,利用Bradford法测定蛋白浓度。采用SDS-PAGE和Western blotting法分析融合蛋白的表达水平。结果：含TBEV
NS1的原核表达载体pEASYTM-E1-NS1经诱导后,可获得以包涵体形式存在的融合蛋白,通过亲和纯化得到较高纯度的蛋白质。SDS-PAGE和Western blotting,在相对分子质量约40 000处有特异性蛋白条带。结论：成功构建重组pEASYTM-E1-NS1原核表达载体,获得高纯度的重组TBEV NS1的融合蛋白。     

幽门螺杆菌儿童分离株中性粒细胞激活蛋白克隆及表达序列

目的：从幽门螺杆菌临床儿童分离株GZCH1基因组扩增中性粒细胞激活蛋白（NAP）基因,克隆入T载体,并亚克隆入表达载体pGEX-4T-1,进行测序及基因比对分析,为幽门螺杆菌疫苗研制奠定基础.方法：根据GenBank中幽门螺杆菌NAP序列,设计一对特异性引物扩增幽门螺杆菌临床儿童分离株NAP全长基因,与T载体连接,转化大肠杆菌DH5α,提取质粒进行酶切、测序鉴定,经EcoR Ⅰ、Not Ⅰ双酶切后与做相应酶切的pGEX-4T-1连接,转化大肠杆菌BL21,提取质粒进行双酶切鉴定,IPTG诱导重组蛋白表达,并对基因进行测序及比对分析.结果：以幽门螺杆菌儿童分离株GZCH1为模板,成功扩增了NAP基因,基因大小为435 bp,重组pGEX-4T-1-NAP双酶切鉴定可见目的片段,测序结果显示NAP在正确读框中,序列比对分析显示其与幽门螺杆菌J99株氨基酸一致性达99.2％,IPTG诱导后,pGEX4T-1-NAP/BL21在相应分子量（42.8 kD）可见融合蛋白的表达.幽门螺杆菌儿童分离株GZCH1 NAP序列已登录GenBank（登录号：GU301881）.结论：从幽门螺杆菌临床儿童分离株GZCH1中成功克隆了NAP基因,并获得重组蛋白的表达,为NAP幽门螺杆菌疫苗研制奠定了良好的基础.