成人骨髓间充质干细胞的鉴定与体外BrdU标记

背景:目前尚未发现骨髓间充质干细胞独有的标志分子,给其鉴定带来一定困难.BrdU标记不存在放射性污染,有研究认为在不受到紫外线照射的条件下,BrdU标记后对细胞功能无损害.目的:探讨成人骨髓间充质干细胞体外鉴定和标记的方法,并观察其生物学特性.设计、时间及地点:细胞观察,于2007-06/12在解放军兰州军区兰州总医院完成.材料:成人骨髓来自5例健康志愿者.BrdU为美国Sigma公司产品.方法:采集成人骨髓10mL,密度梯度法分离单个核细胞,加入含10%胎牛血清的DMEM培养基,调整细胞密度为2×108L-1进行扩增培养.取第3代骨髓间充质干细胞,加入成骨诱导培养基,行碱性磷酸酶染色;加入成脂诱导培养基,行油红O染色;加入终浓度为5,10,15μmol/L BrdU溶液,孵育12,24,48,72,96h后行免疫细胞化学染色.主要观察指标:倒置光学显微镜下观察细胞生长及增殖情况,流式细胞仪鉴定细胞表型,成骨及成脂诱导分化结果.BrdU阳性标记率及标记后细胞生长情况.结果:[1]体外培养的成人骨髓间充质干细胞形态均一,为梭形或纺锤形的成纤维细胞样外观;表达CD44和CD71,不表达CD34和HLA-DR;可定向诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞.[2]大部分骨髓间充质干细胞标记后核抗BrdU染色阳性,随着标记浓度的升高和标记时间的延长,BrdU阳性率逐渐增高,终浓度10μmol/L BrdU标记72h后阳性率达90%以上,且连续传9代均可检测到BrdU阳性细胞.第3代骨髓间充质干细胞90%处于G0/G1期,BrdU标记后88.62%处于G0/G1期,标记前后细胞生长周期无明显变化.结论:通过形态学特征、表面标记和多向分化潜能可以鉴定体外分离培养的细胞为成人骨髓间充质干细胞;BrdU标记可用于成人骨髓间充质干细胞移植入体内后存活、生长和分化的动态示踪观察;BrdU最佳标记浓度和时间分别为10μmol/L和72h.     

密度梯度离心法结合贴壁培养法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞的生物学特性

目的:建立一种体外分离纯化、培养扩增大鼠骨髓间充质干细胞的方法,观察成年大鼠骨髓间充质干细胞的生物学特性。方法:实验于2003-03/2004-05于哈尔滨医科大学组胚教研室完成。①用密度梯度离心法结合贴壁培养法分离纯化成年大鼠骨髓间充质干细胞。②采用倒置显微镜、透射电镜观察,免疫细胞化学法鉴定骨髓间充质干细胞膜抗原和细胞基质蛋白属性。③体外加成骨、成软骨诱导剂,14d分别做碱性磷酸酶组织化学、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色,观察骨髓间充质干细胞的成骨分化及成软骨分化结果。结果:①成年大鼠骨髓间充质干细胞呈均一的成纤维细胞样,具有一般干细胞的超微结构特点。②广泛表达Vimentin,CD29,CD44,不表达CD14,CD34。③加入成骨诱导剂14d后,骨髓间充质干细胞呈多层重叠生长,现碱性磷酸酶强阳性,阳性率为90.5%。④经成软骨诱导后,Ⅱ型胶原免疫组化染色,诱导14d的骨髓间充质干细胞呈现广泛的棕褐色染色,在细胞密集处细胞周围可见黄褐色染色。结论:密度梯度离心结合贴壁培养法能有效分离纯化成年大鼠骨髓间充质干细胞,用此种方法培养的细胞具有骨髓间充质干细胞的一般生物学特性。     

人骨髓间充质干细胞的分离培养及BrdU标记鉴定

背景:骨髓间充质干细胞具有多向分化能力,是目前极具潜力的细胞及基因治疗的靶细胞.目的:拟在体外建立一种分离纯化、培养扩增、标记骨髓间充质干细胞的方法.设计、时间和地点:开放性实验,于2008-03/05在南昌大学第一附属医院烧伤研究所完成.材料:人骨髓间充质干细胞取自临床骨髓穿刺检查正常的住院患者,无血液系统疾病和家族遗传病史,由南昌大学第一附属医院提供.方法:密度梯度离心和贴壁培养相结合,分离纯化骨髓间充质干细胞,并用BrdU标记.主要观察指标:相差显微镜下观察人骨髓间充质干细胞的形态变化;流式细胞仪检测入骨髓间充质干细胞的表面标记以及细胞周期:绘制人骨髓间充质干细胞生长曲线;透射电镜观察人骨髓间充质干细胞的超微结构.结果:密度梯度离心结合贴壁法能分离培养出纯度较高的人骨髓间充质干细胞.流式细胞仪检测入骨髓间充质干细胞CD90,CD29,CD44,CD34,CD45阳性细胞表达分别为98.48%,98.74%,97.41%.0.36%,0.64%.人骨髓间充质干细胞的生长曲线呈S形.透射电镜可见人骨髓间充质干细胞胞质丰富,粗面内质网发达,大量蛋白分泌物.免疫组织化学检测BrdU标记48 h后人骨髓间充质干细胞标记率80%.结论:采用淋巴细胞分离液密度梯度离心和贴壁培养相结合,以获得纯度较高和活性骨髓间充质干细胞,是简便可行的方法:BrdU是一种简单、有效的标记骨髓间充质干细胞的方法.     

密度梯度离心法结合贴壁培养法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞的生物学特性

目的：建立一种体外分离纯化、培养扩增大鼠骨髓间充质干细胞的方法，观察成年大鼠骨髓间充质干细胞的生物学特性。 方法：实验于2003-03／2004-05于哈尔滨医科大学组胚教研室完成。①、用密度梯度离心法结合贴壁培养法分离纯化成年大鼠骨髓间充质干细胞。②采用倒置显微镜、透射电镜观察，免疫细胞化学法鉴定骨髓间充质干细胞膜抗原和细胞基质蛋白属性。③体外加成骨、成软骨诱导剂，14d分别做碱性磷酸酶组织化学、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色，观察骨髓间充质干细胞的成骨分化及成软骨分化结果。 结果：①成年大鼠骨髓间充质干细胞呈均一的成纤维细胞样。具有一般干细胞的超微结构特点。②广泛表达Vimentin，CD29，CD44，不表达CD14，CD34。③加入成骨诱导剂14d后，骨髓间充质干细胞呈多层重叠生长，现碱性磷酸酶强阳性，阳性率为90．5％。④经成软骨诱导后，Ⅱ型胶原免疫组化染色。诱导14d的骨髓间充质干细胞呈现广泛的棕褐色染色，在细胞密集处细胞周围可见黄褐色染色。 结论：密度梯度离心结合贴壁培养法能有效分离纯化成年大鼠骨髓间充质干细胞，用此种方法培养的细胞具有骨髓间充质干细胞的一般生物学特性。     

全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞及其诱导分化

背景:骨髓中的间充质干细胞含量极少,每1×104～1×105个单核细胞中约有1个骨髓间充质干细胞,需要在体外分离、纯化、扩增后才能满足体内移植要求.目的:观察体外分离培养的骨髓间充质干细胞生物学特性及多向分化潜能.设计、时间及地点;细胞学体外观察,于2007-10/2008-12在福建医科大学附属协和医院泌尿外科研究室完成.材料:清洁级雄性近交系SD大鼠30只,由上海斯莱克实验动物有限公司提供.方法:通过全骨髓贴壁法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,待细胞融合至80%～90%胰蛋白酶消化传代.取传至第3代细胞,分别向成骨、成脂方向诱导分化.主要观察指标:倒置相差显微镜下观察细胞形态,流式细胞仪检测其表面标记,茜素红染色检测其成骨能力,油红O染色检测其成脂能力.结果:原代及传代的骨髓间充质干细胞均呈长梭形成纤维细胞样,连续传代10代以上,细胞始终保持旺盛的生长及扩增能力.第3代骨髓间充质干细胞CD90,CD44,CDl06均呈阳性表达,而CD34,CD45,CD11b呈阴性.成骨诱导21 d后,可见大量橘红色矿化结节形成.成脂诱导2周后,可见细胞的胞浆内出现大量红染脂滴. 结论:全骨髓贴壁培养法可大量分离纯化、扩增骨髓间充质干细胞,所获细胞具有间充质干细胞的一般生物学特性,经诱导培养后具有多向分化潜能.     

大鼠骨髓间充质干细胞的培养与鉴定

背景:骨髓间充质干细胞在骨髓中含量极低,体外培养难度较大.体外分离培养纯度高、活力强、生物特性均一的间充质干细胞,对组织工程及细胞的体内、体外实验显得至关重要.目的:建立大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化方法,并进行细胞形态学观察、表面标志物鉴定及多向分化能力检测.方法:通过全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化大鼠骨髓间充质干细胞,进行形态学观察,绘制生长曲线,细胞周期分析,流式细胞仪检测细胞表面标记物,分别向成骨、成脂方向诱导分化.结果与结论:大鼠骨髓间充质干细胞生长以梭形细胞为主,呈放射状排列的细胞集落,细胞生长旺盛,可连续稳定传代10代以上.生长曲线及细胞周期显示骨髓间充质干细胞符合正常细胞生长特征且生长活跃.第3代骨髓间充质干细胞CD44,CD90,CD105均呈阳性表达,而CD34,CD45呈阴性表达.成脂、成骨诱导后,油红O染色、碱性磷酸酶染色、von Kossa法染色和茜素红染色均呈阳性.全骨髓贴壁培养法操作简单,可大量分离、纯化、扩增骨髓间充质干细胞,所获细胞具有间充质干细胞的一般生物学特性,经诱导培养后具有多向分化潜能.实验所用的全骨髓贴壁法法为组织工程提供充足的种子细胞来源具有重要的现实意义.     

体外培养人骨髓间充质干细胞向表皮细胞分化及表皮细胞角蛋白的表达

背景:动物实验已经证实骨髓间充质干细胞体外诱导可分化为表皮细胞.目的:观察体外培养条件下人骨髓间充质干细胞向表皮细胞的分化及表皮细胞角蛋白表达.方法:采用Ficoll-Paque密度梯度离心法提取人胚胎骨髓间充质干细胞,以免疫细胞化学及流式细胞仪测定细胞表面CD33、CD34标记物进行鉴定.取第3代骨髓间充质干细胞以30%条件培养基诱导其向表皮细胞分化,免疫细胞化学染色观察诱导后细胞形态与细胞角蛋白水平变化.结果与结论:采用密度梯度离心法从人胚胎骨髓中分离培养得到细胞成分均一的骨髓间充质干细胞.骨髓间充质干细胞经体外诱导后,出现细胞角蛋白19表达阳性细胞,说明骨髓间充质干细胞在体外诱导后可能发生向表皮细胞分化.     

骨髓间充质干细胞增殖分化能力可随鼠龄增长而下降

背景：骨髓间充质干细胞是理想的组织工程种子细胞来源,但是不同年龄的骨髓间充质干细胞体外增殖、分化特点有很大差异,有关年龄与骨髓间充质干细数量的关系目前尚缺少系统研究。目的：观察不同鼠龄大鼠骨髓间充质干细胞诱导分化活性的差异。方法：通过全骨髓贴壁培养法,体外分离、纯化、扩增 SD 大鼠骨髓间充质干细胞,倒置相差显微镜观察形态学特点,流式细胞仪检测细胞表面标记,体外诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞、成软骨细胞分化并鉴定。取第3代2,4,6,8,12周龄和10,12月龄大鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导1,2,3周,采用酶联免疫法检测骨钙素含量。结果与结论：体外培养的骨髓间充质干细胞为贴壁生长,长梭形成纤维细胞样细胞,可增殖形成克隆;流式细胞仪分析骨髓间充质干细胞CD29、CD90表达阳性,CD45表达阴性,CD44部分表达;经成骨分化诱导,细胞碱性磷酸酶染色阳性,茜素红染色阳性;经成软骨分化诱导,阿利辛蓝染色阳性,可见通过全骨髓贴壁法可成功地从大鼠骨髓中分离出骨髓间充质干细胞。通过不同鼠龄骨髓间充质干细胞诱导成骨分化后骨钙素含量测定得出骨髓间充质干细胞增殖分化能力随鼠龄的增长而下降。     

体外培养人骨髓间充质干细胞向表皮细胞分化及表皮细胞角蛋白的表达

背景：动物实验已经证实骨髓间充质干细胞体外诱导可分化为表皮细胞。目的：观察体外培养条件下人骨髓间充质干细胞向表皮细胞的分化及表皮细胞角蛋白表达。方法：采用Ficoll-Paque密度梯度离心法提取人胚胎骨髓间充质干细胞,以免疫细胞化学及流式细胞仪测定细胞表面CD33、CD34标记物进行鉴定。取第3代骨髓间充质干细胞以30%条件培养基诱导其向表皮细胞分化,免疫细胞化学染色观察诱导后细胞形态与细胞角蛋白水平变化。结果与结论：采用密度梯度离心法从人胚胎骨髓中分离培养得到细胞成分均一的骨髓间充质干细胞。骨髓间充质干细胞经体外诱导后,出现细胞角蛋白19表达阳性细胞,说明骨髓间充质干细胞在体外诱导后可能发生向表皮细胞分化。     

全骨髓贴壁并差速传代分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞:与密度梯度离心法的比较

背景:目前国内外分离纯化骨髓间充质干细胞有两种主要方法;密度梯度离心法及全骨髓贴壁法,前者步骤较复杂,后者简单易操作,但纯化效果不理想.目的:在全骨髓贴壁分离骨髓间充质干细胞基础上,并用差速传代消化法,建立大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养纯化方法.方法:全骨髓贴壁培养法分离并差速消化传代大鼠骨髓间充质干细胞,利用间充质干细胞在消化传代过程中较其他骨髓细胞消化悬浮速度快,以及贴壁快的特点,代替密度梯度离心操作来分离纯化间充质干细胞,对其形态学特征进行观察,并与密度梯度离心法比较两种分离培养法的细胞生长增殖情况;观察碱性磷酸酶及油红染色情况,验证骨髓间充质干细胞的分化能力;检测细胞表面标记物,验证免疫特性及检测其纯度.结果与结论:全骨髓贴壁培养法分离并差速传代大鼠骨髓间充质干细胞,流式细胞鉴定、成骨成脂肪培养结果显示其细胞免疫特性、纯度、分化能力与密度梯度离心法无显著差异,但细胞活力,增殖能力有明显提高.     

体外诱导脐血间充质干细胞分化为成骨细胞

背景:脐血间充质干细胞在特定的诱导条件下可以分化成为多种类型的细胞,易于体外培养扩增,但脐血中间充质干细胞的建立时间长、频率低是其主要缺点.目的:体外分离培养脐血间充质干细胞,并诱导其向成骨细胞方向分化.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008 06/2009 01在青岛大学医学院试验室完成.材料:脐血取自足月正常分娩的产妇,由青岛市立医院妇产科提供.方法:采用percoll密度梯度法体外分离培养人脐血间充质干细胞,当细胞汇合90%单层细胞后胰蛋白酶消化传代.取第3代脐血间充质干细胞,以1×106密度接种,当细胞达50%～60%融合时,加入含0.1 μmol/L地塞米松、10mmol/L β-甘油磷酸钠、50 μmol/L维生素C的DMEM成骨细胞诱导液;对照组加入普通低糖DMEM培养液培养.主要观察指标:倒置显微镜下观察细胞生长及增殖情况,流式细胞仪检测细胞表面标志物的表达,细胞生长曲线分析,透射电镜观察细胞超微结构,von Kossa染色和碱性磷酸酶染色检测向成骨细胞诱导分化情况.结果;原代培养的脐血间充质干细胞形态与骨髓间充质干细胞相似,传代后细胞形态均一,呈梭形旋涡状排列.第3代脐血间充质干细胞高表达CD29,CD44,CD13,不表达CD34.生长潜伏期为两三天,第三四天进入对数增殖期,1个月后进入平台期.胞核呈类圆形或不规则形,核膜清晰,有一两个核仁,染色质较粗,胞质中细胞器丰富,细胞表面有微绒毛.第3代脐血间充质干细胞成骨诱导7 d后逐渐汇合呈铺路石状,14 d后von Kossa染色出现钙化结节,碱性磷酸酶染色呈阳性;对照组未见钙化结节,碱性磷酸酶染色呈阴性.结论:采用percoll密度梯度法可成功从人脐血中分离出间充质干细胞,并在体外诱导分化为成骨细胞.     

应用密度梯度离心和贴壁筛选法分离免骨髓间充质干细胞

背景:特定条件下,骨髓间充质干细胞可向成骨细胞、成软骨细胞等细胞分化.但骨髓中间充质干细胞含量极低,体外如何获取、纯化并使其高效快速增殖是组织工程技术应用和推广的前提.目的:优化获取兔骨髓间充质干细胞并对其进行纯化、鉴定,同时对其生物学性状进行观察.设计、时间和地点:观察性实验,于2005-09/2006-07在同济医学院实验动物中心完成.材料:兔龄2个月雌性新西兰纯种大耳白兔1只,用于间充质干细胞取材及原代培养.方法:采用密度梯度离心法、贴壁筛选法并结合传代对抽取的骨髓液进行纯化.首先将培养瓶中的培养液吸出,加PBS后再加入2.5 g/L胰酶约3.0 mL,置于37℃培养箱中,两三分钟后在倒置显微镜下观察细胞形态,当细胞胞质回缩,细胞变瘦长,细胞间隙增大,同时有少量脱肇的圆形细胞时可终止消化,加入含血清的L-DMEM完全培养基即可.按1.0X 108L-1的密度接种到一次性塑料培养瓶中进行培养.主要观察指标:间充质干细胞的形态、超微结构和表面标志物的表达;第1,3,5,8,10代细胞的增殖情况,并绘制出生长曲线.结果:①经密度梯度离心法、贴壁筛选法并结合传代方法所得的间充质干细胞很纯,第3代和第5代细胞形态单一,细胞排列具有典型的漩涡状结构.②透射电镜观察显示间充质干细胞核大,以圆形或类圆形为主,胞核比例大,细胞器少,为低分化细胞.③传代培养的间充质干细胞生长曲线呈S型,第1,3,5代细胞增殖能力强,细胞生长旺盛,而第8,10代细胞增殖明显减弱.④所分离培养的细胞表达CD44、CD90,不表达CD34,电镜观察为低分化细胞.结论:分离培养的细胞为间充质干细胞且成分单一,具有干细胞特性,第3代和第5代细胞很纯且其增殖能力强.     

脐血间充质干细胞分离扩增及向成骨与脂肪细胞的分化

背景：和骨髓间充质干细胞相比，脐血间充质干细胞取材方便，其免疫原性较低，能耐受更大程度上的HLA配型不符，分离出的间充质干细胞纯度更高。目的：分析新生儿脐血间充质干细胞体外分离、纯化、扩增，以及向成骨及脂肪细胞定向诱导分化的方法与条件。设计、时间及地点：观察性实验，于2004-09/2005-11在四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室，干细胞与组织工程研究室完成。材料：胎龄37～40周的新生儿脐血。方法：以Ficoll-HyPfdque淋巴细胞分离液密度梯度法、沉降红细胞后密度梯度法及CD34^＋免疫磁珠负选法分离脐血单个核细胞。将分离获得的单个核细胞采用L-DMEM培养基＋体积分数0．1胎牛血清或Mesencult^TM培养基＋体积分数0．1胎牛血清进行间充质干细胞培养传代，获得的第3代集落生长细胞进行流式细胞仪表面抗原测定，并诱导其向成骨、脂肪细胞分化。主要观察指标：①脐血间充质干细胞的鉴定。②经茜素红染色及油红染色证实其诱导分化。结果：经沉降红细胞后密度梯度离心分离的单个核细胞，使用Mesencult^TM培养基＋体积分数0．1胎牛血清培养成功率高，第3代可出现明显的集落生长，而另两种方法分离培养的细胞则难以形成集落；集落细胞表面抗原测定表达CD29，CD59，D71，不表达CD34，CD45及HLA-DR等分子。成骨定向诱导分化的集落细胞经茜素红染色胞浆中出现有大量的钙沉积，成脂肪定向诱导分化的集落细胞油红染色示胞浆充满油滴空泡。结论：使用Mesencult^TM培养基＋体积分数0．1胎牛血清培养由甲基纤维素沉降脐血红细胞后密度梯度离心分离的单个核细胞培养成功率高，第3代可出现明显的集落生长。经诱导后可分化为成骨细胞和脂肪细胞。     

中药诱导大鼠骨髓间质干细胞分化的实验

背景体外定向诱导分化可使骨髓间质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)转化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨、肌肉细胞、神经元样细胞等,而中药是否能对大鼠骨髓间质干细胞有诱导分化作用呢?目的研究SD大鼠MSCs体外扩增培养及用中药定向诱导分化为神经元样细胞的功效.设计以细胞为研究对象,重复观察测量,探索性研究.单位一所医学院病理生理学教研室.材料实验用骨髓取自经检验健康的SD雄性大鼠.方法通过贴壁法分离大鼠MSCs,体外扩增培养,流式细胞仪检测其表面抗原表达,多种中药成分定向诱导MSCs分化为神经元样细胞.光镜下观察细胞形态,免疫细胞化学法检测神经细胞特异性抗原标志.主要观察指标①MSCs分离和扩增结果.②MSCs表面抗原及神经元样细胞鉴定结果.结果大鼠MSCs可通过贴壁法成功分离并可在体外大量扩增.流式细胞仪检测结果显示CD14,D11α,D34,D38,D45,D80,D86为阴性,D29,D44,D90,D105,D166呈阳性.黄芪、天麻、人参、当归、脑新舒、人参蜂王浆等多种中药诱导1～3 h后大部分MSCs转变为神经元样细胞,出现胞体和突起,免疫细胞化学染色神经元特异性烯醇酶、巢蛋白呈阳性,胶质纤维酸性蛋白阴性.结论SD大鼠骨髓间质干细胞是具多向分化潜能的细胞,具有较强的增殖、自我更新能力.在适宜的诱导条件下,可以分化为神经元样细胞.     

富血小板血浆及带血管筋膜在组织工程骨血管化中的作用组织影像学观察

背景：富血小板血浆中的多种生长因子及带血管筋膜是否具有促进骨再生及血管化作用尚在争论之中。目的：拟从组织影像学角度评价富血小扳血浆及带血管筋膜对骨髓基质干细胞／脱钙骨基质复合的组织工程骨血管化作用效果。设计、时间及地点：单一样本观察及动物同体对照实验，于200410／200711在青岛大学医学院附属医院中心实验室完成。材料：1-12月龄健康杂种犬12只，体质量20～25妇，雌雄各半。方法：④采用密度梯度离心法从犬骨髓中分离骨髓基质干细胞，体外贴壁培养扩增、成骨诱导培养。取杂种犬的股骨制备脱钙骨基质，并与骨髓基质干细胞复合。②将每只犬的背部分为4个区，A，B区，植入加富血小板血浆的骨髓基质干细胞，脱钙骨基质复合体，C，D区，仅植入骨髓基质干细胞／脱钙骨基质复合体。A，C区植入物用背阔肌带血管肌筋膜包囊；B，D区植入物用背部不带血管的浅筋膜包裹。分别在4，8，12周各取4只，雌雄各半，麻醉后处死取标本。主要观察指标：④采用倒置相差显微镜观察骨髓基质干细胞形态，四甲基偶氮唑盐法测定细胞生长曲线。②行改良钙钴法碱性磷酸酶染色，VonKossa法、茜素红法，钙结节染色观察诱导成骨细胞形态特征。③应用倒置相差显微镜、扫描电镜观察复合体的结构。④行大体标本、X射线数字影像及组织学观察评价。结果：①诱导成骨分化的骨髓基质干细胞分泌的碱性磷酸酶及钙结节染色均呈阳性。②骨髓基质干细胞和成骨诱导细胞的生长曲线呈典型的S形。⑨同种异体脱钙骨基质与骨髓基质干细胞复合培养后，细胞上架率高，生长状态好，增殖迅速，能分泌大量细胞外基质。④各时间点A，B，C区在成骨的骨量、骨光学密度、血管化程度等方面均明显优于D组（P〈0．05）。结论：经组织影像学观察证实，富血小板血浆和带血管肌筋膜均能促进组织工程骨的成骨和血管化，且两者具有协同作用。     

体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌细胞定向分化的研究

目的 探讨心肌细胞对骨髓间充质干细胞(MSCs)向心肌细胞定向诱导分化的作用及其生物学特性.方法 取大鼠四肢骨髓,用细胞分离液通过密度梯度离心分离MSCs,并将MSCs进行原代培养和传代培养,将传2代MSCs用5-溴脱氧尿核苷(BrdU)进行标记.采用胰蛋白酶消化法取乳鼠心尖部心肌细胞进行培养,并与标记的MSCs混合培养,光镜下观察其动态变化,并于第3日行免疫组化染色,第5日行电镜观察.结果 原代和传代的MSCs增殖迅速,其阳性率达(90.34±2.31)%,与平行对照组[(4.07±1.35)%]比较差异有统计学意义(P<0.01).与心肌细胞混合后,光镜下观察MSCs形态出现明显的变化,第3日BrdU标记阳性的MSCs胞质中肌动蛋白(actin)表达阳性.电镜下观察原始细胞内出现了不规则的肌小节样结构.结论 心肌细胞与MSCs的接触可有效诱导MSCs向心肌细胞定向分化.     

应用免疫磁珠负选法分离与纯化小鼠骨髓间充质干细胞

目的：拟建立体外分离纯化小鼠骨髓间充质干细胞的新方法，从而得到高纯度的骨髓间充质干细胞。 方法：实验于2002—09／2005-03在解放军第二军医大学附属长海医院烧伤科实验室完成。①选取清洁级7d龄FVB／N小鼠15只，利用免疫磁珠法（CD11b负选）从小鼠的骨髓细胞中分离纯化骨髓间充质干细胞：颈椎脱臼处死后无菌条件下取出小鼠双侧股骨，消毒离断后去除上清及脂肪层，吹打成单细胞悬液后接种于培养基中。贴壁细胞达到90％左右融合后，用胰蛋白酶和乙二胺四乙酸进行消化，将悬浮的细胞与CD11b抗体避光反应2min。移入已预置入磁场的LD管，不加压通过，收集管中的细胞成分，用培养基重悬并吹打成单细胞悬液后以1×10^9L^-1-2×10^9L^-1的密度接种于培养基中培养。②培养传代后流式细胞仪检测细胞周期、表面标记物，并利用诱导剂观察其定向诱导为脂肪细胞和成骨细胞的能力。 结果：①细胞形态学观察：免疫磁珠法获得的细胞几乎无圆形细胞夹杂。贴壁率高。形态单一呈典型成纤维样、漩涡状生长。体外增殖迅速。②细胞生长曲线绘制情况：细胞贴壁后一两天为细胞生长缓滞期，之后进入对数增长期，六七天后进入平台期。③细胞周期分析结果：G0／G1期细胞约86％，S＋G2＋M期约14％。④细胞袭面标记物检测结果：第3代骨髓间充质干细胞3％表达CD45，68．7％表达CD29，3％表达CD34，89．6％表达CD105。⑤骨髓间充质干细胞向脂肪细胞与成骨细胞定向分化情况：在地塞米松、1-甲基-3-异丁基-黄嘌呤、吲哚美辛等诱导剂作用下，脂肪细胞＋成骨细胞诱导组细胞第5天开始油红O染色显示细胞核呈蓝色，细胞内脂滴呈橙色；在β-甘油磷酸钠、2-磷酸-抗坏血酸等诱导剂的作用下，第10天开始AKP染色显示细胞内有致密颗粒形成，Von Kossa染色显?     

兔外周血间充质干细胞的体外分离培养及诱导成骨

背景:研究证明外周血中存在间充质干细胞,但含量极少.目的:拟从兔外周血中提取间充质干细胞,并诱导其向成骨细胞分化.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-06/12在山东省立医院中心实验室完成.材料:新两兰大白兔6只,购自山东省农科院.α-MEM培养基、L-DMEM培养基为Hyclone公司产品.方法:每隔2 d从兔背部不同部位切去3 cm×3 cm的全层皮肤(保留背部肌层),所切皮肤做原何移植后包扎,每只兔连续创伤4次.分别于创伤前及末次创伤1周后从股静脉取外周血,采用密度梯度离心法获取间充质干细胞,设立2组,分别加入含体积分数为10%胎生血清的α-MEM培养基或L-DMEM培养基.细胞传至第2代以1×105cm2密度接种于12孔板,加入含成骨诱导剂的H-DMEM培养液进行成骨诱导.主要观察指标:创伤前后细胞形态观察,成纤维样细胞集落形成率,成骨诱导效果.结果:创伤前所获得的细胞首次换液后,未见有梭形细胞贴壁;创伤后所获得的细胞接种24 h即可见有短梭形及多角形细胞贴壁,五六天后出现细胞集落.与L-DMEM培养基组比较,α-MEM培养基组外周血成纤维样细胞集落形成率明显升高(P<0.05).外周血间充质干细胞成骨诱导后,呈梭形、三角形或多角形,有突起,可见两三个核仁和细胞分裂相,增殖速度缓慢,诱导7 d后碱性磷酸酶阳性率达80%以上,诱导21 d后茜素红染色形成钙结节.结论:皮肤损伤刺激后可成功从兔外周血中获取间充质干细胞,且具备成骨分化特性,α-MEM培养基较L-DMEM培养基更适合外周血间充质干细胞的体外生长.     

人脐带间充质干细胞体外分化成骨细胞的研究

目的探讨人脐带源间充质干细胞(HUC-MSCs)定向诱导分化为成骨细胞的能力。方法人脐带经胶原酶和胰蛋白酶消化后于DMEM/F12培养基中培养,通过传代作纯化和扩增;采用倒置显微镜及电镜观察细胞形态,细胞计数绘制细胞生长曲线,流式细胞仪检测细胞免疫表型及细胞周期;以含有成骨细胞诱导剂(地塞米松、β-甘油磷酸钠、抗坏血酸)的DMEM/F12培养基对传至第3代的细胞定向诱导分化为成骨细胞,并对诱导后细胞作成骨细胞检测。结果经酶消化后,细胞贴壁生长,主要呈"成纤维样",但体积较大、形状不规则、细胞质突起多,细胞核大而疏松,核仁明显;第1、3、5、7代细胞生长曲线基本相同;细胞表面表达CD105、CD90、CD44、CD29及CD13,不表达CD34、CD45、HLA-DR;培养至第4代的细胞约72.724%的细胞处G1期、S期的细胞仅占18.069%,第6代时G1期细胞约为83.875%、S期为9.606%左右;细胞经成骨细胞诱导分化后,细胞形态发生改变,线粒体明显增多,出现较多的基质小泡、髓样体和空泡状结构,碱性磷酸酶染色显示呈强阳性,茜苏红染色和Von-Kossa染色显示细胞有钙盐沉积并形成钙结节。结论人脐带中分离及培养扩增细胞具有MSCs的基本特性,具有分化为成骨细胞的能力。     

离心管贴壁细胞对人脐血单个核细胞体外培养成功率的影响

背景：在常规的脐血间充质干细胞密度梯度离心分离过程中,离心管壁有大量单个核贴壁细胞,这些早期的贴壁细胞是否与脐血间充质干细胞的体外培养成功率低存在一定的联系呢？目的：比较4种方法分离人脐血单个核细胞的体外培养成功率,观察离心管贴壁细胞对人脐血单个核细胞体外培养成功率的影响。方法：取足月健康顺产新生儿脐血36份,随机分为4组,每组9份,于采集后6h内分别采用甲基纤维素沉降法（A组）、密度梯度离心分离法（B组）、甲基纤维素联合密度梯度离心分离法（C组）、甲基纤维素联合改良密度梯度离心分离法（D组）分离出单个核细胞,锥虫蓝染色检测细胞活力,用细胞计数板进行细胞计数,调整细胞浓度为1×109L-1～2×109L-1,接种于含体积分数为10%胎牛血清的低糖DMEM培养基中培养和传代,相差显微镜下观察脐血单个核细胞的形态。收集第3代脐血单个核细胞,采用细胞计数板进行计数,计算扩增倍数,采用流式细胞仪鉴定细胞免疫表型。结果与结论：36份脐血中,成功分离33份脐血单个核细胞,B组有3份分离失败。33份中共22份原代培养中出现大量贴壁细胞,其中A组8份,B组2份,C组5份,D组7份。9份（27%）培养出能融合且可稳定传代的成纤维样细胞,其中A组3份,B组0份,C组1份,D组5份。4组脐血单个核细胞在原代培养5～7d后均可见数量不等的贴壁细胞,呈梭形成纤维样细胞或（和）圆形巨核样细胞。A组与D组于原代培养三四周可见成纤维样细胞集落形成,细胞形态与骨髓间充质干细胞相似,呈较均一的长梭形,可稳定培养至60～90d形态无明显变化。流式细胞仪免疫检测,第3代脐血单个核细胞不表达或弱表达CD34、CD45和CD106等造血干细胞和内皮细胞标志,但显著表达CD29、CD105等间充质干细胞表面标志。结果显示离心管贴壁细胞可显著提高脐血单个核细胞的体外培养成功率,而甲基纤维素联合改良的密度梯度离心分离法,可充分回收离心管贴壁细胞,利于脐血单个核细胞的体外扩增和稳定传代。