骨髓基质干细胞修复软骨缺损的实验研究

[目的]探寻体外诱导骨髓基质干细胞成软骨细胞的最佳细胞因子，寻求体内修复家兔软骨缺损的最为有效方案。[方法]rhFGF1、rhTGF-β1、rhIGF-1单独或联合应用对骨髓基质干细胞进行体外诱导培养，应用常规染色、MTT、免疫组织化学染色的方法筛选诱导骨髓基质干细胞成软骨细胞的最佳细胞因子，并将其与骨髓基质干细胞复合于纤维蛋白凝胶制成凝胶复合物，直接种植到兔膝关节实验性关节软骨缺损处，并与对照组相比较，观察软骨修复效果。[结果]常规形态学观察，rhTGF-β1和rhIGF-1联合应用诱导的细胞在形态上类似于软骨细胞，免疫组化染色提示诱导细胞具有软骨细胞表型。凝胶复合物直接种植在体内能诱导骨髓基质干细胞向软骨细胞分化，修复缺损的软骨，缺少细胞因子的对照组软骨缺损修复效果差。[结论]rhTGF-β1和rhIGF-1联合应用可作为诱导骨髓基质干细胞向软骨细胞分化的最佳组合，骨髓基质干细胞凝胶复合物能修复软骨缺损。     

真皮多能干细胞复合聚乳酸支架修复关节软骨全层缺损的实验研究

[目的]探讨真皮多能干细胞在软骨缺损修复中的可行性,为扩大软骨缺损修复中种子细胞的选择提供实验依据.[方法]以新生青紫蓝兔为研究对象,机械法直接分离得到真皮组织,采用酶消化法获取细胞,利用干细胞贴壁粘附生长的特性获取高克隆细胞群,并进行传代培养.使细胞浓度达到1×106/ml与聚乳酸支架材料共培养一周后植入兔膝关节软骨全层缺损处,用3～5个月龄青紫蓝兔30只,60个关节,随机分为真皮多能干细胞/聚乳酸支架材料、聚乳酸支架材料、空白对照三组,每组20个关节,于术后12周空气栓塞处死实验兔,对修复组织进行取材,行HE、甲苯胺蓝染色,根据软骨缺损修复情况进行大体、组织学评分,并进行统计学分析,比较各组的评分差异是否具有统计学意义.[结果]大体及组织学观察显示,真皮干细胞/支架材料实验组修复组织表面光滑、呈透明样,与周围软骨及软骨下骨整合良好,而聚乳酸支架材料组有少许透明样软骨,主要以纤维软骨修复,空白对照组则表面有缺损,以纤维软骨修复.大体及组织学观察后进行统计学评分分析,显示A组修复效果最优、优于B、C组(P＜0.05),B组优于C组(P＜0.05)[结论]真皮多能干细胞修复关节软骨缺损效果明显,恢复正常关节软骨结构,可作为组织工程化软骨种子细胞之一.     

应用自体脂肪干细胞修复猪关节软骨缺损的初步实验研究

目的 探索自体脂肪干细胞修复猪关节软骨缺损的可行性.方法 从猪背部脂肪组织中获取脂肪干细胞,经过体外培养扩增,以50×106/ml的浓度将脂肪干细胞接种于PLGA(polylacticacid/polyglycolicacid,PLA/PGA,PLGA)中,细胞材料复合物在体外成软骨诱导2周.于猪膝关节软骨非负重区形成2个直径8mm的环形、全层软骨缺损,实验组回植经诱导后的细胞材料复合物,对照组放置单纯支架材料.术后12周取材,缺损修复区行大体观察、组织学HE及藏红花染色、免疫组化检测.结果 术后12周实验组缺损区大部分被修复,缺损被软骨组织填充,修复区表面光滑.组织学染色显示有典型的透明软骨样结构.藏红花染色发现修复组织表达丰富的聚合蛋白多糖.对照组则未能修复关节软骨缺损,缺损区面积增大,表面覆盖薄层纤维组织.结论 猪自体脂肪干细胞可以作为组织工程种子细胞,修复猪关节软骨缺损.     

兔脂肪干细胞直接修复陈旧性全层兔膝关节软骨缺损

目的探讨兔脂肪干细胞在体直接修复陈旧性全层兔膝关节软骨缺损的可行性。方法分离培养新西兰大白兔的脂肪干细胞,测定该细胞生长曲线,评价其增殖能力。每只实验兔双膝各做一个缺损,随机分为试验组和对照组,试验组缺损区填充脂肪干细胞-纤维蛋白混合物,对照组仅填充纤维蛋白。于术后第6周和第12周取材,行大体观察和组织学评价。结果冻存前后脂肪干细胞均具有较好的增殖能力。对于陈旧性关节软骨损伤,不同时间点的试验组治疗效果均好于对照组。结论脂肪干细胞增殖能力强,在体内能直接修复陈旧性全层关节软骨缺损。     

透明质酸促进关节软骨缺损修复的实验研究

[目的]观察透明质酸对关节软骨损伤修复的作用,并探讨其机制。[方法]经手术建立兔股骨内髁软骨2.5 mm圆形缺损模型,术中于缺损处局部注射、术后每周关节内注射透明质酸0.5 m1。4周后组织学和免疫组织化学分析缺损处软骨修复情况及凋亡细胞发生率;并分析关节液中Ⅱ型胶原、粘多糖和肿瘤坏死因子含量。[结果]透明质酸对关节软骨缺损的修复有明显的促进作用,4周时组织学上可见纤维软骨修复为主,其间散在少量Ⅱ型胶原阳性细胞,部分纤维软骨向透明软骨转化。并且关节液中Ⅱ型胶原和粘多糖增多,TNF-α含量减少,同时软骨和软骨下骨中凋亡细胞发生率降低。[结论]局部注射透明质酸可能通过影响骨髓干细胞增殖与分化,自骨髓和软骨下骨向缺损处诱发新生软骨组织的形成,从而促进软骨损伤的修复。     

关节软骨缺损修复与组织工程

关节软骨缺损自身修复能力很有限,目前的临床治疗手段无法达到满意修复.组织工程的发展为解决这个问题提供了新思路,使软骨组织缺损的完全再生成为可能.组织工程方法修复关节软骨缺损的最终目的是恢复软骨组织结构的完整性和功能稳定性.在细胞选择方面,软骨细胞主要要解决去分化问题,而间充质干细胞因为自体来源、易扩增、具有软骨细胞分化潜能,受到广泛重视,胚胎干细胞主要用于细胞的分化机制研究.生长因子因为作用效果不同,也趋向于联合应用.在支架材料选择方面,复合支架成为研究的主要方向.应用组织工程方法修复关节软骨缺损的效果存在一定的争议,主要是远期功能观察距离临床应用存在一定差距,在修复组织固位和生物力学影响方面还需要进一步研究.     

聚乙烯醇水凝胶材料替代关节软骨的研究进展

聚乙烯醇水凝胶具有和人体关节软骨类似的生物力学性质和良好的生物相容性,植入人体后能部分替代关节软骨,发挥承重和缓解冲击力的作用,具有临床应用前景。本文介绍聚乙烯醇水凝胶材料的研究进展,并与关节软骨各方面特性进行比较,阐明用此材料修复关节软骨缺损的可能性。     

间充质干细胞治疗骨关节炎的研究进展与展望

骨关节炎是最常见的关节疾病之一,其病理呈现出关节软骨退变、软骨下骨重塑、关节间隙变窄及边缘骨赘增生的过程。本文综述了近年来用于骨关节炎治疗的间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）的来源及特性、动物实验及临床试验方面的进展,介绍了MSCs治疗骨关节炎及关节软骨缺损的优势,总结了目前MSCs治疗骨关节炎的现状及局限性,提示MSCs治疗骨关节炎是一项应用前景广阔的技术。     

软骨细胞培养中细胞去分化和再分化研究进展

软骨细胞是软骨组织工程种子细胞的一个重要来源,应用自体软骨细胞构建的组织工程软骨可以成功修复大型哺乳动物关节承重面的缺损[1].自体软骨细胞移植术作为一种有效和成熟的技术已开始应用于临床关节软骨缺损修复[2],但软骨组织中的软骨细胞数量较少,接种支架前需要进行足量的扩增才能满足修复缺损的要求.     

胶原蛋白水凝胶在软骨组织工程中的应用

由创伤或骨病所致的关节骨软骨损伤在临床中十分常见,其中软骨缺损者达40.31%。由于关节软骨自身修复能力低下,采用组织工程技术对关节软骨损伤进行修复是目前采用再生医学治疗关节软骨损伤的新方法。组织工程支架按照性状可分为预成型支架材料及水凝胶材料两大类。传统的预成型支架材料移植技术容易给缺损周边软骨带来继发损伤,也存在支架与缺损整合不紧密等问题。如何在避免二次损伤的基础上,应用理想的仿生材料复合种子细胞修复关节不规则软骨损伤将成为未来软骨损伤修复的主要问题。选取微创、仿生并且可以原位塑形的胶原蛋白水凝胶复合种子细胞修复关节软骨损伤为损伤关节软骨的修复带来了希望。本文结合国内外相关文献对目前胶原蛋白水凝胶在软骨组织工程中的应用做一综述。     

骨髓基质干细胞作软骨组织工程种子细胞研究

目的　综述近年来骨髓基质干细胞体外培养、定向分化为软骨细胞的条件及相关研究进展。方法　广泛查阅相关文献 ,对上述研究进展进行整理、综合和分析。结果　骨髓基质干细胞易于分离培养 ,体外增殖能力强 ,传代多次后仍保持有多分化潜能 ;体内成软骨能力明确 ;但骨髓基质干细胞定向分化的软骨细胞 ,不是终末分化阶段 ,而只是一个中间阶段。结论　骨髓基质干细胞以其自身多方面的特点已成为软骨组织工程的另一种可选择的种子细胞 ,但其进一步分化为成熟软骨细胞的条件尚需进一步研究。     

SPIO标记骨髓间充质干细胞和软骨细胞共培养的研究

[目的]探讨SPIO标记骨髓间充质干细胞和软骨细胞共培养的可行性,为临床修复关节软骨损伤寻找新途径.[方法] 分离、扩增新西兰大白兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)和软骨细胞,根据SPIO标记(50μg/ml)和不同培养环境(共培养、单独培养)分4组,每天在倒置显微镜观察共培养后BMSCs的形态变化,共培养14 d后,免疫组化检测Ⅱ型胶原表达情况,阿利新蓝法检测蛋白多糖(GAG)表达水平.[结果] 共培养7 d后标记的部分BMSCs变圆,14 d时BMSCs形态高度分化与成熟软骨细胞相似,其蛋白多糖和Ⅱ型胶原的基因转录和蛋白表达均增高,明显优于对照组,差异具有显著性意义(P<0.01).[结论]1.软骨细胞微环境能有效诱导BMSCs向软骨细胞分化;2.SPIO可以安全、有效地标记BMSCs.     

体外诱导BMSCs向软骨分化的方法研究进展

目的全面了解目前体外诱导BMSCs向软骨分化的方法,为软骨组织工程研究提供参考。方法广泛查阅近年来有关软骨组织工程中诱导BMSCs向软骨分化的文献,并进行综合分析。结果目前BMSCs诱导成软骨方法主要是添加外源性生长因子,其中TGF-β家族被公认为最重要的诱导和调节因子。其他重要的诱导方法包括添加多种化学因子、物理因素、转基因技术和微环境诱导等方法,但这些方法仍存在诱导效率低、诱导效果不稳定的问题。结论诱导方法的进展促进了BMSCs在软骨组织工程中的应用,建立更高效、简便、安全的诱导方法仍是软骨组织工程领域重要研究课题之一。     

经碱性成纤维细胞生长因子修饰骨髓基质干细胞注射式修复全层软骨缺损

目的 探讨经碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)修饰的骨髓基质干细胞(BMSCs)注射式修复全层软骨缺损的可行性.方法 体外培养家兔自体骨髓基质干细胞,并以bFGF处理修饰细胞,免疫组织化学Ⅱ型胶原蛋白表达、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测蛋白聚糖表达.将其与藻酸钙凝胶支架复合注射式植入兔股骨髁全层软骨缺损处,同时设立凝胶支架对照组和空白对照组.术后8周取材观察修复效果,并行苏木素-伊红(HE)、甲苯胺蓝、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色检测;透射电镜观察修复组织的微观结构.结果 BMSCs的细胞群体倍增时间(PDT)为33.8 h,经bFGF处理的BMSCs可检测到Ⅱ型胶原和蛋白聚糖的表达.至术后8周可见质硬的类白色修复组织完全充填软骨缺损处,组织学检查可见大量软骨样细胞分布于深染的细胞外基质中,检测到Ⅱ型胶原的表达.透射电镜可见丰富的细胞器和胞外基质.凝胶支架对照组和空白对照组仅有部分质软组织充填缺损处,未检测到Ⅱ型胶原的表达.结论 经hFGF修饰的自体骨髓基质干细胞藻酸钙凝胶复合物可用于修复全层软骨缺损.     

软骨脱细胞基质仿生支架的制备及其对骨髓基质干细胞成软骨分化的影响

目的探讨软骨脱细胞基质(ACM)仿生支架的制备及其对骨髓基质干细胞(BMSCs)成软骨分化的影响。方法将软骨组织粉碎后脱细胞处理,并以不同的比例与明胶(GT)溶液混合并交联,冷冻干燥制成多孔仿生支架。用扫描电镜(SEM)观察不同交联比例制成的ACM/GT支架,并对其孔径、孔隙率、生物力学、降解速率进行评估,从而选取最优组用于体外软骨构建。分离并培养山羊BMSCs,接种于单纯GT和ACM/GT支架上,SEM观察培养1、7、14 d后细胞在支架上的黏附、分布与基质分泌情况,并通过实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)评估成软骨分化能力。结果制备的ACM无细胞残留。随着ACM占比增加,孔径逐渐增大,降解速率逐渐增快,力学强度逐渐降低。其中G2A2组在孔径、孔隙率、生物力学和降解速率方面均适宜体外构建软骨组织。SEM显示细胞在单纯GT和G2A2支架上均匀分布,增殖显著,基质分泌明显。qRT-PCR显示G2A2显著促进了BMSCs的成软骨分化。结论ACM可以制备成适宜软骨再生的支架材料,并可促进BMSCs的成软骨分化。     

脱细胞软骨支架材料修复兔关节软骨缺损

目的 观察异种异体脱细胞软骨支架材料(ACM)复合同种异体兔骨髓间充质干细胞(rBMSCs)修复兔股骨内髁关节软骨缺损的效果.方法 (1)密度梯度离心和差速贴壁法获得原代兔BMSCs,选择第3代BMSCs作为种子细胞;(2)利用冷冻干燥、胰酶消化和化学去垢剂等方法制备脱细胞软骨支架材料;(3)3个月龄新西兰兔股骨内髁制备直径4 mm,深3 mm砌关节软骨缺损模型,24只新西兰兔以2个时间段随机分为3组,Ⅰ ACM-BMSCs组:第3代BMSCs 1×106个/ml与ACM于37℃5%CO2饱和湿度复合48 h;Ⅱ ACM组;Ⅲ空白对照组.(4)移植6、12周后大体及组织学观察,免疫组织化学染色观察修复组织Ⅱ型胶原,Wakitani评分评估修复效果.结果 (1)大体观察及组织学观察:6和12周Ⅰ组再生组织与正常关节软骨面平齐,修复部位表面较平整,界限模糊,接近正常软骨.Ⅱ组修复组织表面不平整并有明显下陷,修复组织全层可见成纤维样细胞,深层可见极少数透明软骨样细胞.Ⅲ组未见明显修复,肉芽组织形成伴成纤维样细胞增生;(2)Wakitani组织学评分可见在不同的时间段I组和Ⅱ组均低于Ⅲ组,差异有统计学意义(P<0.05),Ⅰ组和Ⅱ组间组织学评分差异无统计学意义(P>0.05).(3)免疫组织化学:ACM-BMSCs组修复组织的细胞为软骨样细胞,可见柱状排列,周围软骨基质Ⅱ型胶原染色阳性.结论 以ACM为支架材料,同种异体BMSCs为种子细胞制备的组织工程化软骨对兔股骨内髁关节软骨缺损有修复作用,形成的新生软骨为透明软骨样组织.     

CS/PVA凝胶负载Ad-hTGF-β1转染的BMSCs移植修复兔关节软骨缺损

目的 探讨温敏型CS/PVA凝胶负载Ad-hTGF-β1转染的骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植修复兔关节软骨缺损的实验效果.方法 体外分离培养兔BMSCs,在Ad-hTGF-β1转染1周后,用细胞免疫化学方法检测hTGF-β1在细胞内的表达.用24只成年新西兰大白兔制造关节软骨缺损模型,双侧后肢均用于实验,动物模型随机分为4组,各组动物6只.A组:凝胶复合转染BMSCs修复组;B组:凝胶复合未转染BMSCs修复组;C组:凝胶修复组;D组:空白对照组.在术后16周时处死动物取材,通过大体标本和组织学染色观察评价各组修复效果,按照改良Pinoda法评分,对各组修复效果进行统计学分析.结果 免疫组化证实体外培养的BMSCs在Ad-hTGF-β1转染后表达hTGF-β1蛋白,阳性率为85.4%.术后16周取材见凝胶复合转染细胞组关节软骨缺损部位为软骨样组织填充,组织学观察见再生的软骨组织细胞排列及细胞密度与正常软骨相似,Ⅱ型胶原免疫组化阳性,Pineda评分同其它各组相比差异有统计学意义(P＜0.05).结论 CS/PVA凝胶作为一种温敏型可注射支架材料,其负载hTGF-β1转染的BMSCs移植可用于兔关节软骨缺损修复.

Abstract：

Objective To investigate the experiment effects of rabbit joint articular cartilage defects repaired by thermosensitive CS/PVA composite hydrogel engineered hTGF-β1 transfected bone marrow mesenchymal stem cells. Methods Bone marrow mesenchymal stem cells were isolated and cultured in vitro. The positive rate of transfection was defected by cell immunohistochemistry methods after Ad-hTGF-β1 transfected for 1 week. Twenty-four adult New Zealand white rabbits with full articular cartilage defects were randomly divided into 4 groups, each group had 6 animals, both hind limbs were used in the experiment. Group A: hydrogel combined with transfected cells; Group B: hydrogel combined with untransfected cells; Group C: hydrogel group; Group D: blank control group. Specimens and histological observation were used to evaluate the repair effect after 16 weeks according to Pineda's score. Results The positive rate of hTGF-β1 expression in BMSCs was about 85.4% after transfection. After 16 weeks the defects of group A were repaired by cartilage-like tissue, the cell arrangement and densities of regenerated cartilage were similar to normal cartilage, type Ⅱ collagen immunohistochemistry were positive. There was a significant difference in Pineda's score compaired with other groups (P ＜ 0.05). Conclusion Rabbit articiular cartilage defects could be repaired by CS/PVA hydrogel engineered hTGF-β1-transfected bone marrow mesenchymal stem cells.     

组织工程骨-软骨复合组织种子细胞的获取与培养

目的:探索体外培养组织工程骨-软骨复合组织种子细胞的条件,并观察其部分生物学活性。方法:采用机械-酶消化法对3周龄新西兰大白兔耳软骨和关节软骨消化来获得软骨细胞,采用全骨髓贴壁法来获得骨髓间充质干细胞,对两种细胞进行原代和传代培养,通过倒置相差显微镜观察细胞形态、绘制生长曲线、免疫组化染色等对细胞进行生物学特性分析。结果:原代培养的软骨细胞以多角形或三角形为主,传代3次以后出现去分化。形态学和免疫组化显示细胞3代以内可以保持表型稳定,具有较强的增殖及分泌细胞外基质的能力,而且耳软骨及关节软骨细胞在实验中没有表现出明显的生物学差别。采用贴壁筛选法获得的BMSCs呈长梭形或多边形,生长曲线呈"S"形,Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性,细胞生长增殖能力旺盛。结论:体外分离培养的软骨细胞和骨髓间充质干细胞符合组织工程要求,能够作为骨-软骨复合组织的种子细胞。     

The effect of recombinant human bone morphogenetic protein-2 on the osteogenic potential of rat mesenchymal stem cells after several passages

Background Since the osteogenic potential of bone marrow derived mesenchymal stem cells (BMSCs) becomes reduced with passage, establishment of culture condition that permit the rapid expansion of BMSCs while retaining their potential for differentiation is needed for clinical application. Bone morphogenetic proteins stimulate osteogenic differentiation in mesenchymal progenitor cells as well as increase stem cell numbers. Thus, we analyzed the effect of recombinant human bone morphogenetic protein-2 (rhBMP-2) on the osteogenic potential of rat BMSCs over several passages.

Material and methods Osteogenic differentiation in vitro was evaluated in terms of the alkaline phosphatase (ALP) activity and the osteocalcin (OC) concentration in the supernatants, and the expression of ALP and OC mRNA in the cultured cells. For in-vivo osteogenesis, BMSCs cultured with and without rhBMP-2 through all passages were implanted into athymic mice.

Results  The levels of osteogenic markers were significantly higher in the cells of the BMP(+) group than in the cells of the BMP(-) group, although they decreased with passage irrespective of whether or not rhBMP-2 was added. Similar to the in-vitro experiments, there was a greater degree of bone and cartilage tissue formation in the BMP(+) group over all passages.

Interpretation  From our results, osteogenic potential can be maintained even in BMSCs that have been passaged several times in the presence of rhBMP-2. These cells are capable of inducing and participating in bone formation and can be used for clinical applications.     

生长分化因子5基因转染诱导骨髓基质干细胞分化的研究

目的 探讨人生长分化因子5(GDF5)基因转染对骨髓基质干细胞(BMSCs)生长及分化的影响.方法 采用脂质体介导法将GDF5基因导人人BMSCs,通过MTT法和流式细胞仪分别检测细胞增殖能力和细胞周期,在光镜和电镜水平观察细胞形态,用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)和免疫细胞化学方法榆测GDF5和Ⅱ型胶原mRNA和蛋白质的表达.柠檬酸铅法检测细胞碱性磷酸酶活性,RT-PCR法检测骨钙素mRNA表达.结果 GDF5在转染细胞内得到稳定表达,转染细胞的增殖能力和细胞周期与未转染细胞基本一致.光镜下转染细胞中多角形细胞相对增多,排列方式不规则.电镜下转染细胞核呈不规则形,细胞器丰富.转染细胞Ⅱ型胶原mRNA和蛋白表达阳性,骨钙素mRNA表达阴性.结论 GDF5基因脂质体法转染BMSCs成功,转染细胞仍保持正常生长增殖特性.GDF5可诱导BMSCs向软骨表型分化,GDF5基因修饰的BMSCs可作为软骨组织上程的候选种子细胞.