细胞凋亡显像剂99mTc-膜联蛋白Ⅴ的制备与体内分布

将本室改造的毕赤酵母接入100ml BMGY培养基培养24h,离心收集酵母细胞并重悬于100ml BMMY培养基,每12小时加入终浓度为0.5%甲醇诱导表达具有内在金属螯合位点的突变型人膜联蛋白V。48h后离心沉淀培养基,获得的上清经硫酸氨沉淀、分子筛分离纯化蛋白;SDS-PAGE鉴定其相对分子质量     

甘油对毕赤酵母高密度发酵表达重组水蛭素Ⅱ的影响

目的：考察甘油对毕赤酵母生长和重组水蛭素Ⅱ表达的影响。方法：在摇瓶和IOL发酵罐中用含有不同浓度甘油的培养基培养毕赤酵母，测定毕赤酵母的生长和重组水蛭素Ⅱ的表达。结果：发酵培养基中初始甘油浓度为5g／L时，毕赤酵母生长速度明显加快；补料过程中甘油浓度大于70g／L时，毕赤酵母生长受到抑制。与不加甘油相比较，诱导表达期维持培养基中甘油浓度在5g/L以下，重组水蛭素表达可提前4h，诱导30h其活性达13000 ATU／ml，比仅用甲醇诱导时效价提高了7．7％。结论：降低初始培养基中甘油浓度有利于毕赤酵母生长，补料过程中培养基甘油浓度应维持在押制毕赤酵母生长的浓度之下，诱导阶段培养基中少量的甘油有利于水蛭素的表达.     

人膜联蛋白V二聚体的制备研究

目的 制备人膜联蛋白V二聚体,为其药理作用研究创造条件.方法 人膜联蛋白V基因转化毕赤酵母获得的转基因酵母用于本实验.在BMGY培养基中培养转基因酵母,在BMMY培养基中诱导人膜联蛋白V的分泌表达.通过硫酸铵沉淀、分子筛分离、超滤浓缩等纯化步骤序列处理BMMY培养基上清,用SDS-PAGE分析人膜联蛋白V形成二聚体的变化.结果 BMMY培养基诱导转基冈酵母2天后获得人膜联蛋白V,培养基上清经过硫酸铵沉淀、分子筛分离、超滤浓缩等纯化步骤序列处理后制备人膜联蛋白V二聚体.结论 本实验室制备出人膜联蛋白V二聚体,其药理作用有待进一步研究.     

SCAP/SREBP2/LDLr通路在LPS诱导人血管平滑肌细胞泡沫化中的作用

目的：研究炎症介质——脂多糖（LPS）是否通过扰乱固醇调节元件结合蛋白裂解激活蛋白-固醇调节元件结合蛋白2（SCAP-SREBP2）复合物介导的低密度脂蛋白受体（LDLr）负反馈调控,增加人血管平滑肌细胞对天然低密度脂蛋白胆固醇（LDL）摄取,导致泡沫细胞形成。方法：人血管平滑肌细胞在无血清培养基中培养24 h后,分为对照组（继续无血清培养）;高脂组（加入LDL负荷,终浓度为25μg/ml）;高脂加LPS组（加入LDL负荷,终浓度为25μg/ml,同时加入LPS,终浓度400 ng/ml）;高脂加LPS加肝素组（加入LDL负荷,终浓度为25μg/ml,加入LPS,终浓度400 ng/ml,加入肝素,终浓度5 mg/ml）,以上各组细胞培养24 h后收获。酶化学法检测细胞内胆固醇浓度,油红O染色法检测细胞内脂质水平,Real time PCR法检测LDLr、SREBP2表达水平,细胞免疫化学法检测SCAP蛋白表达,激光共聚焦检测SCAP在内质网与高尔基体间的转位情况。结果：细胞内胆固醇测定及油红O染色发现,LPS通过增加人血管平滑肌细胞对非修饰LDL摄取,导致人血管平滑肌细胞转变为泡沫细胞。在LPS不存在时,25μg/ml LDL减少LDLr mRNA水平（P〈0.05）。然而,LPS增加LDLr mRNA水平,逆转25μg/ml LDL对LDLr的抑制效应,不恰当的增加了血管平滑肌细胞对LDL摄取（P〈0.05）,LPS刺激也导致了SCAP蛋白表达增加和SREBP2的mRNA水平升高（P〈0.05）,同时促进了SCAP从内质网转移到高尔基体。这些结果提示LPS通过增加SCAP/SREBP2复合物从内质网到高尔基体转位,干扰了胆固醇介导的LDLr负反馈调控,使非修饰LDL在血管平滑肌细胞内堆积,导致泡沫细胞形成。结论：本研究提示,在LPS刺激条件下,SCAP/SREBP2/LDLr通路可能是血管平滑肌细胞泡沫化的另一条通路。     

激光共聚焦镜下观察天花粉蛋白进入瘤细胞的动态过程

目的:观察FITC标记的天花粉蛋白(TCS)进入瘤细胞的过程。方法:通过低温离心、丙酮分级沉淀、等电点沉淀及透析技术由新鲜栝楼根原汁中提取TCS;用FITC标记TCS,在激光共聚焦显微镜下动态观察FITC-TCS进入瘤细胞的过程。结果:纯化的蛋白经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析为单一带,且与标准TCS泳率相同;终浓度50μg/ml FITC-TCS的孵育3h时已经进入黑色素瘤B-16细胞,6h时FITC-TCS进入细胞量达到最高,12h时已轻度下降,组间差异有统计学意义(P<0.01)。FITC-TCS组与对照组(FITC-BSA)荧光强度差异有统计学意义(P<0.01)。结论:采用FITC-TCS,可在激光共聚焦显微镜下观察到进入瘤细胞的动态过程。     

从感染鼠脑浓缩提纯流行性乙型脑炎病毒的研究

本文用硫酸鱼精蛋白沉淀、差速离心、蔗糖线状梯度速率区带离心法从感染鼠脑中浓缩提纯JEV。鱼精蛋白最终浓度在5mg/ml、pH8.0时,一次可沉淀57％的杂蛋白,HA回收66％,感染性回收55％。再经差速离心及蔗糖梯度离心后,病毒区带蛋白含量0.5mg/ml,最终HA回收29％,感染性回收37％,因此提纯系数分别为138和175。在梯度柱的顶部发现有SHA,不具有感染性,其免疫学方面的特征尚待研究。     

抗前列腺癌多肽的可溶性表达及纯化

目的:探讨抗前列腺癌多肽的可溶性融合蛋白的表达条件,并获得其纯化蛋白,为后续的体内、外活性实验奠定基础。方法:采用Phamacia公司商品化的GST融合表达载体pGEX-4T-2,向细菌培养基中加入IPTG后,诱导Ptac启动子下游的外源目的基因表达。通过对不同培养基、不同温度、不同诱导时间及不同诱导剂浓度下可溶性目的蛋白的表达量进行探索,筛选出表达量最高的组合方式,并通过GST亲合层析柱GSTrap FF对获得的可溶性蛋白进行纯化。结果:成功进行了GST-APP216融合蛋白的可溶性表达,在IPTG浓度为0.2 mmol/L,27℃条件下,诱导表达4.5h时表达量最高。经凝胶成像系统进行密度扫描显示,该可溶性蛋白的表达量约占上清总蛋白量的36.2%。并获得了纯化的APP216蛋白,经紫外分光光度计测定标准品,绘制标准曲线。测定260/280nm处吸光度的比值,得到纯化蛋白的浓度为323.1μg/ml。结论:APP216纯化蛋白的获得,为进一步检测抗前列腺癌多肽体外、体内的肿瘤杀伤作用奠定了坚实的实验基础。     

重组人IL-8在大肠杆菌中的表达及纯化工艺的优化

目的优化重组人IL-8（rhIL-8）大肠杆菌表达及纯化工艺，以便获得高纯度的重组蛋白。方法将已构建好的表达载体转化大肠杆菌HB101，经3-吲哚丙烯酸诱导，在发酵罐中进行表达，比较不同诱导剂浓度、温度、pH值及时间，以获得最佳表达工艺参数。离心收集菌体，超声破壁，收集包涵体和胞浆，其中包涵体经变性、复性处理，与包浆部分合并，经肝素亲和层析柱、阳离子交换柱和凝胶层析柱分离纯化，比较不同的洗脱条件，得到纯品，并对重组蛋白的纯度和生物学活性进行鉴定。结果用大肠杆菌HB101在发酵罐中表达rhIL-8，在30℃、pH为7．0的条件下加入50mmol／L 3-吲哚丙烯酸，诱导28h，得到约为100mg／ml的高表达，其分泌的重组蛋白以包涵体和胞浆的形式存在，经三步层析纯化后，得到高纯度的rhIL-8（纯度〉95％），经中性粒细胞趋化实验证实，所获IL-8具有良好的趋化白细胞迁移的作用。结论建立高效表达rhIL-8的原核表达和纯化工艺，所获的纯化IL-8具有良好的生物学活性。     

空气干燥法制备阴道毛滴虫染色体标本

阴道毛滴虫染色体数目及染色体核型分析,国内尚未见报道。本文采用空气干燥法制备阴道毛滴虫染色体的标本,效果良好,现报告如下。从患者阴道后穹隆拭取分泌物,接种于肝浸汤培养基中(内含10％小牛血清,100u/ml青霉素,链霉素100μg/ml),37℃孵育48—72h。收获前1.5h加入秋水仙素(最终浓度     

缺氧预适应小鼠脑匀浆提取液增强分化PC12细胞缺氧耐受性的最适浓度研究

目的:探索缺氧预适应小鼠脑匀浆提取液(Brain tissue extract of hypoxia-preconditioned mice,BHP)对NGF诱导分化的PC12细胞缺氧耐受性的影响及保护性作用的适合浓度.方法:复制小鼠急性重复缺氧模型,制备BHP,用考马斯亮蓝法定量蛋白.在分化PC12细胞中加入BHP使其蛋白终浓度分别为1.0、10.0、100.0ìg/ml(BHP组).以等蛋白终浓度正常小鼠脑匀浆提取液(Brain tissue extract of normal mice,BN)作为对照组(BN组).同时设置只加PBS的溶剂对照组(PBS组).缺氧(2%O2)培养24、48、72h后,采用回唑盐(MTT)比色法检测各组细胞活力(OD570nm值)和乳酸脱氢酶(LDH)透出率、缺氧72h晚期凋亡率.结果:缺氧24h时,蛋白终浓度为10.0、100.0ìg/ml的BHP组OD570nm值显著高于同浓度BN组和缺氧PBS组,其LDH透出率显著低于同浓度BN组和缺氧PBS组.随缺氧时间延长,其保护作用逐渐减弱.至缺氧72h时,仅蛋白终浓度为100.0ìg/ml的BHP组OD570nm值显著高于同浓度BN组,其LDH透出率、晚期凋亡率均显著低于缺氧PBS组.结论:BHP对分化PC12细胞缺氧耐受性的增强作用有浓度依赖性和时间依赖性,蛋白终浓度为100.0ìg/ml的BHP组保护作用稳定、持久.     

方格星虫多糖抗菌活性的初步研究

目的研究方格星虫多糖的抗菌活性。方法以方格星虫体壁作为试验材料，经沸水抽提、乙醇沉淀和sevage法去蛋白后得到粗多糖，再经G-50葡聚糖凝胶柱层析纯化。采用硫酸-苯酚法测定多糖的含量，以含不同浓度的方格星虫多糖（50，37．5，25，12。5mg／ml）培养基，分别接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和枯草杆菌培养12、24、36、48h，观察并记录其生长情况。结果不同方格星虫多糖浓度（25—50rag／ml）对三种试验菌的生长均有抑制作用，浓度越高抗菌活性越强。结论方格星虫多糖对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌埃希菌、枯草杆菌有明显的抗菌活性。     

一种简易的提纯甲状腺过氧化物酶的方法

1　材料和方法1 1　材料　 (1 )甲状腺组织　由锦州肉联场提供 ;(2 )仪器5 5P - 7型日立牌分离用超速离心机 ;HSC - 2 0RB型低温高速离心机 ;(3)试剂均为国产分析纯试剂。1 2　方法1 2 1　聚乙二醇提纯TPO　将甲状腺组织 (3ml g)制成匀浆。 2 0 0 0g离心 1 0min ,取上清液 ,加入 5 0 %聚乙二醇 -1 2 0 0 0至终浓度 8 5 % ,以 1 0 0 0 0 g离心 2 0min ,弃去上清液 ,沉淀部分悬浮 ,再加入 5 0 %聚乙二醇至终浓度为 8 5 % ,重复离心后 ,即得到富含TPO的微粒体部分。1 2 2　超速离心法提纯TPO　按上述方法制成甲状腺组织匀浆后 ,2 0…     

光动力疗法诱导Hela细胞凋亡的实验研究

1 一般资料 1．1准备工作：细胞复苏、培养、传代、冻存：人宫颈癌细胞系Hela为贴壁细胞，从液氮中取出冻存的细胞后立即置于37℃水浴中融解。1000r／min离心5分钟，弃上清后加入RP—M11640培养基离心洗涤1次。加入含10％小牛血清的RP—M11640培养基5ml悬浮起细胞后置于25ml细胞培养瓶中，     

中华麦饭石对真菌生长的抑制作用

<正> 菌株:本实验室保存的白色念珠菌,新型隐球菌。 含不同浓度麦饭石的沙氏液体培养基:称取中华麦饭石(简称CMS)200目粉剂20g,加于100ml蒸馏水中,隔水煮沸2h后室温过夜,次日取上清,做为100％麦饭石水。配制含麦饭石浓度为0％(对照)、10％、20％ 50％、100％的沙氏液体培养基。     

Annexin32的酵母表达及免疫原性分析

目的：在毕赤酵母中表达Annexin32并研究其功能。方法：用G418法快速筛选出的9个高拷贝转化子，经平板培养法（MD和MM）及PCR鉴定表型后，分别在BMMY、BMM、MM3种培养基中以甲醇诱导表达，培养上清行SDS－PAGE和Western印迹鉴定，用（NH4）2SO4＋PI法沉淀，过FPLC－Superdex75分子筛纯化蛋白并以此免疫小鼠。结果：有两个表型为Mut^a的高拷贝转化菌表达量较高，以BMMY为优，表达产物有两条带，相对分子质量分别约为3.8万和4万，占分泌总蛋白的80％以上，产物浓度为200－350mg/L。Western印迹证实两条表达产物均具有天然Annexin32分子的免疫原性。动物实验证明，酵母表达的Annexin32的免疫原性明显高于原核表达者。结论：在毕赤酵母中成功表达了Annexin32，为进一步研究打下了基础。     

常用化学试剂对Taq酶活性的影响

探讨用表面活性剂煮沸裂解结核杆菌（TB）快速提取DNA及在PCR试刑中加入一定浓度的表面活性剂和防腐剂后对Taq酶活性的影响程度．结果表明1％TritionX－100、1％Tween－20裂解TB后的残留部分对Taq酶活性无影响．我们用50ml1％TritionX－100或1％Tween－20与1ml临床标本混合后煮沸10分钟可有效裂解TB而获得阳性结果．但在PCR反应液中终浓度为1％TritionX－100、0．5％SDS、1％NP40、1％Tween－20、1／10000叠氮钠、1／1000甲醛对Taq酶有抑制作用，终浓度为5％甘油、1／10000硫柳汞、1／1000苯甲酸钠对Taq酶活性无影响．这对于分析PCR在出现假阴性及PCR试剂保存等方面都有一定意义．     

764-3和博莱霉素A_6对大鼠肺泡巨噬细胞表面纤维粘连蛋白的影响(论著摘要)

应用间接免疫荧光法观察测定离体大鼠正常肺泡巨噬细胞和博莱霉素A_6(BLM A_6)作用的肺泡巨噬细胞表面纤维粘连蛋白的荧光强度的变化以及活血化瘀类中药通脉灵单体764-3对上述处理细胞的影响。动物选用雄性Wista大鼠作为肺泡巨噬细胞供体,采用原位肺泡支气管灌流技术获得肺泡巨噬细胞并经贴壁进行纯化。用含10％小牛血清的DMEM培养液将细胞制成1×10~5/ml浓度,二氧化碳(卵鸟)箱培养24h后将细胞分4组。①746-3组,用终浓度为20μg/ml 764-3培养液作用1.5h。②BLM A_6+764-3组,764-3处理后再经终浓度为6ng/ml BLM A_6培养液作用2h。③BLM A_6组,用相同于2组剂量的BLM A_6作用     

重组人可溶性DR5 蛋白的表达、制备及其生物活性检测

目的：纯化毕赤酵母GS115菌株表达的重组人可溶性死亡受体5(DR5)蛋白，并研究其对肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)所诱导细胞凋亡的阻断效应。方法：大量扩增可溶性DR5酵母表达载体转化阳性的毕赤酵母GS115菌株，收集上清，利用ProBond^TM亲和层析柱纯化获得重组可溶性DR5蛋白，用SDS-PAGE、Western Blot检验纯化产物的特异性和纯度。用MTT法检测纯化的可溶性DR5蛋白对TRAIL诱导人宫颈癌细胞系Hela细胞凋亡作用的阻断效应。结果：转化阳性的毕赤酵母GSll5菌株可成功表达分子量为26kD的可溶性DR5蛋白，经ProBond^TM亲和层析柱纯化。SDS-PAGE、Western Blot鉴定，结果显示获得了高纯度的重组人可溶性DR5蛋白，蛋白产量达20斗g／ml；体外活性检测结果显示，纯化的可溶性DR5蛋白可部分阻断TRAIL诱导的Hela细胞的凋亡，阻断率最高达53．6％。结论：经纯化后的重组人可溶性DR5蛋白可有效阻断TRAIL诱导的细胞凋亡反应。     

甜茶护齿含片对葡糖基转移酶和细胞外水不溶性多糖的影响

目的研究甜茶护齿含片对变形链球菌葡糖基转移酶和细胞外水不溶性多糖合成的影响。方法将甜茶护齿含片磨成粉末,并采用二倍稀释法,用含1%蔗糖的胰蛋白胨-胰蛋白月示-酵母提取物(TTY)液体培养基,配制成5个浓度的实验组;并以含1%蔗糖的TTY液体培养基作为阴性对照组。加入变形链球菌菌液,厌氧培养48 h后离心,一份透析提取葡糖基转移酶,采用Somogyi法和考马斯亮蓝法分别测定还原糖和总蛋白含量,计算酶活性和比活力大小;另一份弃上清液留沉淀,采用蒽酮法测定水不溶性多糖的含量。结果随着甜茶护齿含片混悬液浓度的升高,葡糖基转移酶活性和水不溶性多糖含量逐渐降低(P<0.05),除0.313 g/50 ml浓度组外,葡糖基转移酶各实验组与对照组酶活性及比活力之间差异有统计学意义(P<0.05),各实验组与对照组水不溶性多糖含量差异有统计学意义(P<0.05)。结论甜茶护齿含片对变形链球菌葡糖基转移酶和细胞外水不溶性多糖的合成具有显著抑制作用。