成骨细胞的数量对体外钙化结节形成的影响

随着成骨细胞体外培养技术的发展,其体外培养已成为骨组织工程及骨替代材料研究的一个重要手段.成骨细胞的体外钙化是体外培养成骨细胞的一个重要生物学特征,对成骨细胞的鉴定、与材料的相容性及其材料的生物学效应的研究尤为重要.成骨细胞的接种浓度对其体外钙化有一定的影响,国内外文献未见关于这方面的报道.成骨细胞体外钙化形成条件的研究可望为骨替代材料的研究提供参考.     

重组骨脱细胞细外基复合Wistar大鼠成骨细胞体外培养的形态学观察

目的新型重组骨脱细胞细胞外基质(REAECM)的制备及其细胞相容性的初步检测,为骨组织工程寻找一种新型的细胞外支架提供实验依据。方法应用体外细胞培养技术,对鼠成骨细胞和REAECM体外进行联合培养1-4周,通过相差显微镜、光镜、电镜观察细胞在材料中的生长情况。结果成骨细胞可以在REAECM上发生良好的黏附、增殖,并且可以长入REAECM的孔隙内。结论REAECM可作为构建组织工程骨的一种较好的支架材料,具有网状孔隙结构;在体外和成骨细胞复合培养时表现出良好的细胞相容性,可以作为一种天然的骨组织替代材料。     

乳鼠成骨细胞与珊瑚-羟基磷灰石支架材料在旋转式生物反应器中培养的实验研究

目的探讨联合运用成骨细胞、珊瑚-羟基磷灰石(CHA)支架材料和自行研制的旋转式生物反应器在体外构建组织工程化骨的可行性.方法运用骨片组织培养法,分离培养Wistar乳鼠的成骨细胞,传至第3代后,形成成骨细胞-CHA复合物,然后在自行研制的生物反应器中培养.通过茜素红(ARS)染色,MTT法及其他组织化学的方法来研究在生物反应器中培养14 d时的成骨潜能.结果成骨细胞和CHA支架材料有良好的生物相容性.在生物反应器中,成骨细胞-CHA复合物培养至第14天时,CHA明显促进了细胞的增殖,ARS染色呈弱阳性反应,同时,碱性磷酸酶(ALP)的分泌减少.结论CHA材料和生物反应器可以为成骨细胞提供良好的生物学及力学环境,三者联合运用有希望成为构建组织工程骨的理想方法.     

4 力—电环境对骨生长代谢影响的细胞生物学机制

<正>深入了解力—电环境对骨组织生长和改建的作用机制,不仅是骨生物力学中一个基本理论课题,也是骨矫形外科急需解决的临床应用项目.以往的实验和临床研究,多侧重于骨器官和骨组织的水平,而对骨发生和代谢的组织学机制所知甚少.本实验使用已初步建立起来的鼠颅盖骨成骨细胞体外培养模型,对力—电环境刺激下成骨细胞的分化、代谢及体外骨生成过程.进行了免疫组织化学、电镜细胞化学和X线探针能谱分析等研究;并应用粘附式细胞激光定量分析及筛选仪,动态追踪观察了活细胞受到刺激后,细胞内DNA含量和钙离子浓度变化;最后对较适宜的力—电刺激强度区间,进行了定量研究.结果显示:骨在外界载荷作用下,可表现出明显的电现象,其产生机制源于压电效应和流动电动势,这种力—电效应为临床骨伤病治疗中,使用加压固定和直流电流刺激等方法,提供了理论依据.体外培养成骨细胞,具备骨生长能力,在适宜的微量直流电刺激下(85～212μA/cm~2),细胞代谢活动增强,骨生成速度加快.刺激电流密度是衡量直流电流作用效果的有效指标,刺激电流密度介于85～212μA/cm~2之间时,可促使成骨细胞膜上钙离子通道开放,增加细胞内游离钙离子浓度,促进DNA合成和细胞分裂增殖.控制钙离子通道启闭,是力—电环境影响骨生长和代谢的细胞生物学机制     

成骨细胞的体外培养与鉴定

背景：成骨细胞的体外培养方法均存在一定的局限性。 目的：对体外培养成骨细胞的来源,成骨细胞的培养方法及培养条件,鉴定成骨细胞的标志进行总结。 方法：以“Osteoblast, cell culture, identification”为检索词,检索PubMed数据库(2000/2010),以“成骨细胞、细胞培养、鉴定”为检索词,检索万方数据库(2000/2010),文献检索语种限制为英文和中文。纳入与成骨细胞的体外培养及鉴定密切相关的研究,排除重复性研究和Meta分析后对文献进行综述。 结果与结论：随着体外细胞培养技术的发展,人们已经从许多动物的骨、骨膜、骨髓及骨外组织中成功培养了成骨细胞,经鉴定具有典型成骨细胞的特征及良好的生物学特性,目前体外培养成骨细胞为常用的体外实验模型,成为研究骨生理、病理及修复的重要手段,也成为研究成骨细胞生长代谢及骨组织工程的基础。     

去卵巢山羊成骨细胞的体外培养

选用摘除双侧卵巢的百颅盖骨，体外分离培养成骨细胞，并对分离的成骨细胞做多方面生物学特性鉴定。结果表明：体外培养的去卵巢山百成骨细胞具有典型成骨细胞的形态特征、碱性磷酸酶活性以及在体外发生钙化的功能；证实了体外培养的去卵巢百成骨细胞具有体内成骨细胞的功能特性。为骨代谢的研究提供了新的实验手段。     

生物陶瓷与细胞外基质对成骨细胞生长及代谢影响

本研究采用了体外细胞培养技术,将人胚成骨细胞分别与不同生物陶瓷(HA,TCP,FHA,BGC)及复合生物陶瓷(BMP,TGF-β1)共同培养.通过相差显微镜及扫描电镜观察材料表面及周围细胞形态及附着情况,分子生物学方法测定细胞增殖率,碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(OC)、白细胞介素6(IL-6)及转化生长因子β1(TGF-β1)分泌水平,探讨其作用机理.结果发现复合生物陶瓷细胞增殖率,ALP、OC、IL-6及TGF-β1水平明显高于相应单一材料及空白对照.而不同的复合材料细胞增殖率及细胞基质蛋白分泌有所差异.FHA BMP,TCP BMP及HA BGC TGF-β1显示了较高水平.不同材料培养不同时间对细胞生长及代谢影响有所不同,反映了成骨细胞培养方法评价人工骨替代材料成骨活性规律是切实可行的.     

成骨细胞在旋转壁式生物反应器内的大规模扩增

目的 进行SD大鼠成骨细胞在旋转壁式生物反应器内大规模扩增培养的研究。方法利用微载体悬浮培养法在旋转壁式生物反应器内大规模扩增成骨细胞，检测其组织形态和生物功能后。作为接种到支架材料上并于反应器内三维环境中培养组织工程骨的种子细胞。结果成骨细胞在生物反应器中每代可以扩增十倍以上，同时经过倒置相差显微镜、SEM(扫描电镜)以及ALP(碱性磷酸酶)和MTT等生物学性能检测后，发现在旋转壁式生物反应器中三维培养的成骨细胞各种生物指标性能良好。结论新型旋转壁式生物反应器可以提供低剪切力的培养环境，而且细胞之间有三维联系的机会，成骨细胞表现出良好的体外扩增能力，适于建立一种理想的成骨细胞体外扩增的三维培养体系。     

多孔碳酸钙陶瓷与干细胞源性成骨细胞的相容性

背景：国内外的研究证实普通碳酸钙陶瓷作为骨替代材料时具有细胞支架作用。 目的：观察多孔碳酸钙陶瓷与成骨细胞的相容性,及作为骨组织工程支架的可能性。 方法：SD大鼠骨髓基质干细胞经矿化诱导培养、扩增并检测证实其已具成骨细胞表型后,分别与多孔碳酸钙陶瓷支架、普通羟基磷灰石陶瓷支架体外复合培养。 结果与结论：骨髓基质干细胞经体外诱导形成成骨细胞,钙结节、Ⅰ型胶原和碱性磷酸酶免疫染色结果阳性。多孔碳酸钙陶瓷支架材料与羟基磷灰石陶瓷材料皆有细胞附着生长,但多孔碳酸钙陶瓷支架材料细胞的黏附能力、增殖活力及成骨活性均强于羟基磷灰石陶瓷材料。提示多孔碳酸钙陶瓷支架材料与SD大鼠骨髓基质干细胞源性成骨细胞有良好相容性。     

成年大鼠成骨细胞体外培养及细胞凋亡的观察

目的　为研究骨重建过程中成骨细胞的关键作用 ,建立成年大鼠成骨细胞体外培养方法并进行细胞凋亡的观察。方法　 1 5周龄SD大鼠 ,在无菌条件下取颅盖骨置于培养瓶中DMEM培养液 ,内含体积分数为 1 0 %的胎牛血清 (FCS) ,在体积分数为 5 %的CO2 、37℃孵箱内培养。按原位DNA末端标记 (TUNEL)检测试剂盒方法染色 ,以荧光显微镜观察凋亡。结果　经活体观察、ABC法Ⅰ型胶原染色和碱性酸酶染色 ,显示培养细胞为成骨细胞。结论　本实验建立了成年大鼠成骨细胞体外培养方法并进行细胞凋亡的观察     

骨组织块法和酶消化法联合培养人成骨细胞

背景：成骨细胞培养难度大,不同培养方法得到的成骨细胞数量、纯度、增殖及分化活性各有区别。 目的：探讨理想的人成骨细胞体外培养的方法。 方法：取人髂骨松质骨,同时结合骨组织块法和酶消化法分离培养人成骨细胞。 结果与结论：分离培养的人成骨细胞生长状态良好,纯度较高。细胞贴壁生长,形态多样化,多呈多边形、纺锤型、梭形、三角形,胞浆丰富向外伸展出生长突,具有典型的成骨细胞形态特征;细胞增殖良好,碱性磷酸酶染色及矿化结节茜素红染色阳性。说明联合骨组织块法和酶消化法可成功分离培养人成骨细胞,是进行人成骨细胞体外培养较为理想的方法。 关键词：成骨细胞;原代培养;碱性磷酸酶;组织块法;酶消化法 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2012.07.002     

体外培养大鼠骨髓基质细胞分化为成骨细胞新方法的建立和鉴定

目的 改进成骨细胞骨髓培养法并进行鉴定。方法 建立分离和培养大鼠骨髓基质细胞(MSC)的新方法，并用活细胞形态学观察、HE染色、组织化学和放射免疫测定等技术进行观察和鉴定。结果 MSC呈典型的成纤维样细胞，细胞生长旺盛，增殖能力强。体外培养第40d后碱性磷酸酶、骨钙素量达到最高峰，维持至第60d左右开始下降。结论改进后的成骨细胞骨髓培养法具有分离时间缩短、污染机会减少、工作效率提高等优点．并且有助干MSC分化和增殖为具有良好功能特件的成骨细胞。     

Isolation,culture and osteogenic induction of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells

背景：骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能,且可大量体外扩增培养,是重要的组织工程种子细胞。但尚无统一的体外培养及定向诱导方法。 目的：探讨体外定向诱导兔骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞的可行性。 方法：应用密度梯度离心法从兔四肢骨中分离纯化间充质干细胞,应用密度为1.073 g/mL的Percoll分离液,3 000 r/min×30 min离心,区别于相关报道的Ficoll分离液,2 000-2 500 r/min×(20-30) min离心以及全骨髓培养法体外扩增至第3代,分别在普通培养基(对照组)和成骨诱导培养基(实验组)中培养。 结果与结论：成功获得大量高纯度骨髓间充质干细胞。经成骨诱导后,实验组骨钙素含量明显高于对照组(P < 0.05)。实验组碱性磷酸酶和钙结节染色阳性,对照组均阴性。结果表明使用密度梯度离心法可成功建立兔骨髓间充质干细胞的分离培养体系,骨髓间充质干细胞可定向诱导为成骨细胞。     

The influence on gene-expression profiling of osteoblasts behavior following treatment with the ionic products of sintered beta-dicalcium pyrophosphate dissolution

Sintered dicalcium pyrophosphate (SDCP) is biocompatible to bone tissue both in the in vivo and in vitro model. However, the molecular mechanisms that mediated these processes have yet to be identified. In this study, we investigated the influence of SDCP ions on in vitro osteoblasts behavior.The powder of sintered beta-dicalcium pyrophosphate (SDCP) was dissolved by HCl and then diluted into different concentration of solutions by culture medium used in the osteoblast cell culture. The effects of various concentration of SDCP on bone cell activities were evaluated by using MTT assay. For the differentiation of osteoblasts, alkaline phosphatase (AP) staining, von Kossa stain for mineralized nodules and bone markers messenger ribonucleic acid (mRNA) isolation and identification were performed at 3h, days 1, 3, 7 and 14. In the presence of 10(-8)M SDCP for 14 days, the osteoblasts population was still significantly higher than that of control. In the qualitative analysis for the formation of AP staining colonies and mineralization nodules formation were not affected by SDCP ions. When osteoblasts cultured in the presence of 10(-8)M SDCP ions, the osteocalcin mRNA expression was up-regulated; while the collagen, osteonectin and osteopontin mRNA expression were down-regulated. In this study, we demonstrated that the elevated concentration of calcium and pyrophosphate ions can activate genes of the bone cells. This study will contribute to a better understanding of cell/biomaterial interactions and mechanisms that SDCP affect the bone cells.     

Differentiation of osteoblasts in three-dimensional culture in processed cancellous bone matrix: quantitative analysis of gene expression based on real-time reverse transcription-polymerase chain reaction

Processed bovine cancellous bone (PBCB) is an attractive material for tissue engineering of bone. It is biocompatible, osteoconductive, nonimmunogenic, and porous and its biomechanical properties are close to those of native bone. In this study, differentiation of primary rat osteoblasts (rOBs) incubated on PBCB was investigated in vitro. rOBs were isolated and expanded in two-dimensional culture. Expanded rOBs were seeded into PBCB disks and cultured either in basal medium (BM) or differentiation medium (DM) containing ascorbic acid, beta-glycerol phosphate, and dexamethasone. Alkaline phosphatase (ALP) activity and RNA expression of ALP, bone sialoprotein (BSP), collagen type I (COL1), osteocalcin (OC), and osteopontin (OPN) were assessed by chemiluminescence assay and quantitative real-time RT-PCR over 14 days. Histologic analysis was performed on day 14. ALP increased over the observation period independent of stimulation. OPN and BSP expression was significantly higher in the DM group whereas COL1 and OC expression was significantly higher in the BM group. Matrix calcification was detectable only in the DM group by von Kossa stain. The observed expression patterns suggest a physiological response of rOBs to the differentiation stimulus. PBCB is a suitable matrix for in vitro differentiation of osteoblasts. Cell-seeded PBCB is a potential osteogenic construct for in vivo application.     

人骨髓间充质干细胞接种纳米晶胶原骨构建组织工程骨

目的观察体外培养的人骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）与纳米晶羟基磷灰石/胶原骨（nano-hydroxyapatite/collagen,nHAC）的生物相容性及细胞在nHAC上的生长情况。方法全骨髓法体外培养骨髓间充质干细胞,应用成骨诱导剂诱导向成骨细胞表型转化,通过细胞活性、免疫组化鉴定诱导培养的成骨细胞的细胞学特性。通过倒置显微镜、扫描电镜观察细胞生长及其在nHAC上的生长情况。结果原代培养的骨髓细胞增殖迅速,10～12d左右即可稳定传代,传代细胞7～9d即可传代。经诱导培养的细胞的ALP染色阳性,Von Kossa染色阳性,可见钙化的基质沉积,呈现典型的成骨细胞形态和生物学特征。构建的MSCs与nHAC共培养的模型中,细胞可在nHAC表面良好贴壁。复合培养8天,分布于支架材料上的细胞大量增殖、分泌细胞外基质。第14天,大量细胞在材料表面和孔隙中生长。细胞之间广泛存在突起连接。结论nHAC适合种子细胞的贴附、生长和增殖,是组织工程良好的载体材料。     

Alveolar mononuclear cells can develop into multinucleated osteoclasts: an in vitro cell culture model

Previous studies have shown that osteoclasts are derived from mononuclear cells of hemopoietic bone marrow and peripheral blood. The purpose of this study was to demonstrate the presence of multinucleated osteoclasts after adding alveolar mononuclear cells to new-born rat calvaria osteoblasts in vitro. To utilize osteoclast-free bone, fetal calvariae were obtained from newborn Wistar-rats and cultured in DMEM medium for 14 days. On the day of osteoblast culture, alveolar mononuclear cells were isolated from newborn Wistar rats with a serial washing method and then co-cultured with the calvarial osteoblasts. Bone resorption characteristics were observed both with light and scanning electron microscopy. When alveolar mononuclear cells were cultured for 14 days on the calvarial osteoblasts in response to 1 alpha, 25-dihydroxyvitamin D3, they formed tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP)-positive mononuclear and multinucleated cells. Resorption pits were seen in the 7-14 days long-term cultures. These results indicate that osteoclasts can be derived from alveolar mononuclear cells in vitro when a suitable microenvironment is provided by calvarial osteoblasts and vitamin D(3).     

大鼠骨髓间充质干细胞体外向成骨细胞分化培养的生物学特性

背景：骨髓间充质干细胞因取材方便、对机体损伤小,是目前最为合适的骨组织工程种子细胞,但其体外培养的具体方法及生物特性仍无定论。 目的：建立一种简单有效的骨髓间充质干细胞的体外培养及成骨诱导方法,并探讨其体外培养的生物学特点。 方法：采用贴壁法分离提纯Wistar大鼠骨髓间充质干细胞,传至第3代细胞后,分别在普通培养基(对照组)和成骨诱导培养基(实验组)中培养10 d,绘制细胞生长曲线。于培养第4,7,10,13,16天检测两组细胞碱性磷酸酶活性,并对细胞爬片行Von kossa染色。 结果与结论：采用贴壁法获得了均一性较好的骨髓间充质干细胞,对照组细胞生长速度明显快于实验组细胞。对照组细胞碱性磷酸酶活性明显低于实验组(P < 0.05)。实验组细胞Von kossa染色为阳性,对照组为阴性。说明贴壁筛选法是一种简单有效的骨髓间充质干细胞的分离纯化方法,骨髓间充质干细胞在体外可诱导分化为成骨细胞。