石蜡包埋组织中DNA甲基化特异性PCR技术

目的 以石蜡包埋组织提取的DNA为模板进行DNA甲基化特异性PCR(MSP)检测,研究其可行性.方法 35例石蜡包埋肺癌组织DNA样品制备和亚硫酸氢盐修饰后进行MSP扩增检测.结果 石蜡包埋组织MSP检出率与文献采用新鲜组织标本报道一致.结论 MSP通过选择合适的实验条件,可适用于石蜡包埋组织DNA甲基化分析.     

瘦素基因甲基化水平与妊娠期糖尿病的相关性

目的 分析妊娠期糖尿病(GDM)孕妇及糖耐量正常(NGT)孕妇瘦素及其基因启动子区甲基化的动态变化水平,以进一步探索妊娠期糖尿病发病机制.方法 采用放射免疫法检测45例(GDM组20例,NGT组25例)孕妇妊娠晚期血清瘦素水平;逆转录PCR(RT-PCR)及实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测两组孕妇胎盘组织中瘦素mRNA的表达,并进一步应用蛋白印迹法(Western blot)检测瘦素蛋白的表达.利用氧化亚硫酸盐测序法及亚硫酸盐测序法检测两组孕妇瘦素基因启动子区甲基化及羟甲基化水平.结果 GDM组孕妇妊娠晚期血清瘦素水平明显高于NGT组(P<0.05);GDM孕妇胎盘组织瘦素mRNA及瘦素蛋白表达水平高于NGT组;两组孕妇瘦素基因启动子区均发生甲基化及羟甲基化,GDM组甲基化水平高于NGT组(P<0.05);两组孕妇部分位点羟甲基化水平存在差异,但无统计学意义.结论 妊娠期糖尿病孕妇瘦素水平高于糖耐量正常孕妇.瘦素基因启动子区甲基化动态变化过程与妊娠期糖尿病的发病有一定相关性.     

Wnt6、Wnt3A、LEF1和FZD1基因启动子甲基化在结直肠癌筛查及早期诊断中的临床应用

目的探讨Wnt6、Wnt3A、LEF1和FZD1基因启动子甲基化在结直肠癌（CRC）筛查及早期诊断中的临床应用。方法选择收治的55例CRC患者为观察组，55例健康体检人群为对照组，分别取观察组CRC组织、术前血标本、术前粪便标本以及对照组正常结直肠组织、外周血样本、粪便标本，使用QIAGEN试剂盒提取结直肠组织基因组DNA以及血液、粪便中脱落细胞DNA，甲基化特异性PCR（MSP）法检测以上4种基因启动子甲基化情况；RT-PCR法检测mRNA水平，Western-blot法检测蛋白水平；进而比较两组受检者以上4种基因启动子甲基化阳性及基因表达情况。结果共提取组织、血液、粪便脱落细胞DNA110例，最终验证存在人基因组DNA并完成MSP110例。观察组粪便脱落细胞DNA中Wnt6、Wnt3A、LEF1和FZD1基因启动子甲基化阳性率分别为69.1%、63.6%、54.5%和56.4%，4种基因总甲基化阳性率为90.9%；对照组粪便脱落细胞DNA中Wnt6、Wnt3A、LEF1和FZD1基因启动子甲基化阳性率分别为0.0%、1.8%、0.0%和1.8%，4种基因总甲基化阳性率为3.6%。粪便脱落细胞DNA中Wnt6、Wnt3A、LEF1和FZD1基因启动子甲基化对21例Ⅰ~Ⅱ期CRC的发现率分别为80.9%,71.4%,57.1%和57.1%，联合检测4种基因启动子甲基化对Ⅰ~Ⅱ期CRC的发现率为90.5%。CRC患者粪便脱落细胞DNA中Wnt6、Wnt3A、LEF1和FZD1基因启动子甲基化与患者性别、年龄、远处转移、肿瘤部位、TNM分期及淋巴结转移均未见相关（均P＞0.05）。观察组与对照组结直肠组织、血标本、粪便标本中Wnt6、Wnt3A、LEF1和FZD1基因启动子甲基化阳性率比较，差异均有统计学意义（均P＜0.01）。两组受检者结直肠组织中Wnt6、Wnt3A、LEF1和FZD1基因启动子甲基化后的mRNA及蛋白水平均有所下调，观察组与对照组的电脉图差异明显。结论MSP法检测结直肠组织、血液及粪便脱落细胞DNA中Wnt6、Wnt3A、LEF1和FZD1基因启动子甲基化是CRC早期筛查的有效方法。     

DNA甲基化的分析与状态检测

DNA甲基化是指由甲基转移酶介导，以S-腺苷-L广甲硫氨酸为甲基供体，在胞嘧啶5位碳原子上加入一甲基基团，使之变成5甲基胞嘧啶的化学反应。DNA甲基化是最常见的复制后调节方式之一，在基因表达调控、发育调节、基因组印迹等方面发挥重要作用^[1]，与某些肿瘤和遗传病的发生密切相关^[2]。DNA甲基化的分析检测将成为相关肿瘤和遗传病的分子诊断手段。近年来，DNA甲基化检测技术有了很大的发展和完善。在此，按DNA甲基化检测的目的对DNA甲基化分析检测的技术方法的原理和特点作简要综述。     

组蛋白甲基化及其对肿瘤发生的影响

组蛋白甲基化是蛋白常见的翻译后修饰方式之一,在机体内甲基化修饰过程是可逆的,组蛋白甲基化、去甲基化与肿瘤的发生发展有着密切的关系,所以本文针对组蛋白甲基化及去甲基化以及各自对肿瘤细胞的作用予以综述.     

母体血浆中白细胞介素11 DNA甲基化和蛋白水平的检测及其临床意义

目的:检测孕妇血浆中甲基化白细胞介素11DNA(M-IL-11)和非甲基化IL-11DNA(U-IL-11)的表达水平及IL-11蛋白的含量,探讨其在临床中的应用价值。方法:选择早、中、晚期妊娠孕妇各60例,以非妊娠期妇女60例为阴性对照组。提取血浆中的游离DNA,用甲基化特异性PCR(MSP)方法检测各组血浆标本中M-IL-11和U-IL-11的表达水平,并采用ELISA的方法检测IL-11的水平,对妊娠组和对照组样本均数进行统计学分析。结果:非妊娠妇女血浆中未检测到U-IL-11,妊娠早期、中期、晚期及非妊娠妇女M-IL-11DNA浓度无显著性差异(P>0.05),而中期、晚期妊娠妇女U-IL-11的水平明显高于早期妊娠妇女(P<0.05)。IL-11水平在孕妇组显著升高,且随着孕周时间延长,其含量不断升高。结论:M-IL-11不是妊娠特异性标志物,U-IL-11可作为妊娠特异性标志物,IL-11的检测有助于扩大非创伤性产前诊断的临床应用范围。     

DNA甲基化芯片检测技术在恶性肿瘤诊疗中的应用

表观遗传学的改变普遍存在于各种恶性肿瘤中,DNA甲基化是表观遗传学改变的主要形式之一。DNA甲基化状态的改变可显著影响基因的表达,抑癌基因高甲基化及癌基因低甲基化是导致恶性肿瘤发生、发展的重要机制。因此,检测恶性肿瘤DNA甲基化状态的变化对于揭示其发病机制意义重大。近年来,DNA甲基化检测技术尤其是DNA甲基化芯片检测技术在恶性肿瘤发病机制、临床诊疗等方面得到越来越广泛的应用。     

死亡相关蛋白激酶基因启动子甲基化特异性PCR法的建立与初步应用

目的:建立甲基化特异性PCR(MSP)技术检测死亡相关蛋白激酶(DAPK)基因启动子甲基化.方法:设计针对DAPK基冈启动子的MSP引物,建立MSP检测体系对甲基化阳性模板进行检测,评价其特异性、重复性和灵敏性,并经测序鉴定.结果:所建市的甲基化MSP方法仅能扩增出甲基化阳性模板.不能扩增出未甲基化阳性模板和未硫化处理的DNA模板;对不同梯度稀释的甲基化阳性模板进行检测,其最大敏感性可达2%;在不同时间进行甲基化MSP检测的结果均一致.结论:成功建立的DAPK基因启动子甲基化MSP检测方法具有良好的特异性、灵敏性和重复性,可用于肿瘤标本的批量检测.     

DNA甲基化在肺癌诊疗中的应用价值

DNA甲基化是基因遗传信息改变的最重要因素,是表观遗传学的主要内容之一。DNA甲基化被认为是肿瘤形成的重要分子机制,是近年来肿瘤分子病因学的研究热点。研究发现DNA甲基化与肺癌的发生、发展密切相关。深入研究甲基化在肺癌进程中的作用机制,将为肺癌的诊断、治疗及预后提供新依据、新策略。该文就目前DNA甲基化在肺癌中的研究及应用进展予以综述。     

子宫颈部肿瘤中DNA甲基化转移酶-1表达和P16/MGMT基因启动子甲基化的临床意义

目的 探讨子宫颈部肿瘤中Dnmt-1（DNA甲基化转移酶-1）表达和P16／MGMT基因启动子甲基化的临床意义。方法 用MS—PCR．（Methylation Specific—PCR．）和免疫组织化学染色方法研究Dnmt-1蛋白和P16／MGMT基因启动子甲基化在117例子宫颈部良、恶性病变组织中的表达意义。结果 Dnmt-1在浸润性鳞状上皮癌和腺癌中的表达明显高于慢性宫颈炎和宫颈上皮内瘤变。P16／MGMT基因启动区在慢性宫颈炎中全部表现为非甲基化，而在宫颈上皮内瘤变、浸润性鳞状上皮癌和腺癌中则表现为很高的异常甲基化水平。在子宫颈腺癌中，P16／MGMT基因启动子甲基化率在Dnmt-1表达阳性组明显高于Dnmt-1表达阴性组。结论 Dnmt-1蛋白表达和P16／MGMT基因启动子甲基化在宫颈癌进展过程中的早期就起着非常重要的作用．而且Dnmt-1蛋白表达和P16／MGMT甲基化检测对于恶性肿瘤的诊断有着重要的辅助意义。     

DNA去甲基化药物研究现状

在肿瘤形成过程中,启动子区异常高甲基化的抑癌基因始终保持沉默、功能丧失,而启动子区去甲基化后抑癌基因则可以重新激活。因此,DNA去甲基化药物可治疗肿瘤。本文阐述了DNA甲基化与肿瘤的关系,以及DNA去甲基化药物的研究现状。     

DNA甲基化PCR引物的设计

DNA甲基化是哺乳类动物一个重要的基因外遗传信号。有研究表明,DNA甲基化与大多数肿瘤的发生相关,抑癌基因启动子CpG岛的高甲基化可引起抑癌基因表达沉默,细胞出现无节制生长,导致肿瘤的发生[1]。目前,甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MS-PCR)是研究DNA甲基化最为常用且准确度较高的方法之一,而理想的引物设计则是其成功的关键因素之一。国外互联网上有1个提供免费在线引物设计程序“MethPrimer”,它能够预测CpG岛,根据实验者要求设计硫化测序PCR(bisulfate-sequencing PCR,BSP)和甲基化特异性PCR(methylation-sp…     

G-CIMP表达在胶质瘤中的研究进展

胶质瘤起源于神经胶质细胞,以发病率高和预后差为特点。胶质瘤CPG岛甲基化表型(G-CIMP)作为DNA甲基化的一种,是近年新发现的一种表观遗传学改变,与胶质瘤的分子特征及临床特点均有关。本文就G-CIMP的发现、分子学特征、临床意义及展望展开综述。     

DNA甲基化在原发免疫性血小板减少症作用机制中的研究

原发免疫性血小板减少症(primary immune thrombocytopenia,ITP)是以血小板减少伴或不伴皮肤黏膜出血为主要临床表现的一组疾病[1],主要与体液及细胞免疫介导的血小板破坏过多、巨核细胞成熟障碍或血小板生成不足有关[2],目前其发病机制尚未完全明了.许多研究表明,DNA甲基化在ITP中起到一定作用[3].现就DNA甲基化在ITP作用机制中的研究作一综述,以期从表观遗传学的角度探讨ITP的发病机制,为ITP的防治提供新的理论依据.     

胞嘧啶甲基化的量子化学研究

用HMO法研究了甲基化对胞嘧啶结构的影响,结果表明甲基化对胞嘧啶结构参数无明显影响,从而引起对DNA甲基化作用有意义的新探讨。     

MSP法检测胃癌的PTEN基因甲基化改变

目的:检测胃癌中抑癌基因PTEN启动子区域甲基化状况,并探讨其甲基化改变的特点与临床病理特征的关系。方法:采用甲基化特异的PCR法(MSP)检测胃癌组织及相应癌旁组织(各35例)中PTEN启动子区域甲基化状态。结果:35例癌旁正常胃组织未发现有PTEN基因启动子的甲基化,16/35例胃癌组织检测到PTEN基因启动子的甲基化,癌组织PTEN基因启动子甲基化率显著增高(P<0.05)。有淋巴结转移的19例胃癌组织中,有12例PTEN基因启动子甲基化,有淋巴结转移的PTEN基因启动子甲基化显著高于无淋巴结转移组(P<0.05)。结论:PTEN基因启动子的甲基化与胃癌的发生、转移相关。甲基化特异的PCR法(MSP)是检测胃癌抑癌基因PTEN启动子区域甲基化状况的一种较新且特异的实验方法,可用于胃癌的辅助诊断和预后判断。     

联合检测粪便ECAD基因甲基化和隐血在结直肠癌诊断中的价值

目的 探讨粪便ECAD甲基化联合隐血在结直肠癌(CRC)中的诊断价值.方法 收集50例健康体检者、50例结直肠良性病变者、50例CRC患者的粪便标本.利用甲基化特异性PCR(MSP)的方法 检测粪便中ECAD基因的甲基化情况,根据肠镜病理诊断进行验证,比较粪便ECAD甲基化率、粪便潜血实验(FOBT)及两者联合对CRC诊断的敏感性及特异性,并进行统计学分析.结果 CRC患者粪便ECAD甲基化率(78%)明显高于健康体检者(16%)和结直肠良性病变者(26%);同时,CRC患者FOBT阳性率(64%)亦明显高于健康体检者(2%)和结直肠良性病变者(26%),差异有统计学意义(P<0.001).粪便ECAD甲基化率与CRC患者肿瘤数目(P=0.048)、病理分级(P=0.006)、TNM分级(P=0.002)及淋巴结转移(P=0.002)密切相关.CRC患者粪便FOBT敏感度为64%(95%CI:49.1%~76.7%),特异度为86%(95%CI:77.3%~91.9%);而ECAD敏感度为78%(95%CI:63.7%~88.0%),特异度为79%(95%CI:69.5%~86.2%).ROC曲线分析提示ECAD的ROC曲线下面积(AUC)为0.795(95%CI为0.716~0.874),略高于FOBT的AUC(0.750,95%CI:0.661~0.839),而两种联合的AUC为0.806(95%CI:0.728~0.884),诊断效能最高.结论 粪便ECAD基因甲基化的检测是早期诊断CRC的有效方法 ,其联合FOBT能有效提高诊断效能.     

地中海贫血的基因诊断及DNA甲基化转移酶在地中海贫血发病机制中作用的研究

目的 探讨DNA甲基化转移酶l、3a、3b在地中海贫血发病机制中的作用.方法 通过基因诊断检测确诊为地中海贫血患儿,采用实时荧光定量技术检测DNMT1、DNMT3a、DNMT3b在50例地中海贫血(以下简称地贫)患儿、35例正常儿童及32例非地贫贫血儿童中的表达.结果 (1)本研究50例地贫中,α-地中海贫血患儿9例,β-地中海贫血36例,αβ复合型地贫患儿5例,提示该地区β-地中海贫血的发生率高于α-地中海贫血.(2)对50例地中海贫血患儿、35例正常对照组儿童及32例非地贫贫血组儿童标本RT-PCR检测3种甲基化转移酶的表达,显示地中海贫血患儿中DNMT3a、DNMT3b的表达值明显高于正常对照组及非地贫贫血组(P＜0.05);DNMT1的表达与正常对照组及非地中海贫血贫血组相比,无显著性差异(P＞0.05).结论 地中海贫血基因诊断方法高效、准确、成熟可靠,可广泛推广于临床应用,DNA甲基化转移酶对于早期诊断地中海贫血有重要的参考价值,可作为早期诊断的有效指标.     

DNA甲基化与组蛋白修饰对克隆胚发育的影响

在正常的受精、发育过程中,基因组DNA不对称的去甲基化、重新甲基化以及组蛋白修饰作用发生在整个受精和胚胎发育过程中.本文将从DNA甲基化、DNA不对称的去甲基化和组蛋白修饰作用就其原理,相互之间的关系及其对胚胎发育情况的影响作以综述,并对近年来,DNA甲基化与组蛋白修饰作用在胚胎发育过程中的研究作以总结.     

DNA甲基化与胰腺癌关系的研究进展

胰腺癌是一种恶性程度高,进展迅速,预后极差的恶性肿瘤.国内外统计均显示其发病率呈不断上升趋势[1-3].但遗憾的是,目前对胰腺癌的发生及进展的分子生物学机制仍不十分清楚,尽管有文献报道称在胰腺病例中检测到重要基因的突变,以及突变后转录翻译的异常蛋白[4].但依据其提出的理论亦不能完全解释胰腺癌的发生及分化机制.因此,针对参与胰腺癌的准确的分子生物学机制进行有效的研究是迫切需要的.