人4-1BB-hIgG1Fc融合蛋白真核表达载体的构建

目的：构建人４１ＢＢ胞膜外区ｈＩｇＧ１Ｆｃ融合蛋白真核表达载体。方法：ＰＣＲ扩增人４１ＢＢ胞膜外区和ｈＩｇＧ１Ｆｃ基因片段，用ＨｉｎｄⅢ、ＰｓｔＩ酶切４１ＢＢ胞膜外区，ＰｓｔＩ　、ＥｃｏＲ　Ｉ　酶切ｈＩｇＧ１Ｆｃ　，ＨｉｎｄⅢ、ＥｃｏＲＩ　酶切ｐＣＤＮＡ３，纯化后的酶切产物经Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接，转化大肠杆菌ＤＨ５α，氨苄青霉素筛选阳性克隆，ＰＣＲ及测序鉴定。结果：连接反应产物转化大肠杆菌ＤＨ５α，氨苄青霉素筛选出多个阳性克隆；分别以针对４１ＢＢ胞膜外区和ｈＩｇＧ１Ｆｃ的引物进行ＰＣＲ扩增，电泳后观察到一５５８ｂｐ、７０８ｂｐ的特异性条带，与４１ＢＢ胞膜外区和ｈＩｇＧ１Ｆｃ相符，提示构建成功。进一步测序分析证明克隆在ｐＣＤＮＡ３　质粒中的４１ＢＢ和ｈＩｇＧ１Ｆｃ序列和读码框架正确，无基因突变。结论：成功构建人４１ＢＢ胞膜外区ｈＩｇＧ１Ｆｃ融合蛋白真核表达载体，为表达４１ＢＢ融合蛋白奠定基础。     

人脑胶质细胞来源神经营养因子基因的克隆及测序

为研究人脑胶质细胞来源的神经营养因子（ｇｌｉａｌｃｅｌｌｌｉｎｅ ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ, ＧＤＮＦ） 在神经系统疾病中的作用,根据ＧＤＮＦ 的ｃＤＮＡ 序列设计并合成引物,以流产胎儿脑组织为来源,分别提取ＲＮＡ 和基因组ＤＮＡ 作模板,经ＲＴ ＰＣＲ 和ＰＣＲ 技术扩增人ＧＤＮＦ 基因片段,采用ＤＮＡ 重组技术将其克隆于ｐＧＥＭ Ｔ Ｅａｓｙ 载体中并测序。结果：ＲＮＡ 和基因组ＤＮＡ 体外扩增得到的片段均是４１０ ｂｐ ,两者无差异。ＰＧＥＭ ＧＤＮＦ 经酶切鉴定正确,测序结果与Ｇｅｎｅｂａｎｋ 比较基本相同。由于ＲＮＡ 和基因组ＤＮＡ 扩增得到的片段大小相同,证实该基因片段内无内含子插入,该片段可用于真核及原核表达。     

利用PCR技术构建GM—CSF／Fcγ2融合蛋白载体

目的：构建 Ｇ Ｍ Ｃ Ｓ Ｆ／ Ｆｃγ２ 融合蛋白载体。方法：利用 Ｐ Ｃ Ｒ技术,将人 Ｇ Ｍ Ｃ Ｓ Ｆ基因与人免疫球蛋白 Ｉｇ Ｇ２ 的 Ｆｃ 段基因联接,构建融合基因ｈ Ｇ Ｍ Ｃ Ｓ Ｆ Ｈ Ｖ２;并将此片段定向克隆到真核表达质粒ｐ Ｒｃ／ Ｃ Ｍ Ｖ２ 载体。结果：琼脂糖凝胶电泳结果显示 Ｐ Ｃ Ｒ扩增出了 １．３ ｋｂ 的融合基因片段;限制性内切酶图谱分析,成功地完成了 Ｇ Ｍ  Ｃ Ｓ Ｆ／ Ｆｃγ２ 融合蛋白载体的构建。结论：（１）经 Ｐ Ｃ Ｒ 扩增技术由质粒 Ｐ Ｃ Ｄｈ Ｇ Ｍ Ｃ Ｓ Ｆ和 Ｐ Ｓ Ｖ Ｖ Ｎ Ｐ Ｈ Ｖ２ 分别扩增到了所需的ｈ Ｇ Ｍ Ｃ Ｓ Ｆ ｃ Ｄ Ｎ Ａ 片段和 Ｉｇ Ｇ２ 从绞链区到 Ｃ Ｈ３ 的基因组 Ｄ Ｎ Ａ 片段。（２）利用 Ｐ Ｃ Ｒ介导,扩增出了融合基因片段ｈ Ｇ Ｍ Ｃ Ｓ Ｆ Ｈ Ｖ２。（３）构建了真核细胞表达载体ｐ Ｒｃ／ Ｃ Ｍ Ｖ２／ｈ Ｇ Ｍ Ｃ Ｓ Ｆ Ｈ Ｖ２ 。     

重组人肝细胞生长因子基因的克隆

用ＲＴ－ＰＣＲ技术从人胎盘组织内成功地扩增全长肝细胞生长因子（ＨＧＦ）ｃＤＮＡ基因（２ １８４ｂｐ）,并将其克隆至ｐＧＥＭ－Ｔ载体,经限制性核酸内切酶ＮｄｅⅠ,ＢｇｌⅡ,ＨｉｎｄⅢ,ＢａｍＨⅠ和ＸｈｏⅠ的酶谱分析和ＤＮＡ测序分析证实。再将其亚克隆至逆病毒载体ｐＬＮＬ－ＸＨＣ,可进一步用于基因表达和基因治疗的研究。     

人碱性成纤维细胞生长因子基因真核表达质粒的构建

目的：构建人碱性成纤维细胞生长因子（ｈｂＦＧＦ）基因真核表达质粒,为深入研究ｈｂＦＧＦ在组织修复中的分子调节机制及临床应用提供物质基础。方法：含ｈｂＦＧＦ ｃＤＮＡ的ｐＵＣ１８－ｈｂＦＧＦ质粒于大肠杆菌ＪＭ１０９内扩增;提取及纯化ｐＵＣ１８－ｈｂＦＧＦ质粒;经ＤＮＡ序列分析所含ｈｂＦＧＦ ｃＤＮＡ;限制性酶切ｈｂＦＧＦ ｃＤＮＡ片段,连接酶连接到真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３－ｎｅｏ内,克隆出真核表达质     

人端粒重复序列结合因子1^33—277在大肠杆菌中的？…

目的：建立能高效表达人端粒重复序列结合因子１第＾３３－２７７位（ＴＲＦ１＾３３－２７７）氨基酸的菌株并制备多抗。方法：设计一对引物,分别带有Ｋｐｎ Ｉ和ＥｃｏＲＩ位点,从已经克隆了ＴＲＦ１ｃＤＮＡ全长的重组质粒ｐＣＲⅡ－ＴＯＰＯ－ＴＲＦ１扩增ＴＲＦ１＾３３－２７７ｃＤＮＡ片段,克隆入ＰＧＥＭ－Ｔ质粒,测序和酶切图谱鉴定,ＥｃｏＲＩ酶切后亚克隆入ｐＧＥＸ－３Ｘ的ＥｃｏＲＩ位点之间,筛选在向插入重组子     

绿色荧光蛋白基因gfp真核表达载体pcT K GFP的构建

目的：构建携带绿色荧光蛋白基因（ｇｆｐ） 的真核表达载体ｐｃＴＫＧＦＰ,为利用绿色荧光蛋白标记在实验动物体内进行自杀性基因治疗的研究和转基因动物打靶载体的构建提供基因材料。方法：采用ＰＣＲ技术从商品质粒ｐＥＧＰＣ１ 中扩增出ｇｆｐ（７９９ ｂｐ）,ＰＣＲ产物用ＸｂａⅠ和ＢａｍＨⅠ双酶切后定向克隆至真核表达载体ｐｃＴＫ,重组质粒ｐｃＴＫＧＦＰ用限制性内切酶和ＤＮＡ序列分析进行鉴定。结果：部分ＤＮＡ 序列分析证明ＰＣＲ产物为ｇｆｐ,成功筛选到携带ｇｆｐ 的真核表达载体ｐｃＴＫＧＦＰ。结论：ｐｃＴＫＧＦＰ真核表达载体的构建,为利用绿色荧光蛋白标记在实验动物体内进行自杀性基因治疗的研究和转基因动物打靶载体的构建奠定了基础。     

人巨细胞病毒株DNA限制性片段长度多态性分析

为深入开展人巨细胞病毒（ＨＣＭＶ）感染的分子流行病学和发病机理研究，作者从不同人群获得１０株ＨＣＭＶ，经培养、传代和增殖后提取病毒ＤＮＡ，而后分别用限制性内切酶ＨｉｎｄⅢ和ＥｃｏＲＩ消化，用＾３２Ｐ标记的ＨＣＭＶ ＤＮＡ ＨｉｎｄⅢ亚克隆片段（ｐＣＭ１０１５、ｐＣＭ１０３５）做探针，进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交和限制性片段长度多态性分析。结果显示：该１０株ＨＣＭＶ的主要限制性片段与标准株ＡＤ１６９ＳＨ     

MGMT反义RNA真核表达载体的构建与鉴定

目的：探讨反义ＲＮＡ逆转胶质瘤细胞耐药的可能性，构建ＭＧＭＴ反义ＲＮＡ的真核表达载体。方法：以ＸｈｏⅠ和ＰｖｕⅡ双酶切质粒ｐＨＭ１４，回收１７８ｂｐ的片段，定向插入以ＨｐａⅠ和ＸｈｏⅠ双酶切ｐＬＸＳＮ所获得的线性化载体，构建针对ＭＧＭＴｍＲＮＡ５＇端的反义表达载体ｐＬａＭＴ５ＳＮ；以ＥｃｏＲⅠ单酶切ｐＨＭ１４，回收７７９ｂｐ的片段，插入以ＥｃｏＲⅠ单酶切ｐＬＸＳＮ并经ＣＩＡＰ去磷酸化的线性载体，构建针对ＭＧＭＴｍＲＮＡ全长序列的反义表达载体ｐＬａＭＴＳＮ。结果：ｐＬａＭＴ５ＳＮ经ＨｉｎｄⅢ酶切可见３７０ｂｐ的片段；ｐＬａＭＴＳＮ经ＰＣＲ扩增证明目的片段反向插入ｐＬＸＳＮ，鉴定结果表明构建成功。结论：成功构建了两个ＭＧＭＴ反义ＲＮＡ的真核表达载体，为研究ＭＧＭＴ反义ＲＮＡ逆转胶质瘤耐药细胞的耐药表型提供了良好的实验材料。     

人乳头瘤病毒HPV16L1-E7C重组腺病毒载体的构建

采用ＰＣＲ方法,从ＨＰＶ１６型野毒株质粒中分离出ＨＰＶ１６Ｌ１（５５５９７１５１ｂｐ）、ＨＰＶ１６Ｅ７Ｃ（６８２８５５ｂｐ）基因片段,采用ＰＣＲ产物的ＴＡ克隆法,将Ｌ１、Ｅ７Ｃ分别插入ｐＧＥＭＴＥａｓｙ载体,构建克隆载体ｐＴＡＬ１、ｐＴＡＥ７Ｃ。ＢａｍＨⅠ、ＨｉｎｄⅢ酶切ｐＴＡＥ７Ｃ,Ｂｇ１Ⅱ、ＣｌａⅠ酶切ｐＴＡＬ１,回收Ｌ１、Ｅ７Ｃ片段,利用ＢａｍＨⅠ、Ｂｇ１Ⅱ酶切产生相同粘末端的特点,产生Ｌ１Ｅ７Ｃ重组基因片段,将其克隆入质粒ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔｓｋ,构建了ｐＢＳＬ１Ｅ７Ｃ重组克隆质粒,ＨｉｎｄⅢ、ＸｈｏⅠ酶切ｐＢＳＬ１Ｅ７Ｃ,释放Ｌ１Ｅ７Ｃ基因片段,定向重组入ｐＣＡ１４腺病毒载体,成功构建真核表达载体ＨＰＶ１６Ｌ１Ｅ７Ｃ重组腺病毒载体：ｐＣＡ１４Ｌ１Ｅ７Ｃ,为研制ＨＰＶ１６Ｌ１Ｅ７Ｃ重组Ａｄ５载体疫苗和ＨＰＶ１６Ｌ１Ｅ７Ｃ嵌合蛋白疫苗打下基础