脑胶质瘤相关新基因PKIβ的表达与蛋白质性质的研究

目的 运用基因芯片技术获取正常成人脑组织与人脑胶质瘤中差异表达的基因,并对其中1条基因进行了克隆和表达.方法 抽提正常成人脑组织与脑胶质瘤组织中的mRNA来制备探针,经杂交、洗涤后,通过计算机观察二者表达谱的差异情况,对436F11克隆子进行Northern印迹,生物信息学分析和蛋白质的表达.结果 通过4次基因芯片筛选,获得15条与胶质瘤相关的新基因,经Northern印迹证实436F11基因在人正常脑组织中高表达,而在人脑胶质瘤中低表达.BLASTn和BLASTx分析显示,436F11基因为全长新基因,共编码78个氨基酸,其理论相对分子质量为8468等电点为4.69,与鼠PKIβ69%同源,命名为人PKIβ.并在大肠杆菌中得到了PKIβ较高的表达蛋白,经纯化,在SDS-PAGE胶上获得了1条清晰的条带.氨基酸测序和分子量测定与生物信息学结果完全一致.结论 基因芯片筛选正常脑组织与人脑胶质瘤差异表达的基因具有样品用量少,高质量,高速度,高敏感等特性.人PKIβ可能是与人脑胶质瘤形成有关的1条全长新基因,这为脑胶质瘤的基因治疗提供了一条新思路.     

脑胶质瘤相关新基因的聚类分析在其分子病理学分类中的意义

目的 探讨人脑胶质瘤发生发展中相关基因的表达及功能,初步建立基于基因表达谱的胶质瘤分子病理学分类方法。方法 用含13939种人类基因的BioStarH140S型表达谱芯片,以正常脑组织及胶质瘤组织总RNA制备的探针杂交芯片;ScanArray 4000扫描芯片,提取正常脑组织及胶质瘤组织差异基因并行生物信息分析,对部分新基因行Northern杂交、原位杂交等功能研究;Hierarchical聚类对差异基因进行特征提取,进行初步胶质瘤分子病理分类。结果 在正常脑组织与18例不同级别胶质瘤组织中筛选出1200条(8.61％)差异基因,其中395条(2．83％)基因尚未登录GeneBank,胶质组织瘤中348条基因表达上调,852条下调,信息分析与细胞信号传导等多类基因密切相关;Northern、原位杂交显示新基因与胶质瘤密切相关;聚类发现微管相关蛋白、黏附素超家族蛋白、细胞外基质相关基因等与分子分型相关,基于基因表达谱的分子病理分类与依据细胞形态的病理学分类基本一致,且更能反映胶质瘤发生发展的内在本质。结论 胶质瘤发生发展存在多类基因表达改变,表达谱芯片对胶质瘤分类具有特异性高、重复性好、样本量少的特点,基因表达谱及相关新基因的发现和分子病理学分类有助于阐明胶质瘤分子病理学机制。     

膀胱癌差异表达基因BQ135232的全长克隆及意义

目的 克隆并鉴定膀胱移行上皮细胞癌(BTCC)的差异表达基因.方法 应用抑制消减杂交技术(SSH)构建膀胱癌和其正常上皮组织差异表达的cDNA消减文库,进一步利用斑点印迹杂交筛选出BTCC差异表达的基因, 对其中明显差异表达的BQ135232应用SMART RACE克隆全长,再应用免疫荧光原位杂交进行染色体定位,并应用Northern blot进行差异表达分析.结果 成功构建了人膀胱癌组织的cDNA消减文库,共含有376个阳性克隆和83个阴性克隆.随机挑出的100个阳性克隆中,76个克隆含有肿瘤差异表达的基因片段,对其进行同源性比对分析,其中有66个克隆为已知基因,其余的10个克隆代表5种未知基因.未知基因中BQ135232共有3个拷贝,染色体定位发现其位于第12号染色体近末端处.Northern杂交分析显示它在膀胱癌组织中高表达,而在正常膀胱组织中无明显表达.结论 本研究表明BQ135232是跟膀胱癌发生发展密切相关的新基因,它的成功克隆为阐明膀胱癌发生发展的分子生物学机制开辟了新的途径.     

LMO3基因在人脑胶质瘤组织中的表达及意义

目的 观察LMO3基闪在人脑胶质瘤组织中的表达与临床病理特征的关系.方法 用半定量方法检测44例人脑胶质瘤组织与12例正常脑组织中经逆转录-聚合酶链式反应扩增后的LMO3基因表达.结果 LMO3基因在胶质瘤、正常脑组织中均有表达,在低分化胶质瘤中(Ⅲ～Ⅳ级16例)的表达高于高分化胶质瘤(Ⅰ～Ⅱ级28例,P<0.05);在高分化胶质瘤组和低分化胶质瘤组的表达均高于正常脑组织组(12例,P<0.05).结论 LMO3基因的表达水平与胶质瘤的分化程度相关.     

基因芯片技术筛选2型糖尿病胰岛素抵抗脂肪代谢相关差异表达基因

目的:应用基因芯片技术比较2型糖尿病胰岛素抵抗(IR)患者和正常人大网膜组织脂肪代谢相关基因表达谱的差异,探讨IR可能的发病机制.方法:分别用Cy5 和Cy3两种不同的荧光染料通过逆转录反应将IR组(n＝5)和正常对照组(n＝5)脂肪组织的mRNA标记成探针,并与载有一组靶基因的基因表达谱芯片进行杂交,通过扫描荧光强度,计算机软件分析,寻找两组差异表达基因.然后对芯片筛选结果中差异表达的FOXC2基因用Northern印迹法进行验证.结果:IR组和正常对照组之间共筛选出82条差异表达已知基因;其中脂肪代谢相关基因10条,表达增加的基因5条,表达降低的基因5条.Northern印迹证实IR组FOXC2 mRNA表达明显升高,与基因芯片检测结果一致. 结论:IR的发病与脂肪代谢相关,FOXC2可能是2型糖尿病IR的候选基因.     

一个唐氏综合征下调表达基因片段的克隆、鉴定及细胞定位分析

目的:克隆唐氏综合征(Down syndrome,DS)相关新基因,并对其进行组织表达谱和细胞定位分析,探索其在DS脑病变发生中可能参与的环节.方法:在分析前期基因芯片结果的基础上,选取在正常和DS胎儿大脑皮层中差异表达的表达序列标签(expression sequence tags,EST) AI480014,利用cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA end ,RACE)对其进行末端延伸;利用多组织Northern印迹技术分析其在组织中的表达谱和剪接体情况,用半定量RT-PCR进一步验证其组织表达谱的结果;通过细胞原位杂交技术,对其进行体外原代培养的混合胶质细胞表达定位分析;最后用半定量RT-PCR分析其在DS和正常胎儿脑皮层表达情况.结果:成功地将AI480014的3'端延伸232 bp,得到一个3'端完整、长682 bp的新基因片段(Genbank序列号DQ275636);Northern印迹表明分析其在心、肝、脾、肾、脑组织均有表达,且在脑组织中的表达量最高,而在脑组织中又以额叶、海马的表达量最高,各组织无可变剪接体的存在;在混合培养的胶质细胞中检测到该基因的表达;DQ275636染色体定位为5q14.结论:得到一个新基因片段(DQ275636);其组织来源和在脑组织中的表达特性提示其可能参与DS脑病变发生的某个环节.     

全反式维甲酸诱导胶质瘤细胞侵袭相关基因的差异表达

目的 筛选全反式维甲酸诱导胶质瘤细胞系所致侵袭相关差异表达基因,为进一步研究胶质瘤的侵袭机制提供依据.方法通过运用cDNA微阵列技术比较10μmol/L全反式维甲酸处理前后胶质瘤SHG-44细胞(WHOⅣ级)的基因表达谱,鉴定与胶质瘤侵袭相关的差异表达基因.随机选择数个差异表达基因进行Northern杂交实验,以验证cDNA微阵列结果 的可靠性.结果 实验鉴定出42个差异表达基因,其中表达上调28个、下调14个.4个差异表达基因:CD151、G3BP、UGB和CSTB与胶质瘤的侵袭相关.部分差异表达基因的可靠性为Northern杂交实验所验证.结论 初步揭示全反式维甲酸能诱导胶质瘤细胞侵袭相关基因的差异表达,进一步开展对前述差异表达基因的研究有可能阐明胶质瘤侵袭的基因通路及机制.     

脑胶质瘤差异表达基因的微矩阵研究

目的 用生物芯片筛选胶质母细胞瘤相关基因。方法 采用一种由包括胶质瘤cDNA文库构建的14 000个基因片段的生物芯片来杂交筛选胶质母细胞瘤的基因并分析其表达谱的变化。结果 经过杂交筛选并与正常脑组织比较,94个基因差异表达超过3倍,298个基因片段超过2倍。一些胶质瘤中上调基因在正常脑组织中几乎没有表达。几个与胶质瘤发生发展相关的新基因被证实。结论 生物芯片结合相关的cDNA文库对大规模快速筛选胶质瘤及其他肿瘤的治疗靶基因具有实际意义。     

人脑胶质瘤与转移瘤中nm23-H1的表达及意义

①目的　探讨人脑胶质瘤与人脑转移瘤中抑癌基因nm2 3 H1的表达及其在肿瘤生物学行为中的作用。②方法　应用免疫组织化学SABC方法 ,观察 6例正常人脑组织、18例人脑胶质瘤组织与 12例人脑转移瘤组织中抑癌基因nm2 3 H1的表达及其与肿瘤生物学行为之间的关系。③结果　nm2 3 H1在正常脑组织中的表达水平较低级别胶质瘤 (WHOⅡ级 )高 ,而较高级别胶质瘤 (WHOⅢ级 )低 ,差异有显著性 (F =4 4 .895 ,q =7.4 0 9、4 .839,P <0 .0 1) ;高级别胶质瘤、脑转移瘤和复发性胶质瘤中nm2 3 H1表达水平较低级别胶质瘤和正常脑组织高 ,差异有显著性 (q =4 .5 4 9～ 18.0 0 3,P <0 .0 1)。④结论　nm2 3 H1在正常组织和低级别胶质瘤中可能具有抑制肿瘤细胞增生、侵袭的作用 ,而在高级别胶质瘤、复发性胶质瘤和转移性肿瘤中可能具有促进肿瘤细胞增生、侵袭的作用。     

人LNX新基因克隆及组织分布和在脑胶质瘤中的表达

目的探讨人脑胶质瘤相关LNX新基因克隆、组织分布和在不同级别星形细胞瘤中的表达及其参与胶质瘤信号途径的分子机制。方法构建胎脑cDNA文库并测序获得全长LNX新基因;人多组织文库（MTC）为模板研究LNX的正常人体组织分布;应用含13939种人类基因表达谱芯片检测LNX新基因在脑星形细胞瘤中的表达;Northern杂交验证LNX新基因在不同级别胶质瘤中的表达;酵母双杂交研究与LNX新基因相互作用的蛋白,应用免疫共沉淀方法验证LNX与Numb蛋白和SKIP蛋白的相互作用。结果人胎脑文库中克隆的LNX新基因长约3．7kb,含1899bp开放阅读框,编码632氨基酸蛋白,相对分子质量约70000,登录号AF237782;LNX新基因在脑、肾和胰腺中表达较高,在心、胎盘、肺、肝、脾、胸腺和前列腺中也有表达;但LNX在胶质瘤组织中表达均降低,与肿瘤发生密切相关;酵母双杂交筛选到LNX新基因与肿瘤Notch信号途径中的Numb和SKIP蛋白有相互作用,免疫共沉淀发现LNX新基因与SKIP蛋白相互作用,可影响Numb的亚细胞定位,从而影响Notch信号途径Numb结合位点。结论表达谱芯片可快速高效锁定与胶质瘤密切相关的基因和寻找肿瘤标志物,LNX新基因与胶质瘤密切相关,通过Notch信号传导途径参与脑胶质瘤发生发展：可成为胶质瘤潜在的治疗靶标。     

A novel full-length gene of human ribosomal protein L14.22 related to human glioma

Background This study was undertaken to obtain differentially expressed genes related to human glioma by cDNA microarray and the characterization of a novel full-length gene. Methods Total RNA was extracted from human glioma and normal brain tissues, and mRNA was used as a probe. The results of hybridization procedure were scanned with the computer system. The gene named 507E08 clone was subsequently analyzed by northern blot, bioinformatic approach, and protein expression. Results Fifteen differentially expressed genes were obtained from human glioma by hybridization and scanning for four times. Northern blot analysis confirmed that the 507E08 clone was low expressed in human brain tissue and over expressed in human glioma tissues. The analysis of BLASTn and BLASTx showed that the 507E08 clone was a novel full-length gene, which codes 203 amino acid of protein and is called human ribosomal protein 14.22 gene. The nucleotide sequence had been submitted to the GenBank?with the accession number of AF329277. After expression in E.coli., protein yielded a major band of apparent molecular mass 22 kDa on an SDS-PAGE gel. Conclusions cDNA microarray technology can be successfully used to identify differentially expressed genes. The novel full-length gene of human ribosomal protein 14.22 may be correlated with the development of human glioma.     

cDNA microarray in isolation of novel differentially expressed genes related to human glioma and clone of a novel full-length gene

Background This investigation was undertaken to obtain differentially expressed genes related to human glioma using cDNA microarray and the characterization of one novel full-length gene. Methods Total RNA was extracted from human glioma tissues and normal brain tissues, and mRNA was used to make probes. After hybridization and washing, the results were scanned using a computer system. The gene named 681F05 clone was an expressed gene to human glioma through four-time hybridization and scanning. Subsequently northern blot analysis was performed by northern blot, 5‘RACE and bioinformatics. Results Fifteen differentially expressed genes to human glioma were obtained through four-time hybridization and scanning. Northern blot analysis confirmed that 681F05 clone was low-expressed in human brain tissues and over-expressed in human glioma tissues. The analysis of BLASTn and BLASTx showed that 681F05 clone is two cDNA clones encoding two novel proteins that are highly identified to the cyclophilin isoform 10 of C. Elgans, respectively. Sequence analysis revealed the two cDNA clones are two different splicing variants of a novel cycophilin-like gene (PPIL3a and PPIL3b). Conclusions cDNA microarray technology can be successfully used to identify differentially expressed genes. The novel full-length gene of human PPIL3 may be correlated with the formation of human glioma.     

直接获得差异表达基因全长cDNA的改良消减杂交方法

目的：探索一种可以直接克隆差异表达基因全长cDNA的方法。方法：结合Clontech公司的“SMART PCR”cDNA合成技术和Promega公司的生物素．磁珠亲和技术．以鼻咽癌耐药细胞系CNE2／DDP及其素代细胞CNE2为研究时象．采用一种基于PCR技术的改良消减杂交方法筛选并克隆耐药相关基因。点杂交鉴定排除假阳性．对部分差异表达片段测序并进行序列分析,RT-PCR对差异表达的基因片段做进一步验证。结果：用此方法建立了可以克隆差异表达基因cDNA全长的双向消减文库。经过对部分差异表达片段测序和序列分析．获得了6个耐药细胞差异表达的基因片断。其中5个有完整的开放读框．可能代表耐药相关的差异表达基因。对此5个序列登录GenBank并获得登录号为AY196929．196933。结论：改良的消减杂交方法是克隆差异表达基因的有效方法。应用此方法研究发现,有多个功能已知和未知的基因通过上调或降低其表达参与了鼻咽癌耐药性的产生。     

乙型肝炎病毒X抗原转导细胞差示表达全长基因C2的克隆及初步？…

目的 克隆乙型肝炎病毒Ｘ抗原（ＨＢｘＡｇ）相关肝癌差示表达基因并做功能研究。方法 （１）用逆转录病表达ＨＢｘＡｇ细胞模型。（２）用抑制差减杂文做基因差示表达分析。（３）做ＲＮＡ印迹分析（Ｎｏｒｔｈｅｒｎｍ Ｂｌｏｔ）及原位分子杂交筛选基因探针。（４）用５＇和３＇迅速未扩增法（ＲＡＣＥ ＰＣＲ进行全长基因序列扩增，并进行体外蛋白翻译及制备抗体，做蛋白质印迹（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ）分析。（５）进行     

抑制性消减杂交法构建甲状腺癌差异表达基因文库

目的：筛选并克隆在甲状腺癌组织与正常甲状腺组织之间差异表达的基因。方法：(1)应用抑制性消减杂交(SSH)进行基因差示表达分析,构建人甲状腺癌组织与正常甲状腺组织之间差异表达的cDNA消减文库;(2)克隆、鉴定甲状腺癌组织特异性高／低表达的基因;(3)登录Genbank,运用Blastn程序进行同源性分析。结果：成功构建了高消减效率的人甲状腺癌cDNA消减文库,对其中数个克隆的插入cDNA片段进行测序,经检索Genbank表明,正向SSH产物中有3个片段与来源于结肠上皮腺癌和Lung Epidermoid carcinoma的EST有100％同源性,提示它们来自恶性肿瘤相关基因。反向SSH产物中有5个片段为未知新序列,提示它们可能来自于在甲状腺癌中特异性低表达的新基因。结论：通过抑制性消减杂交技术,构建了人甲状腺癌cDNA消减文库,为下一步筛选鉴定甲状腺癌特异性基因及其全长克隆、功能研究等工作打下了基础。     

肝癌相关基因HCCA2的克隆及其与肝癌的相关性研究

目的　研究和克隆新的肝癌相关基因,探索肝癌发生的分子基础。方法　采用mRNA差异显示技术,分析肝细胞癌和癌旁组织间基因的差异表达情况,获得差异表达基因片断。用此基因片断作为探针,通过筛选胎盘cDNA文库,以获得该基因cDNA全长,并用Northern印迹杂交的方法,分析所获得的新基因在43对肝细胞癌、对应癌旁组织中的差异表达和在正常组织中的分布。结果　克隆了一个新的肝癌相关基因HCCA2的全长cDNA,其在人体正常组织中分布较为广泛,在正常肝组织中不表达。该基因在43对肝癌组织中表达的阳性率是79%(34/43)。它的表达与肝癌包膜的完整性、Ki-67蛋白的表达相关（P<0.01）。结论　肝癌差异表达新基因HCCA2可能与肝癌细胞的浸润和增殖能力有关。     

应用抑制性差减杂交技术克隆小鼠胸腺细胞发育相关新基因

目的:克隆胸腺细胞发育相关新基因.方法:应用抑制性差减杂交技术(suppression subtractive hybridization, SSH),构建了胸腺基质细胞系cDNA差减杂交文库,结合RACE及RT-PCR进一步克隆并验证新基因的cDNA全长序列.结果:筛选两个不同胸腺基质细胞系的差异表达基因,获得了差异表达的cDNA片段,克隆后挑选阳性克隆进行测序,成功克隆8个新基因片段.对其中两个新基因克隆C55和C91进行Northern杂交分析,mRNA转录体长度分别为1.4 kb及1.5 kb,C55的表达在两种胸腺基质细胞系中存在显著差异.进一步克隆了C55和C91两个新基因的cDNA全长序列,已被GenBank所接受.结论:抑制性差减杂交技术是克隆新基因片段的有效方法;成功克隆8个新基因片段及两个新基因的cDNA全长序列.     

应用抑制消减杂交技术克隆人大肠癌转移相关新基因

目的 克隆新的大肠癌转移相关基因,为进一步阐述大肠癌转移的分子机制提供线索。方法 利用抑制消减杂交技术,以1对来自同一亲本、转移能力不同的大肠癌细胞株SW620和SW480为研究对象,构建2种大肠癌转移促进基因和转移抑制基因的cDNA消减文库。随机挑取文库克隆进行差异筛选,对所得的差异片段进行测序和同源性分析,利用Northern Blot对新基因的表达情况进行验证。结果 两种消减文库分别含有235和232个白色克隆,90%以上的白色克隆含有插入片段。随机挑取约200个阳性克隆进行差异筛选。共获得29个差异片段。测序及同源分析发现15个为未知基因,GenBank登陆号为CD485499-CD485513。其中与5号染色体序列同源的基因有6个。结论 抑制消减杂交技术是筛选、克隆大肠癌转移相关新基因的有效手段;5号染色体上可能存在多个与大肠癌转移相关的新基因位点;筛选到的新基因片段为进一步克隆其全长、研究基因功能提供了实验基础。