表达甲型H5N1禽流感病毒结构蛋白的重组痘苗病毒的构建与鉴定

目的  构建表达甲型H5N1禽流感病毒（H5N1 avian influenza A virus,H5N1 AIAV）NIBRG14株结构蛋白的重组痘苗病毒,为研制新型人用流感疫苗奠定基础。方法  通过反转录PCR扩增H5N1 AIAV NIBRG14株的血凝素（hemagglutinin,HA）和神经氨酸酶（neuraminidase,NA）编码基因,并将改造的HA、NA基因克隆至痘苗病毒穿梭质粒 pSCCK。在重组质粒与痘苗病毒天坛株（vaccinia virus Tiantan,VTT）于Vero细胞中发生同源重组后,筛选同时表达HA和NA的重组痘苗病毒（rVTT-HA/NA）,并对其进行鉴定。结果  反转录PCR扩增的HA和NA基因大小约分别为1 700和1 400 bp,与预期相同。DNA测序证实,改造的HA和NA序列正确。对获得的rVTT-HA/NA进行PCR及测序表明,HA和NA基因正确插入VTT。蛋白质印迹显示,rVTT-HA/NA感染的Vero细胞表达的HA和NA能与相应的抗体发生反应。表达的HA具有血凝活性,血凝滴度为1∶32。结论  重组痘苗病毒rVTT-HA/NA可稳定表达H5N1 AIAV NIBRG14株的HA和NA。     

pcDNA3.1/hTSHR_(1043～1354 bp)重组体的构建及在中国仓鼠卵巢细胞中的表达

目的构建重组体pcDNA3.1/hTSHR1043～1354bp及在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)表达hTSHR膜外区氨基酸314～418蛋白分子。方法提取人正常甲状腺组织总RNA,反转录后进行聚合酶链反应(PCR),将纯化的扩增产物hTSHR1043～1354bp与表达载体pcDNA3.1连接后转化TOP10E.coli感受态菌。经PCR、HindⅢ酶切和核苷酸序列测定方法鉴定插入序列和方向正确的重组质粒转染CHO细胞,并用Westernblot方法鉴定表达的蛋白。结果PCR扩增得到hTSHR膜外区C端312bp的基因片段hTSHR1043～1354bp。该片段与表达载体pcDNA3.1的连接后转化TOP10E.coli感受态菌。重组质粒经PCR、HindⅢ酶切和核苷酸序列测定方法鉴定证实hTSHR1043～1354bp片段插入序列和方向正确。重组质粒转染的CHO细胞裂解液经Westernblot可以检测出15900的蛋白条带,与预期的蛋白相对分子质量相符。结论成功构建了重组体pcDNA3.1/hTSHR1043～1354bp,其转染CHO细胞后表达159000的目的蛋白(hTSHR氨基酸314～418蛋白片段)。     

人甲状腺过氧化物酶膜外区基因的克隆及其杆状病毒表达载体的构建

摘要 目的：尝试克隆人甲状腺过氧化物酶（hTPO）膜外区基因并构建其杆状病毒表达载体,为其在昆虫细胞中的表达打好基础。方法：PCR扩增hTPO膜外区基因,并将其先后重组入pGEM3zf(+)质粒和pFastBac1质粒,以hTPO-pFastBAC1质粒转染E.coli DH10Bac大肠杆菌,获得重组hTPO杆状病毒表达载体（hTPO-Bacmid）,分别以多种方法鉴定其正确性。结果：经PCR及酶切、基因测序等方法证实得到的重组hTPO-pGEM3zf(+)质粒、hTPO-pFastBAC1质粒和hTPO-Bacmid均与预期相符。结论：成功的克隆了hTPO膜外区基因,并将其正确重组入pGEM3zf(+)质粒和pFastBac1质粒,后者经位点特异性转座整合至Bacmid,成功的构建了重组hTPO杆状病毒表达载体,为进一步实现hTPO在昆虫细胞中的真核表达作好了准备。     

Bac-to-Bac杆状病毒表达系统在BHK细胞表达鼠IL-2蛋白的研究

目的:利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统在BHK细胞表达重组鼠白细胞介素(IL)-2蛋白。方法:用Flag标记鼠IL-2并加入真核细胞启动子CMV,构建重组质粒pFB-CMV-IL-2并予酶切和PCR鉴定;将鼠IL-2克隆入杆状病毒表达载体pFastBacDual中,将pFB-CMV-IL-2转化到含杆状病毒穿梭载体Bacmid的DH10Bac感受态菌中,筛选阳性克隆,获得重组杆状病毒载体Bacmid-pFB-CMV-IL-2,抽提质粒;用脂质体转染法将Bacmid-pFB-CMV-IL-2转染Sf9昆虫细胞包装病毒,收获重组杆状病毒,将构建病毒转导BHK细胞培养,用Western blot检测IL-2蛋白。结果:通过杆状病毒表达系统,在BHK细胞成功表达重组的鼠IL-2蛋白。结论:重组杆状病毒在真核细胞中成功表达重组鼠IL-2蛋白。     

天蚕抗菌肽AD基因在AcNPV载体系统中的表达研究

目的 研究利用昆虫杆状病毒载体系统在昆虫培养细胞和虫体中高效表达新型多肽抗生素天蚕抗菌肽AD(cecropinAD，CAD)。方法 采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)点突变技术改造CAD基因，改造后的CAD基因先克隆到质粒pGEM—T easy vector中进行鉴定和序列分析，然后再亚克隆到苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus，AcNPV)表达载体pAcGP67B中，获得重组病毒载体pAcAD。用重组病毒载体pAcAD和野生AcNPVDNA共感染草地夜蛾(Spodoptera frugiperdoda)Sf9细胞，经空斑法筛选得到重组病毒AcNPVAD。重组病毒AcNPVAD经PCR扩增签定，证实了CAD基因已经整合到重组病毒AcNPVAD中。结果 以AcNPVAD转染Sf9细胞和苜蓿丫纹夜蛾幼虫，抑菌活性试验证实CAD基因在昆虫培养细胞Sf9和苜蓿丫纹夜蛾幼虫虫体中均得到表达，表达产物具有抑菌作用。通过离子交换层析，杂蛋白基本去除，重组抗菌肽获得初步纯化，重组抗菌肽活性峰位于0．75mol/L处。结论 CAD基因在昆虫杆状病毒载体系统获得了表达，表达产物具有抑菌活性。     

乙型肝炎病毒核心抗原HBcAg基因重组杆状病毒的构建及鉴定

目的利用杆状病毒表达系统（BEVS）构建含乙型肝炎病毒核心抗原（HBcAg）基因的重组杆状病毒。方法采用PCR法从含乙型肝炎病毒全基因序列（adw）的质粒pHBV1中扩增出HBVC基因,亚克隆到pGEM-T载体,然后将HBVC基因插入载体pAcGHLT-A中,构建含有HBVC基因的重组质粒pAcGHLT-HBcAg,与苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（AcNPV）联合转染秋粘虫细胞（Sf9）,获得含有HBVC基因的重组杆状病毒。采用限制性内切酶酶切和DNA序列分析对重组病毒进行鉴定。结果利用杆状病毒表达系统,成功地构建了含HBVc基因的重组杆状病毒,感染昆虫细胞Sf9后,PCR检测可以扩增出相应大小的片段。结论利用BEVS成功构建了含有HBVC基因的重组杆状病毒,为进一步的研究奠定了基础。     

人穿孔素在杆状病毒中的克隆和表达

穿孔素是机体免疫系统中具有免疫杀伤作用的一种重要效应物质,由于昆虫杆状病毒表达系统和原核表达系统相比能对表达产物进行翻译后加工,所以选择昆虫细胞真核表达人穿孔素,交人穿孔素基因插入杆状病毒转移载体pAcSecG2T中和野生昆虫杆状病毒共转染 sf9细胞,筛选得重组病毒,在sf9细胞中分泌表达含凝血酶位点的GST－hp融合蛋白,产物呈现钙依赖的溶红细胞活性,并且经Dot-Blot检测表明具有免疫活性。     

Q型人血清对氧磷酶在杆状病毒感染的昆虫细胞中的表达

目的　研究对氧磷酶与心血管疾病的关系。方法　采用BAC TO BAC杆状病毒系统表达Q型人血清对氧磷酶 (PON 1) ,在已获得人PON 1全长cDNA的基础上 ,通过PCR扩增 ,得到上游含EcoRⅠ酶切位点 ,下游不含终止密码子而含HindⅢ酶切位点的PON 1基因 ,将其克隆到带有 6×His·Tag的pFASTBACⅡCD14质粒中 ,构建杆状病毒转移载体pFASTBACⅡ PON 1。将含有PON 1基因的重组质粒pFASTBACⅡ PON 1转化DH10BAC感受态细胞 ,使目的基因通过同源重组插入BacmidDNA中。PCR鉴定正确后再转染入sf9昆虫细胞中 ,产生有感染力的重组杆状病毒。用乙酸苯酯为底物测定表达上清液中的酶活性。结果　比较不同感染复数(MOI)和不同感染时间PON 1在培养上清液中的表达情况 ,确定感染复数MOI为 6～ 8,感染时间 96～10 8h为PON 1的最佳表达条件 ,产率约为 4 .5mg·L- 1上清液。免疫印迹法表明重组蛋白有与抗 6×His单克隆抗体结合的抗原性。顺磁共振实验证明 ,基因工程产人重组血清对氧磷酶rhPON 1能有效清除Fe2 +诱导亚油酸脂质过氧化产生的脂质自由基 ,清除率为 5 5 .9%。结论　BAC TO BAC杆状病毒介导的草地贪夜蛾昆虫细胞sf9可高效表达Q型人血清对氧磷酶     

在Sf9昆虫细胞-杆状病毒系统中表达毒蕈碱型M_2及M_5受体重组突变体

目的为乙酰胆碱毒蕈碱(M)受体亚型特异性的变构调节剂及基因工程的研究提供实验平台。方法用PCR及搭桥PCR法对乙酰胆碱M2及M5受体作以下突变:①将N-糖基化位点Asp突变为Asn;②删除对蛋白酶敏感的M受体的第三个细胞内环;③在C端添加凝血酶识别位点(CMV)和6-His标记。将PCR扩增出重组嵌合蛋白基因亚克隆到杆状病毒转移载体,制备重组杆状病毒并感染昆虫细胞表达M2/M5受体蛋白。Western印迹及放射性配体受体结合实验验证受体的正确表达及功能。结果通过搭桥PCR,成功扩增出1018 bp的重组M2受体和1041 bp重组M5受体核酸序列;使用pUC/M13的扩增引物成功构建M2/M5重组转移载体。将重组载体质粒与线性化病毒DNA共转染昆虫细胞Sf9,制备重组杆状病毒并感染昆虫细胞,见细胞空泡样病变。Western印迹分析确定重组杆状病毒感染昆虫细胞M2/M5蛋白表达,放射性配体受体饱和实验结果表明,表达的重组受体蛋白与[3H]N-甲基-东莨菪碱具有特异性结合能力。结论 Sf9昆虫细胞能够表达M2及M5重组受体蛋白,M2及M5重组受体蛋白的病毒样颗粒可用于M受体的新药研究。     

HIV-1 Gag-gp120嵌合基因在重组杆状病毒系统中的嵌合表达

将中国株HIV-1B亚型gag基因序列克隆到杆状病毒表达载体pFASTBAC1中,将gp120基因以相同的读框克隆到gag基因的3／端下游,构建了重组表达质粒pFge,利用大肠杆菌埃希菌杆状病毒表达系统筛选重组杆状病毒,在昆虫细胞sf9中表达了HIV-1的Gag-gp120嵌合蛋白。     

人 IL-2与 HBsAg融合基因重组卡介苗的构建与鉴定

目的构建人IL-2与HBsAg融合基因并转化到BCG中构建重组BCG(recombinant BCG,rBCG),为制备治疗和预防乙型肝炎和结核病的二联疫苗奠定基础。方法以IL-2 pMalLP质粒和HBsAg pMalLP质粒为模板,设计引物,利用PCR技术扩增HBsAg和IL-2基因,进行重叠PCR获得融合基因IL-2-HBsAg并纯化,将融合基因克隆至穿梭表达载体pMV261得到重组质粒,电转化导入BCG感受态细胞,以蛋白质印迹法检测融合基因在rBCG中的表达。结果 PCR扩增得到IL-2和HBsAg,通过重叠PCR获得IL-2-HBsAg融合基因后成功插入穿梭表达载体,rBCG能表达融合蛋白。结论构建人IL-2与HBsAg融合基因重组质粒并导入BCG,获得了稳定表达融合蛋白的rBCG。     

乙型流感疫苗生产用毒株NYMCBX-51B主要抗原的基因特征及传代稳定性研究

目的 了解2013年流感疫苗生产用乙型病毒株NYMC BX-51B主要抗原血凝素(hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(neuraminidase,NA)的基因特征,并研究该疫苗株的传代稳定性.方法 对制备的乙型流感病毒株主种子批、工作种子批及收获液病毒进行全面的生物学特性检定.采用逆转录-PCR法从主种子批、工作种子批及疫苗病毒收获液中扩增HA及NA基因片段,并进行全基因序列测定及分析.对7株不同年份的乙型疫苗株及野毒株的HA氨基酸序列进行比对,绘制氨基酸种系发生树.结果 该毒株主种子批和工作种子批的抗原性与WHO2013年推荐的毒株一致,种子批和收获液病毒的生物学特性均符合我国2010年版药典标准.HA基因序列长度为1 755 bp,编码584个氨基酸;NA基因序列长度为1 401 bp,编码466个氨基酸.各代次流感病毒HA和NA的基因核苷酸和氨基酸序列均相同,与GenBank发布的序列完全一致,同源性为100％.2013年乙型疫苗株的HA氨基酸序列与2010和2012年相比,同源性分别为94.3％和98.4％.结论 2013年乙型流感疫苗株NYMCBX-51B主要抗原基因传代稳定,一般生物学特性符合我国药典要求.2013年疫苗株的HA氨基酸序列与2010年相比进化距离较远.     

Immune responses of chickens inoculated with a recombinant fowlpox vaccine coexpressing HA of H9N2 avain influenza virus and chicken IL-18

Control of the circulation of H9N2 avian influenza virus (AIV) is a major concern for both animal and public health, and H9N2 AIV poses a major threat to the chicken industry worldwide. Here, we developed a recombinant fowlpox virus (rFPV-HA) expressing the haemagglutinin (HA) gene of the A/CH/JY/1/05 (H9N2) influenza virus and a recombinant fowlpox virus (rFPV-HA/IL18) expressing the HA gene and chicken interleukin-18 (IL-18) gene. Recombinant plasmid pSY-HA/IL18 was constructed by cloning chicken IL-18 expression cassette into recombinant plasmid pSY-HA containing the HA gene. Two rFPVs were generated by transfecting two recombinant plasmids into the chicken embryo fibroblast cells pre-infected with S-FPV-017, and assessed for their immunological efficacy on one-day-old White Leghorn specific-pathogen-free chickens challenged with the A/CH/JY/1/05 (H9N2) strain. There was a significant difference in HI antibody levels (P < 0.05) elicited by either rFPV-HA or rFPV-HA/IL18. The level of splenocyte proliferation response in the rFPV-HA/IL18-vaccinated group was significantly higher (P < 0.05) than that in the rFPV-HA group. After challenge with 10^6.5 ELD₅₀ H9N2 AIV 43 days after immunization, rFPVs vaccinated groups could prevent virus shedding and replication in multiple organs in response to H9N2 AIV infection, and rFPV-HA/IL18 vaccinated group had better inhibition of viruses than rFPV-HA vaccinated group. Our results show that the protective efficacy of the rFPV-HA vaccine could be enhanced significantly by simultaneous expression of IL-18.     

刀额新对虾精氨酸激酶基因的克隆与真核表达

目的克隆刀额新对虾精氨酸激酶的基因并进行真核表达。方法提取刀额新对虾总RNA,经逆转录获得精氨酸激酶的cDNA,插入质粒pPIC9K构建重组真核表达质粒,转化毕赤酵母进行诱导表达,用SDS-PAGE和斑点免疫分析鉴定重组表达产物。结果逆转录获得的精氨酸激酶cDNA全长1071bp,DNA序列分析结果与GenBank收录的序列(EU497674)比较,同源性为99.5%;重组表达质粒转化酵母的表达产物经SDS-PAGE分析,其相对分子质量约40kD;表达产物与虾过敏者血清呈较强反应性。结论克隆得到刀额新对虾的精氨酸激酶基因并获得其重组真核表达产物,为进一步研制虾类食物过敏症的相关检测试剂提供了试验依据。     

C端截短的乙型肝炎病毒核心抗原的原核表达及免疫原性

 目的   原核表达C端截短的乙型肝炎病毒核心抗原（hepatitis B virus core antigen,HBcAg）〔HBcAg(aa 1-149）〕,并研究其在小鼠中的免疫原性。方法   用聚合酶链反应扩增C端截去34个氨基酸的HBcAg基因片段,构建含HBcAg（aa 1-149）基因的克隆质粒及表达质粒,在大肠杆菌Rossatta2中以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导重组蛋白的表达。表达产物经Ni²⁺亲和层析柱纯化后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、蛋白质印迹法鉴定。将纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,用ELISA法检测血清抗-HBc水平。结果   重组原核表达质粒pET15b HBcAg(aa 1-149)经双酶切和SDS-PAGE鉴定证明构建正确。重组HBcAg（aa 1-149）在大肠杆菌中获得高效表达,表达形式主要为可溶性蛋白。蛋白质印迹法显示在预期位置（相对分子质量约17 000位置）出现特异性条带。纯化后的重组蛋白纯度较高（＞90%）,并可在小鼠中诱生较高水平的抗-HBc。结论   重组HBcAg（aa 1-149）在原核系统中获得成功表达,并可在小鼠中诱导抗体应答。     

利用RTS500系统进行抗菌肽葛佬素蛋白的体外表达

目的:构建含目的基因葛佬素(gloverin)的重组子并通过体外快速翻译系统RTS500(rapid translation system)对其进行表达.方法:采用PCR方法扩增葛佬素cDNA,将其与表达载体pIVEX2.3连接;采用PCR及双酶切方法鉴定连接产物.将含目的基因片段的阳性重组质粒通过体外表达翻译系统RTS500,使其蛋白能在大肠杆菌(E.coli)裂解产物中进行表达.应用蛋白免疫印迹方法对表达产物进行鉴定.结果:pIVEX2.3-G重组表达质粒通过体外表达翻译系统RTS500可表达出分子量约为14.4的蛋白;蛋白免疫印迹证实该蛋白为带有多聚组氨酸标签的融合蛋白.结论:抗菌肽葛佬素可在体外大肠杆菌裂解产物中进行表达.     

甲型流感病毒核蛋白基因的真核质粒的构建及其表达

目的构建甲型流感病毒MPR／8／34（H1N1）核蛋白（nucleoprotein,NP）基因的真核表达载体,转染Hela细胞,并用甲型流感病毒检测试剂盒（nuARapidTestKit）检测其表达情况。方法用特异引物从甲型流感病毒cDNA中采用PCR技术克隆出NP基因,将其插入到真核表达质粒pcDNA3．1（＋）。酶切、PCR、测序鉴定后,构建好的pcDNA3．1（＋）／NP用脂质体转染法转染到Hela细胞,通过甲型流感病毒检测试剂盒检测其蛋白表达。结果克隆出一个核苷酸长度为1432bp的基因。和A／PR／8／34（H1N1）（GenBank／NCB,GI：8486129）有98％的同源性,转染Hela细胞后用甲型流感病毒检测试剂盒检测到24h、48h、72h细胞内外的蛋白表达。结论成功构建甲型流感病毒A／PR／8／34（H1N1）核蛋白基因的真核表达质粒,为进一步研究理化因素对该基因的影响、基因的结构和功能打下良好的基础。