思文霉素抑制核酸合成机理初探

本文以光谱法,DNA琼脂糖电泳及酶学方法等技术观察思文霉素(Siwenmycin)与DNA的相互作用和对核酸合成相关酶的影响。结果表明,思文霉素对DNA可产生直接嵌合作用,但它对DNA多聚酶Ⅰ和T_7RNA多聚酶均无明显抑制作用,说明思文霉素对核酸合成的抑制作用并非由于直接损伤了DNA模板所致。     

日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30杂交瘤细胞cDNA文库的构建

从日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30杂交瘤细胞总RNA中纯化mRNA，在AMV反转录酶作用下，制备单链cDNA。随后经RNaseH和DNA多聚酶Ⅰ的作用，合成双链cDNA。用T4DNA多聚酶制备cDNA的平末端，并在T4DNA连接酶的作用下，加上EcoRⅠ接头，将cDNA片段插入λgt（11）载体。以大肠杆菌Y1090做受体菌转染，构建NP30杂交瘤细胞cDNA文库。实验结果表明，包装效价2．14×106λpfu／ugλgt（11），重组率为52％。结果提示：本研究初步构建了NP30杂交瘤细胞cDNA表达文库。     

Epstein-Barr病毒DNA多聚酶基因扩增和表达载体构建

【目的】扩增Epstein Barr病毒 (EBV)DNA多聚酶基因 ,构建高效表达载体。【方法】根据EBV全基因序列 ,在EBVDNA多聚酶基因的 3′、5′端设计一对附加EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点的特异性引物 ,以B95 8细胞DNA为模板 ,采用改良PCR方法扩增出EBVDNA多聚酶基因 (3 0 44bp)。用EcoRⅠ和HindⅢ酶切该基因片断并克隆至表达载体 pMAL p2 ,采用蓝白斑试验筛选阳性菌落。EcoRⅠ和HindⅢ酶切分析、鉴定重组体 pEBP。【结果】通过电泳鉴定 ,PCR产物为 3 0 44bp ,与EBVDNA多聚酶基因大小一致。经蓝白斑试验及限制性DNA内切酶分析 ,成功地筛选到EBVDNA多聚酶基因重组表达质粒 pEBP。【结论】本实验成功地扩增出完整EBVDNA多聚酶基因 ,并构建了高效表达重组体 ,为进一步在体外表达、制备EBVDNA多聚酶蛋白奠定了基础。     

用λgt11载体构建人脑胶质瘤基因文库

自人脑胶质瘤手术标本中提取mRNA,逆转录合成cDNA,在T_4DNA 连接酶作用下,与一头是平末端,另一头是EcoR I 粘性末端、内含Not I 切点的插头相连,经T_4多聚核苷酸激酶磷酸化后,再与脱磷酸处理过的λgt11 臂连接,形成重组λgt11DNA。体外包装,构建了一个库容量含1.02×10~6重组子的人脑胶质瘤cDNA 基因文库。克隆效率为1.08×10~7pfu/μg cDNA。重组百分比为96.2%。     

PBMCs中HBV逆转录酶P基因的mRNA表达X基因的整合与肝细胞癌变的关系

目的在外周血单个核细胞(PBMCs)中研究乙型肝炎病毒(HBV)DNA多聚酶/逆转录酶P基因的mRNA表达、X基因的整合与肝细胞癌变的关系。方法设计HBV P基因引物P1、P2,及X基因引物X1、X2。分离HBsAg阳性40例原发性肝癌病人及36例慢性乙肝病人PBMCs,分别提取其基因组总DNA和总RNA,RNA逆转录合成cDNA;PCR检测HBV的X基因整合;RT-PCR方法检测HBV的DNA多聚酶/逆转录酶P基因在PBMCs中的mRNA表达。结果PBMCs中X基因片段的整合率在HCC组为79.5%(31/40),与CH组的整合率50%(18/36)无统计学差异(P>0.05)。P基因的mRNA表达率HCC组为10%(4/40),与CH组表达率33.3%(12/36)有统计学差异(P<0.05)。结论在HCC阶段HBV病毒复制相对静止,大量X基因整合最终导致HCC的发生。     

安徽省第八次耳鼻咽喉科学术年会暨继续教育学习班征文通知

多聚酶链反应(Polymerase Cjain Reaction，PCR)是一种基因体外扩增技术，其原理是模拟自然DNA复制的核酸扩增技术，来特异性合成某一DNA片，其基本过程包括三个阶段：变性、退火(结合)、延伸，首先在90-95℃条件下使需检测(扩增)的靶双链DNA分子变性解链DNA，接着在40-55℃将人工合成的特异引物(两条短的寡核酸链)结合到模板DNA上，随后在70-75℃条件下，     

甲状腺激素及其衍生物对大鼠不同组织中T_45′脱碘酶调节的研究

T_45′脱碘酶的作用是使局部组织T_4向T_3转化,本实验以~(125)I T_4为底物,应用薄层层析法研究了甲状腺激素(T_3、T_4)及其衍生物(DIT、MIT)对大鼠大脑皮质和肝肾中T_45′脱碘酶的调节,结果发现:在大脑皮质中,T_4抑制T_45′脱碘酶活性,T_3对其无作用;在肝肾中,T_3,T_4都增强T_45′脱碘酶活性,T_3作用更大一些;DIT、MIT在这三种器官中对此酶无作用,这很可能说明T_45′脱碘酶对大鼠大脑皮质和肝肾中的调节机制是不同的,它很可能是局部调节而不是系统调节。     

抗甲型流感病毒短发夹状RNA分子的体外生物合成及功能鉴定

目的 制备抗甲型流感病毒短发夹状RNA分子(short hairpin RNA,shRNA),并鉴定其功能.方法 针对甲型流感病毒(influenza A virus,IAV)核壳蛋白(nucleoprotein,NP)和酸性RNA多聚酶(acidic RNA polymerase,PA)编码mRNA高度保守区序列设计并制备编码shRNA的双链DNA转录模板,分别将其插入pGenSil-1质粒,构建NP-shRNA和PA-shRNA表达载体,测序正确后,采以T7转录试剂盒制备NP-shRNA和PA-shRNA.将所制备的2种shRNAs分别或联合转入人气道上皮细胞(human bronchial epithelium,HBE),然后感染IAV A/PR8株,通过测定HBE细胞病变效应(cytopathogenic effect,CPE)、培养上清液病毒滴度以及NP、PA mRNA与蛋白表达水平,评估所制备的shRNAs对IAV A/PR8在HBE细胞中复制的抑制效果.结果 编码shRNA的2种舣链DNA转录模板序列正确.通过体外转录技术制备的NPshRNA、PA-shRNA每100 μl含量分别为59.4、50.6 nmol,纯度均在2.0以上,浓度和纯度均高.与未转染shRNA的对照组比较,NP-shRNA、PA-shRNA、NP-shRNA+PA-shRNA转染组细胞内NP mRNA分别减少41.7%、44.1%和68.5%,PAmRNA分别减少43.4%、60.9%和73.7%,NP蛋白表达分别降低92.3%、84.0%和91.7%,CPE显著减轻,培养上清液病毒滴度显著下降.结论 成功构建了2种抗IAV短发夹RNA分子,所制备的NP-shRNA、PA-shRNA对IAV A/PR8株在HBE细胞中复制有显著的抑制效果.     

EB病毒胸苷激酶基因的扩增

本文报道用多聚酶链反应方法扩增EB病毒胸苷激酶基因。本研究以Raji细胞和B95-8细胞二种不同细胞株的DNA为模板,引物是根据B95-8细胞的胸苷激酶基因序列设计的,均可得到特异的扩增产物,该产物用内切酶Ncol切割鉴定,酶切片段的长度与预期理论值完全一致。     

聚和酶链反应操作体会

聚和酶链反应（polymerase chain reactionPCR）又称体外基闲扩增技术，是20世纪80年代中期发展起来的一种新的分子牛物学技术。由于当时缺乏耐热的DNA多聚酶，在每一循环的DNA模板变性后，又需添加一次DNA多聚酶闪而操作复杂易出错。至1989年纯化了耐热的TaqDNA多聚酶后PCR才应用到生物领域，随后广泛应用到基础医学、临床医学、临床诊断等领域，如进行DNA测序、遗传性疾病分析和诊断、各种传染性疾病的诊断。     

肝硬化患者乙肝血清标志物模式分析

乙型肝炎病毒(HBV)为DNA病毒,基因组4个开放读码框编码产生物主要有乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、核心抗原(HBcAg)、HBeAg(HBeAg)、DNA多聚酶、X抗原(HBXAg)等,这些产物刺激机体产生相应抗体即HbsAb、     

粒酶B和穿孔素mRNA竞争模板的构建

目的：为测定肾移植术后患尿中粒酶B和穿孔素mRNA水平构建其相应的竞争模板。方法：取肾移植术后患尿样，通过RT—PCR反应，获得含特定酶切位点的粒酶B和穿孔素片段，酶切粒酶B和穿孔素片段，分别在其间插入44bp和36bp外源性DNA片段，连接入PGEM4载体。结果：经酶切鉴定及DNA测序证实，外源性DNA正确插入粒酶B及穿孔素片段，竞争模板引物结合区域与靶序列一致，所构建粒酶B竞争模板与粒酶B片段相差29bp，所构建粒酶B竞争模板与粒酶B片段相差36bp，所构建新载体适合作为定量PCR的竞争模板。结论：基因重组方法可成功构建用于定量PCR的竞争模板，方法简便可行。     

乙肝病毒核心抗原强制泛素化DNA疫苗的构建

目的 构建乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)强制泛素(Ub)化的DNA疫苗表达质粒.方法 以BALB/c小鼠肝脏mRNA为模板,RT-PCR扩增Ub单体基因片段,并将其羧基端第76位氨基酸突变为丙氨酸;以HBV pADR为模板,PCR扩增HBcAg基因片段,并根据N末端法则将其第1位氨基酸突变为精氨酸;利用重组PCR技术拼接Ub-HBcAg融合基因,纯化后连接pUCm-T载体,酶切鉴定正确后将Ub-HBcAg片段插入真核表达质粒pcDNA3.1(-),构建重组真核表达质粒Ub-HBcAg-pcDNA3.1(-),并行酶切鉴定和基因测序.结果 构建的HBcAg强制Ub化融合基因DNA疫苗经基因测序证实目的 基因插入方向正确,突变与预期相符;其余基因序列与GenBank发布序列完全一致.结论 成功构建了HBcAg强制Ub化融合基因DNA疫苗.     

Toll样受体4在局灶性脑梗死大鼠脑组织的表达

目的探讨Toll样受体4(TLR4)在局灶性脑梗死(CI)大鼠脑组织中的表达变化和作用。方法参照longa等方法制成大鼠局灶性大脑中动脉阻断模型,采用免疫组织化学方法观察大鼠脑组织TLR4蛋白表达,反转录多聚酶链反应(RT-PCR)方法检测大鼠脑组织TLR4 mRNA的相对表达。结果脑梗死大鼠脑组织TLR4免疫阳性产物较对照组明显增加(P<0.01),同时伴有脑组织TLR4 mRNA相对表达上调(P<0.05)。结论脑梗死大鼠模型TLR4表达增高,提示TLR4在脑梗死炎性损伤中具有一定作用。     

辛芷鼻敏胶囊对变应性鼻炎大鼠IL-2和IL-4 mRNA表达的调节

目的:探讨新疆医科大学研制开发的中药新药辛芷鼻敏胶囊治疗大鼠变应性鼻炎的免疫调节作用机制。方法:用卵清蛋白致敏大鼠制成变应性鼻炎动物模型,用逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)对脾脏IL-2mRNAI、L-4mRNA进行定量检测。结果:与空白对照组比较,模型组IL-2mRNA表达下调,IL-4mRNA表达上调(P<0.01);与模型组比较,实验组IL-2mRNA表达上调,IL-4mRNA表达下调(P<0.01);与模型组比较,阳性对照组IL-2mRNA表达上调(P<0.05),但IL-4mRNA表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论:辛芷鼻敏胶囊能通过抑制变应性鼻炎IL-4mRNA表达,上调IL-2mRNA的表达,调节Th1和Th2平衡,从而治疗变应性鼻炎。     

茶多酚对低剂量烟草悬凝物诱导人支气管上皮细胞氧化损伤及凋亡的影响

目的:研究茶多酚对低剂量烟草悬凝物诱导人支气管上皮细胞氧化损伤及凋亡的影响.方法:制备烟草悬凝物(cigarette smoke condensate, CSC),采用四甲基偶氮唑盐[3-(4,5-dimethyl thiazoly)2,5-diphenyl-tetrazolium bromide,MTT]法测定人支气管上皮细胞株(HBE135-E6E7)的生长情况;荧光-化学发光仪测定细胞内氧自由基(reactive oxygen species,ROS)水平;DNA ladder 法检测HBE135-E6E7凋亡;反转录-多聚酶链式反应 (RT-PCR)法检测Bcl-2和Bax mRNA表达.结果:CSC组与CSC+茶多酚组细胞内ROS水平均明显高于对照组(P＜0.01),CSC+茶多酚组细胞内ROS水平则明显低于CSC组.CSC组出现明显的DNA断裂拖尾带,CSC+茶多酚组仅出现少量的断裂拖尾带.RT-PCR结果显示:与对照组相比, CSC组Bcl-2 mRNA表达降低 (P＜0.01), Bax mRNA表达升高 (P＜0.01);与CSC组相比, CSC+茶多酚组Bcl-2 mRNA表达升高 (P＜0.01), Bax mRNA表达降低 (P＜(0.01)),CSC组与(CSC+)茶多酚组 Bcl-2 mRNA/Bax mRNA值明显低于对照组(P＜0.01).结论:茶多酚可拮抗CSC诱导人支气管上皮细胞凋亡,其机制可能是通过有效清除ROS,促进Bcl-2 mRNA表达和抑制Bax mRNA表达实(现的).     

介绍两种鼠疫动物脏器PCR扩增模板的制备方法

多聚酶链式反应 (polymerase chain reaction)简称 PCR技术 ,是近年来发展起来的一种体外扩增特异 DNA片段的技术 ,此法操作简单 ,可在短时间内在试管中获得数百万个特异 DNA序列的拷贝 .但模板的制备是 PCR技术的重要环节 ,目前模板处理方法很多 ,有煮沸法、酚 :氯仿 :异戊醇抽提法、Nal-玻璃粉吸附法等 ,现在我们重点介绍煮沸法和美国CDC DNA提取法。1　材料与方法1 .1　菌株 :镇源 65号菌株 ,于 1 999年 1 2月 1 2日由思茅地区镇源县黄胸鼠分离。1 .2　实验动物 :豚氧、小白鼠由本所动物室饲养供应。1 .3　鼠疫感染动物脏器的制…     

不经抽提DNA的PCR模板快速制备法研究

不经抽提ＤＮＡ的ＰＣＲ模板快速制备法研究石奇珍，吕联煌，张学敏关键词多聚酶链反应，脱氧核糖核酸，模板多聚酶链反应（ＰＣＲ），对脱氧核糖核酸（ＤＮＡ）质量要求不高［１］，可源于单个淋巴细胞或精子，单根头发等［２］。曾溢涛等用于血提取ＤＮＡ进行基因扩增［...     

PCR-SSP法进行HLA分型的影响因素分析

日曲：探讨DNA模板质量、DNA聚合酶(Taq)用量对人类白细胞抗原(HLA)分型结果的影响，从而确定PCR一序列特异性引物(PCR-SSP)技术的更加优化的扩增体系。方法：采用PCR-序列特异性引物(PCR-SSP)的方法，对山西地区14400名骨髓供的血样进行了人类白细胞抗原(HLA)基因分型，回顾性分析DNA模板的纯度、DNA用量、DNA聚合酶(Taq)酶用量对HLA分型结果的影响。结果：每个PCR反应的DNA模板量在30ng～50ng之间时PCR扩增效果最优；每个PCR反应所用Taq酶为0．23U时PCR扩增效果最优。结论：DNA模板量和Taq酶用量是使用PCR-SSP技术进行HLA分型的主要影响因素；模板DNA的纯度对实验结果影响不大。     

IGF-I在大鼠肝肌纤维母细胞增殖中的作用研究

目的研究胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-在)在大鼠肝肌纤维母细胞(MF)增殖中的作用。方法培养1到4代的MF(P1-4)用于研究。用Northern blot RNA印迹杂交法测定IGF-ⅠmRNA的表达。5-溴-2-脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)核素掺入法分析DNA合成。结果P1-4 MF表达了IGF-Ⅰ特有的mRNA的转录产物,IGF-Ⅰ和较少量的胰岛素能增加MF的DNA合成。IGF-Ⅰ与IGFBP-2或-3重组体同时作用能抑制IGF-Ⅰ刺激MF中DNA的合成。但是用IGFBP-2或-3对MF做预孵育后则进一步增强了IGF-Ⅰ刺激MF中DNA的合成。结论IGF-Ⅰ在MF增殖的调节中起了重要的作用,可能与急性和慢性肝损伤过程中发生的肝纤维化过程有密切的关系。