自体骨髓干细胞移植治疗急性心肌梗死的实验及临床研究

目的:将大体动物自体骨髓间质干细胞移植至心肌梗死后的心肌瘢痕组织中,观察骨髓干细胞在梗死区的存活以及对心功能的改善情况,为临床应用自体骨髓干细胞移植治疗心肌梗死及各种原因导致的心力衰竭提供相关依据。方法:选择12只中国小型家猪,应用闭胸经股动脉介入的方法制作动物急性心肌梗死模型。同时抽取髂骨骨髓20ml进行骨髓干细胞的分离、纯化及细胞培养。AMI后2d所有动物经心脏彩超及ECT判定梗死心肌部位,并评价心功能。心肌梗死后10～14d在局麻下行冠脉造影,实验组(n=7只)在梗死区中心经微导管注入2ml骨髓干细胞悬液(1×108个细胞),对照组(n=5只)同法注入生理盐水。骨髓干细胞移植术后2、8周,行心脏彩超及ECT检查测定心功能、心肌收缩功能及梗死面积积分等指标,并据以上定位截取移植部位心肌标本进行光镜、电镜检查以观察大体形态及超微结构。结果:心脏彩超提示实验组左室收缩末期直径(LVSd)较对照组缩短0～5mm,左室收缩末期容积(SYS VOL)缩小40.1±11.2ml～36.2±10.6ml,左室射血分数(LVEF)增加43%±2.50%对照组为47%±2.36%,左室舒张末期直径(LVDd)及左室舒张末期容积(DIA VOL)无明显变化;99mTc-MIBI显示实验组梗死面积缩小34%±12%,对照组21%±10%;免疫组化染色实验组阳性,电镜结果显示心肌样细     

自体骨髓间质干细胞移植治疗急性心肌梗死

目的：将大体动物自体骨髓间质干细胞移植至心肌梗死后的心肌瘢痕组织中，观察细胞在梗死区的存活以及对心功能的改善情况。方法：实验于2003-04／2004—03在徐州医学院第二附属医院介入导管室完成。①选择21只中国小型家猪，三四个月龄，体质量30-40kg。随机分为实验组11只和对照组10只，应用闭胸经股动脉介入的方法制作动物心肌梗死模型。②10余天后实验组将培养的自体骨髓干细胞移植于梗死区，对照组在梗死区植入营养液。（要）8周后，以心脏彩超及放射性核素心肌扫描观察梗死心肌的恢复及心功能的变化。④最后行组织学分析。结果：①21只家猪，实验过程中死亡3只，1只建模未成功，进入结果分析实验组9只，对照组8只。②心脏彩超显示实验组移植后左室射血分数较移植前增加[（42．07&;#177;2.06）％，（47．00&;#177;2．36）％，P〈0．05]。③^99Tc^m-MIBI显示实验组梗死面积比移植前缩小[（34&;#177;12）％，（21&;#177;10）％]。④实验组微血管密度较对照组显著增加（8．32&;#177;1．26）个／0．2mm^2，（4．61&;#177;1．32）个／0．2mm^2，P〈0．05]。结论：自体骨髓间质干细胞移植至梗死区后，可使梗死面积缩小，心脏功能改善。     

兔骨髓单个核细胞自体移植对缺血心肌修复重建及心功能的改善

目的:观察兔骨髓单个核细胞自体移植至缺血心肌后的修复重建能力,以及心功能的改善状况。方法:实验于2005-07/2006-04在安徽省干细胞研究和治疗中心完成。①选取清洁级健康雄性新西兰白兔20只,随机数字表法分为心肌梗死模型组、骨髓单个核细胞组,10只/组。②两组兔均于左心耳下缘结扎前降支冠状动脉左前降支建立心肌梗死模型,心电图出现S-T段弓背样抬高为结扎成功。③2周后于股骨处行骨髓穿刺取5mL骨髓,分离纯化骨髓单个核细胞。骨髓单个核细胞组将Dil标记的含2.5×107细胞数目的细胞悬液400μL注射至心肌梗死周边区域,心肌梗死模型组仅注射等量L-DMEM培养基。③两组分别于造模前、细胞移植前及细胞移植后2,4周行多普勒心脏超声心动图检查,计算左室射血分数、左室短轴短缩率,进行心功能评价。④细胞移植8周后处死全部动物,制备组织冰冻切片,病理学检查移植细胞在梗死区的生长状况,镜下见有Dil标记阳性的细胞认为是存活的移植细胞。普通光学显微镜200倍视野下计数毛细血管数量。结果:骨髓单个核细胞组10只均进入结果分析;心肌梗死模型组因造模死亡4只,6只兔完成整个实验过程。①不同时相点心功能指标超声心动图检查结果:两组造模前、细胞移植前、细胞移植后2周左室射血分数、左室短轴短缩率均基本相似(P>0.05);移植后4周,骨髓单个核细胞组左室射血分数、左室短轴短缩率均明显高于心肌梗死模型组犤(69.1±5.3)%,(62.4±7.8)%;(34.3±8.4)%,(27.2±5.3)%;P均<0.05犦。②骨髓单个核细胞在梗死心肌中的存活情况:荧光显微镜下,骨髓单个核细胞组梗死灶边缘有Dil标记的细胞存活,免疫组化结果显示Dil阳性细胞表达心肌细胞特异性标志α-sarcomericactin。两组均未见炎性细胞浸润,但骨髓单个核细胞组新生毛细血管密度明显高于心肌梗死模型组犤(38.5±2.0)mm-2,(21.4±3.9)mm-2,P<0.05犦。结论:兔骨髓单个核细胞自体移植8周后存活于梗死心肌中,并表达心肌细胞特异性标志,移植后可明显改善左室收缩功能,增加毛细血管密度,但短期内未减轻心室重构的进程。     

经冠状动脉移植自体骨髓基质干细胞改善成年心肌梗死犬的心功能

目的:观察经冠状动脉注射成年犬自体骨髓基质干细胞对梗死后心功能的影响。方法:本实验于2001-05/2002-04在解放军第二军医大学附属长征医院心内科实验室完成。选用成年犬8只,随机分为细胞移植组5只,对照组3只。结扎犬冠状动脉前降支制备心肌梗死模型;细胞移植组将体外培养、诱导的自体骨髓基质干细胞标记后在心肌梗死后4周经冠状动脉植入心脏;对照组植入等量培养基。胸内心脏超声检查测定左冠状动脉血流阻断前,再灌注后30min及移植后4周左心室射血分数;胸外心脏超声检查测定左冠状动脉血流阻断前、移植前、移植后4周左心室射血分数。用成组t检验和随机区组方差分析完成统计学分析。结果:进入结果分析犬8只。①植入的骨髓基质干细胞在移植犬心肌组织内存活情况:细胞移植组免疫组织化学检查结蛋白及肌钙蛋白I染色阳性,表示已生成心肌样细胞。对照组心脏标本中可见瘢痕组织;心肌细胞结蛋白染色阴性,肌钙蛋白I染色阳性。②移植犬左室功能的左室射血分数:经胸外心脏彩色多普勒超声检查提示,细胞移植组细胞移植前明显低于血流阻断前和移植后4周犤(54.86±7.12)%,(61.78±5.37)%,(61.74±2.93)%,P<0.01犦;细胞移植组细胞移植后4周接近血流阻断前(P>0.05);对照组移植后4周和移植前明显低于血流阻断前(P<0.01)。③移植犬左室功能的左室射血分数:经胸内心脏彩色多普勒超声检查反映,细胞移植组再灌注后30min明显低于血流阻断前和移植后4周犤(49.98±6.79)%;(61.56±3.71)%,(64.56±5.27)%,P<0.01犦。移植后4周明显高于血流阻断前(P<0.05)。对照组移植后4周和再灌注后30min明显低于血流阻断前(P<0.05,0.01)。结论:成年心肌梗死犬自体骨髓基质干细胞经冠状动脉移植后,在心肌组织内存活并分化为肌源性细胞使左心室功能改善。     

自体骨髓单个核细胞移植对急性心肌梗死后雄兔心脏功能的影响

目的:评估未经诱导的自体骨髓单个核细胞移植于兔的心肌梗死区及周边区后对心脏功能的影响,并观察移植后细胞的存活情况。方法:采用结扎日本大耳雄兔左冠状动脉前降支的方法建立急性心肌梗死模型。将40只存活兔随机分为2组:移植组、对照组,每组各20只,其中移植组于术后第7天在梗死区及周边区注射0.7mL含3.41×107个自体骨髓单个核细胞的细胞悬液移植,而对照组仅在相同的部位注射等量的生理盐水。心梗前后以及细胞移植后6周,利用彩色多普勒超声心动仪评价心脏功能的改变,然后收集动物心脏,进行组织学及免疫组织化学检查。结果:心肌梗死前后,移植组与对照组的心脏功能相比较,差异无显著性意义(P>0.05)。细胞移植后,移植组的心脏射血分数、左室短轴缩短率、左室壁运动幅度、左室壁收缩末期厚度及舒张末期厚度、左室壁增厚率明显高于对照组(t=2.98～6.50,P<0.01),心室率犤(249.08±28.52)次/min〗明显低于对照组犤(269.75±5.21)次/min犦(t=2.24,P<0.05)。移植组梗死心肌及周边区内可以观察到移植细胞的存活。结论:自体骨髓单个核细胞移植可以改善发生了急性梗死的心脏功能并在心肌的梗死区及周边区存活。     

体外纯化后和诱导后骨髓间充质干细胞与骨髓单个核细胞移植治疗心肌梗死的效果比较

目的:将骨髓单个核细胞、体外培养纯化后及诱导后的骨髓间充质干细胞注射至大鼠心肌梗死区域,观察移植细胞的增殖及分化情况,分析其对缺血心肌细胞修复重建能力与心功能改善的影响。方法:实验于2005-07/2006-04在安徽省干细胞研究和治疗中心完成。取清洁级健康雄性新西兰白兔40只,按随机数字表法分为4组:骨髓间充质干细胞组、5-杂氮胞苷诱导组、骨髓单个核细胞组、对照组,10只/组。均于左心耳下缘结扎冠状动脉左前降支建立心肌梗死模型,心电图出现S-T段弓背样抬高认为结扎成功。2周后骨髓间充质干细胞组注射第3代自体骨髓间充质干细胞1×106个,5-杂氮胞苷诱导组注射经5-杂氮胞苷诱导24h的第3代自体骨髓间充质干细胞1×106个,骨髓单个核细胞组注射骨髓单个核细胞2.5×107个/400μL,对照组仅注射400μL L-DMEM培养基。分别在术前、移植前、移植后2,4周应用超声心动图评价心脏功能,同时利用心肌声学造影观察缺血区的血流灌注情况。细胞移植后8周采用免疫荧光检测移植细胞在梗死区的生长状况,苏木精-伊红染色于普通显微镜下记数梗死区毛细血管密度。结果:骨髓间充质干细胞组9只、5-杂氮胞苷诱导组9只、骨髓单个核细胞组10只、对照组6只进入结果分析,其余动物因造模死亡未能完成整个实验。①超声心动检查发现术前、细胞移植前4组左室射血分数、左室短轴短缩率组间比较差异不显著;与对照组相比,细胞移植后2,4周骨髓间充质干细胞组和5-杂氮胞苷诱导组左室射血分数、左室短轴短缩率明显升高[对照组:(60.4±5.1)%,(62.4±7.8)%;(28.8±1.4)%,(27.2±5.3)%;骨髓间充质干细胞组:(70.8±4.6)%,(70.4±6.1)%;(33.8±3.4)%,(33.9±3.5)%;5-杂氮胞苷诱导组:(71.7±6.8)%,(70.3±5.8)%;(34.7±5.7)%,(35.5±6.3)%,P<0.05];左室收缩末内径、左室舒张末内径细胞移植组与对照组相比,差异不显著;心肌声学造影见细胞移植后心肌梗死区血流灌注改善明显。②细胞移植术后8周,所有细胞移植组均见Dil阳性移植细胞存活,并表达α横纹肌肌动蛋白和结蛋白。5-杂氮胞苷诱导组Dil阳性细胞出现具有典型横纹和肌小节样结构的心肌样细胞,各细胞移植组毛细血管密度均较对照组明显增多[(38.6±7.6)/mm2,(32.9±5.7)/mm2,(38.5±2.0)/mm2,(21.4±3.9)/mm2,P<0.05],各移植组间差异不显著。结论:①体外纯化培养与经5-杂氮胞苷诱导24h的骨髓间充质干细胞,以及新鲜分离的骨髓单个核细胞自体移植8周后均存活于梗死心肌中,并表达心肌细胞特异性标志α横纹肌肌动蛋白和结蛋白,移植后可明显改善左室收缩功能,增加毛细血管密度,改善局部血流灌注。②5-杂氮胞苷有助于促进骨髓间充质干细胞在体内向心肌细胞的分化成熟。     

骨髓间质干细胞移植治疗大鼠急性心肌梗死的病理学观察

目的:观察急性心肌梗死大鼠行骨髓间质干细胞移植后受损心肌组织的病理形态学变化。方法:实验于2004-01/2005-06在上海胸科医院完成。选取健康成年雌性SD大鼠40只,随机数字表法分为骨髓间质干细胞注射组、模型对照组,20只/组。①两组大鼠均建立心肌梗死模型。造模0.5h后,骨髓间质干细胞注射组于结扎点下方缺血区域组织注射Dill标记的骨髓间质干细胞3×106个,模型对照组心肌缺血区域注射100μL生理盐水。②造模后4～6周处死两组大鼠,取出心脏,剪除双侧心房及右心室,沿左心室长轴由心尖到底部做3mm厚切片,镜下观察心肌梗死区域病理组织学表现。③选择心肌梗死表现明显的蜡块切片,行酸性复红染色,用LeicaQWin多媒体彩色病理图文分析软件进行图像分析,自动测量出切片中心肌梗死组织占总面积的百分比。免疫组化检测梗死心肌血管内皮生长因子和FactorⅧ蛋白因子的表达情况。结果:40只大鼠均进入结果分析。①梗死心肌的病理形态学观察:光镜下两组均可见大小不等的心肌梗死灶,梗死心肌区域细胞肿胀坏死,严重缺血坏死区出现心肌溶解。但骨髓间质干细胞注射组上述改变明显弱于模型对照组,其心肌梗死中层可见条索状的梗死灶及纤维瘢痕灶,并且有残存的心肌呈岛状散在分布,纤维瘢痕区域心肌细胞、微血管和毛细血管数量均明显增加,侧支循环丰富。另外,骨髓间质干细胞移植组于造模初期4只大鼠心内膜面有灶性软骨生成,向心室腔突起。②梗死心肌面积百分率的检测:骨髓间质干细胞注射组梗死心肌面积百分率明显低于模型对照组[(3.69±0.48)%,(19.20±1.77)%,t=7.621～10.820,P=0.001]。③梗死心肌血管内皮生长因子和FactorⅧ免疫组化检测:骨髓间质干细胞注射组血管内皮生长因子、FactorⅧ呈阳性表达,模型对照组未检测到血管内皮生长因子和FactorⅧ。结论:骨髓间质干细胞在大鼠心脏内可以转化为血管内皮细胞或分泌血管内皮生长因子,是治疗缺血性心血管疾病理想的细胞来源。心内膜面有灶性软骨生成可能是由于注射细胞时进针太深,警示注意骨髓间质干细胞移植的副反应。     

骨髓干细胞动员与缺血心肌血管再生

目的:探讨动员急性心肌梗死大鼠骨髓干细胞归巢于梗死心肌后实现血管再生的能力。方法:实验选用10～12周龄的雄性Wistar(清洁级)大鼠60只,随机分为3组:急性心肌梗死+动员组、急性心肌梗死组及对照组,每组20只。结扎Wistar大鼠左冠状动脉制作心肌梗死模型,用骨髓干细胞动员剂粒细胞集落刺激因子动员自体骨髓干细胞释放并归巢于心肌梗死灶,于造模后24,48h和4周杀死大鼠,取出心脏,通过免疫组化方法观察心肌梗死灶、边缘区和正常心肌组织CD34阳性细胞、血管内皮生长因子及其受体的表达,以及VIII因子表达,并应用流式细胞术比较动员前后外周血中CD34阳性细胞数量的变化。结果:急性心肌梗死+动员组大鼠造模24h,4周后外周血CD34细胞数量分别为(0.919±0.187)%,(0.834±0.110)%,明显高于造模前犤(0.043±0.023)%犦及心肌梗死组大鼠造模24h,4周后犤(0.071±0.104)%,(0.062±0.296)%犦(t=2.697,2.354,2.492,2.195,P<0.05)。急性心肌梗死+动员组大鼠心肌梗死区可见CD34阳性细胞浸润;制模后4周,急性心肌梗死+动员组微血管新生数明显多于急性心肌梗死组和对照组(t=3.125,3.308,P<0.01)。急性心肌梗死+动员组大鼠梗死灶及周围组织中血管内皮生长因子及其受体的表达量均明显高于急性心肌梗死组及假手术组(t=2.099～3.398,P<0.05)。结论:骨髓干细胞动员的方法在大鼠急性心肌梗死模型中,能通过动员内皮干细胞归巢于梗死灶内,有效促进微血管形成;还通过上调血管内皮生长因子及其受体的表达,促进血管再生,促进缺血心脏功能恢复。     

冠状动脉内自体骨髓干细胞移植治疗急性心肌梗死

目的观察自体骨髓干细胞冠状动脉内移植对患者心功能和心肌梗死面积的影响。方法2005年01月～2005年12月收治的36例急性心肌梗死患者在入院后随机分为骨髓干细胞移植组(n=16)和对照组(n=20)。干细胞移植组于入院后在常规治疗基础上加用自体骨髓干细胞经冠状动脉注入;对照组按急性心肌梗死常规方法治疗。于入院后第7天,术后2、4、6、8周及6月,行核素心肌灌注断层显像,测量心功能及心肌梗死面积。结果干细胞移植组术前及术后第2周与对照组的心功能及梗死面积无明显差别(P>0.05);术后第4周,患者心功能较第二周明显改善(P<0.01);第6周优于第4周(P<0.01);术后第8周与第6周无明显区别,但明显优于对照组,6月后与第6周相仿。心肌梗死面积由术前的(30.3±6.6)%下降至术后第4周(25.7±7.5)%,第6周(18.5±8.2)%,6月后为(8.2±8.5)%;而对照组变化不明显(P>0.05)。结论自体骨髓干细胞移植可减小心机梗死的范围,有效改善心功能,术后第6周效果最佳,并维持到术后6月。     

骨髓间充质干细胞不同移植方法对急性心肌梗死心功能的改善作用比较

目的:观察不同方法移植骨髓间充质干细胞对心功能的影响,分析移植方法与心功能改善的关系。方法:实验于2004-02/2005-10在郑州大学医学院干细胞中心和机能中心完成。体外获取、培养大鼠骨髓间充质干细胞。结扎左冠状动脉前降支制备大鼠急性心肌梗死模型,结扎后观察前壁心肌颜色变苍白、收缩力减弱、心电图相应导联ST段弓背向上抬高,确定心肌梗死模型建立。将建模成功的大鼠分成4组,每组10只,2周后进行细胞移植。静脉对照组:尾静脉注射L-DMEM0.6mL;静脉移植组:尾静脉注射5溴脱氧尿嘧啶标记骨髓间充质干细胞悬液0.6mL;心外膜对照组:在大鼠心肌梗死区分8点注射L-DMEM0.6mL;心外膜移植组:在大鼠心肌梗死区分8点注射5溴脱氧尿嘧啶标记的骨髓间充质干细胞悬液0.6mL。移植4周后检测大鼠左室射血分数、短轴缩短率、血流动力学指标评价心功能,采用免疫组织化学检测大鼠心肌组织中骨髓间充质干细胞对心肌肌钙蛋白T的表达。结果:40只大鼠均进入结果分析。①与移植前比较,静脉对照组与心外膜对照组心脏功能逐渐恶化,左室射血分数及短轴缩短率降低。静脉移植组与心外膜移植组左室射血分数及短轴缩短率均较移植前升高,并且心外膜移植组高于静脉移植组[移植前:左室射血分数:(27.09±2.46)%,(26.62±2.31)%,短轴缩短率:(24.09±3.13)%,(24.52±3.01)%;移植后:左室射血分数:(35.12±2.68)%,(46.31±3.15)%,短轴缩短率:(28.32±3.68)%,(32.38±2.35)%,P<0.05]。与静脉移植组相比,心外膜移植组左心室收缩压、左室压力变化最大上升速率、左室压力变化最大下降速率升高、左室舒张末期压降低[静脉移植组:(105.27±5.56)mm Hg,(18.02±3.63)mm Hg,(4595±389)mm Hg/s,(3768±525)mm Hg/s;心外膜移植组:(123.89±9.64)mm Hg,(13.79±3.92)mm Hg,(4988±513)mm Hg/s,(4193±563)mm Hg/s,P<0.05]。②心外膜移植组和静脉移植组梗死心肌内均可见5溴脱氧尿嘧啶阳性移植细胞,对心肌肌钙蛋白T呈阳性表达。结论:心外膜移植细胞和静脉移植细胞对急性心肌梗死心功能均有改善作用,并且心外膜途径移植对急性心肌梗死心功能改善程度强于静脉移植途径。