脱细胞松质骨/骨形态发生蛋白-2/胶原海绵重建兔上颌窦外侧骨壁伴黏膜缺损实验研究

目的利用胶原海绵及复合骨形态发生蛋白-2（BMP-2）的脱细胞松质骨,原位修复兔上颌窦外侧骨壁伴黏膜缺损,观察BMP-2原位诱导成骨及上颌窦外侧骨壁、黏膜修复状况。方法制备复合BMP-2的片状脱细胞松质骨,单侧以生物蛋白胶固定薄层胶原海绵作为修复材料,未加BMP-2材料用做对照。手术去除兔上颌窦外侧骨壁及附着黏膜,胶原海绵侧面向窦腔,原位修复缺损,术后3个月进行大体标本及病理切片观察,了解其修复效果及成骨情况。结果兔术后健康状况良好,术后3个月大体观察兔上颌窦外侧壁缺损修复良好,窦腔内侧面有新生黏膜覆盖。病理学检查发现实验组脱细胞松质骨内有新骨形成,对照组仅有纤维结缔组织长人。结论BMP-2具有诱导成骨能力,胶原海绵可用作黏膜再生支架,脱细胞松质骨／BMP-2／胶原海绵,可用于修复上颌窦局部骨壁伴黏膜缺损。     

骨形态发生蛋白2基因转染对人骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

目的：评价携带骨形态发生蛋白2基因的重组腺病毒（Ad-BMP-2）转染人骨髓间充质干细胞（MSC）对其成骨分化的影响。方法：由健康青年男性髂骨抽取骨髓培养MSC，BMP-2基因转染后，用RT-PCR及免疫组化染色证实转基因MSC的BMP-2基因表达，原位杂交及免疫组化染色检测转染后细胞成骨活性，并进行透射电镜观察。结果：转染后细胞稳定表达BMP-2基因，核心结合因子a1、骨钙素、骨桥素、Ⅰ型胶原、碱性磷酸酶呈阳性表达，透射电镜显示细胞外有胶原分泌和钙盐沉积。结论：Ad—BMP-2基因转染可以提高MSC的体外成骨能力。     

基因沉默组织型转谷氨酰胺酶抑制SaOS-2细胞成骨分化

目的 研究组织型转谷氨酰胺酶（tissue transglutaminase, TG2）是否参与人SaOS-2细胞系成骨分化过程。方法 使用携带短发夹RNA（short hairpin RNA, shRNA）的慢病毒转染SaOS-2细胞以敲减TG2表达，以SaOS-2细胞及转染了含阴性对照shRNA病毒的SaOS-2作为对照组，分别进行体外成骨诱导培养，并进行以下检测：1）诱导14 d后各组矿化情况（茜素红染色），2）诱导4 d、7 d后碱性磷酸酶活性及I型胶原、骨钙素、骨形态发生蛋白-2（BMP-2）的mRNA表达，并与诱导前的表达水平相比较。结果 SaOS-2细胞组及转染阴性对照shRNA组在体外成骨诱导过程中I型胶原、骨钙素、BMP-2的mRNA表达和ALP活性逐渐增加，14 d时形成明显矿化结节，而TG2敲减后的SaOS-2细胞在诱导14 d时矿化水平显著低于对照组，诱导7 d时ALP活性及I型胶原、骨钙素、BMP-2的mRNA表达水平显著低于对照组。结论 组织型转谷氨酰胺酶参与SaOS-2细胞体外成骨分化及矿化。     

富血小板血浆对骨髓间充质干细胞向成骨细胞定向分化的影响

目的 观察富血小板血浆（platelet-rich plasma,PRP）对兔源骨髓间充质于细胞（bone mesenchymal stem cells,BMSCs）定向分化为成骨细胞的作用及机制. 方法 离心法分离兔骨髓后,体外培养BMSCs,体积分数5％和10％的PRP与BMSCs共培养,观察BMSCs诱导分化过程中茜素红染色阳性率,应用酶标仪检测碱性磷酸酶（alkaliphosphatase,ALP）活性,应用ELISA法检测BMSCs诱导分化过程中骨钙素（osteocalcin,OCN）及结缔组织生长因子（connective tissue growth factor,CTGF）的含量,应用real time-PCR检测成骨相关基因CTGF、ALP、成骨细胞核心结合因子α1（core-binding factor alpha 1,Cbf-α1）、兔Ⅰ型胶原（Col-Ⅰ）和OCN的表达. 结果 BMSCs诱导分化后细胞茜素红染色阳性率、ALP活性、OCN及CTGF含量升高,CT-GF、ALP、Cbf-α1、Col-Ⅰ和OCN的mRNA表达增加. 结论 PRP可促进BMSCs向成骨细胞分化,可能与PRP促进BMSCs中CTGF、ALP、Cbf-α1、Col-Ⅰ和OCN表达有关.     

兔骨髓间充质干细胞向成骨方向的诱导分化及体内应用

目的：研究经矿化诱导的兔骨髓间充质干细胞(MSC)在裸鼠体内的成骨潜能。方法：分离并培养兔MSC,矿化诱导,观察MSC的形态学改变及碱性磷酸酶（ALP）活性。将诱导后的MSC-去抗原牛松质骨复合体植入裸鼠背部皮下,3 d后取材,行组织学观察。结果:经矿化诱导后,MSC的形态由长梭形向多角形和三角形转化,ALP组织化学染色阳性,活性明显增高。MSC-去抗原牛松质骨复合体植入裸鼠后3 d,组织学见细胞均匀贴附于骨小梁表面,伸展良好,未见未贴壁细胞及外源性纤维组织、血管长入。结论：经矿化诱导的MSC向成骨细胞方向分化和增殖,经观察MSC-去抗原牛松质骨复合体在裸鼠体内可成活并增殖。     

骨形态发生蛋白-2、-3对胚胎小鼠椎间盘细胞的成软骨及成骨作用

目的探索成骨作用的骨形态发生蛋白-2（BMP-2）及抑制成骨作用的骨形态发生蛋白-3（BMP-3）对胚胎小鼠椎间盘细胞
的成软骨及成骨作用,为BMPs临床治疗椎间盘相关疾病提供实验依据。方法运用腺病毒介导的BMP-2和BMP-3在胚胎小
鼠椎间盘细胞中表达,RT-PCR检测Ⅰ型胶原（ColⅠ）、Ⅱ型胶原（ColⅡ）、蛋白多糖（ACAN）、骨钙素（OC）、骨保护素（OPG）和
骨桥蛋白（OPN）成软骨及成骨相关指标mRNA水平的表达,甲苯胺蓝染色检测软骨基质的表达,碱性磷酸酶（ALP) 读数及
ALP染色检测ALP的活性。结果BMP-2和BMP-3表达对于椎间盘纤维环（AF）细胞的成软骨和成骨均没有作用。对椎间盘
髓核（NP）细胞的软骨相关指标ColⅠ、ColⅡ、ACAN mRNA的表达同样没有影响,但可促进NP细胞的成骨,其中BMP-2 和
BMP-3均可促进OC mRNA的表达升高,而仅BMP-2可促进其OPG和OPN的mRNA表达升高。甲苯胺蓝染色证明BMP-2和
BMP-3对椎间盘细胞软骨基质分泌的影响并不显著。NP细胞在BMP-2和BMP-3腺病毒感染后ALP活性明显增强,在AF细
胞中则未观察到这种变化。结论BMP-2和BMP-3均可促进胚胎小鼠NP细胞的成骨作用,但对AF细胞的成骨及成软骨作用
及对NP细胞的成软骨作用没有影响。
     

转化生长因子-?茁1促进骨形态发生蛋白9诱导间充质干细胞成骨分化

目的：探讨转化生长因子?茁1（transforming growth factor-?茁1,TGF-?茁1）在骨形态发生蛋白9（bone morphogenetic protein 9,BMP9）诱导间充质干细胞（mesenchymal stem cell,MSC）成骨分化过程中的作用。方法：应用鼠MSC C3H10T1/2,以重组腺病毒法将BMP9导入,施加TGF-?茁1处理,建立BMP9联合TGF-β1诱导MSC成骨分化模型。改良SEAP化学发光法检测碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）活性;茜素红S染色进行钙盐沉积检测;实时荧光定量PCR检测成骨相关基因Ⅰa2型胶原（collagenⅠa2,COLⅠa2）、骨桥素（osteopotin,OPN）、骨钙素（osteocalcin,OCN）的mRNA转录表达水平,免疫细胞化学法检测细胞内OPN、OCN表达变化。荧光素酶报告基因法检测信号通路的Smad水平。结果：TGF-?茁1与BMP9联合处理较BMP9单独处理能更早更多地提高ALP活性和引起钙盐沉积（F处理=18 782.10,P=0.000）,持续处理达17 d后不再显示明显差异,TGF-?茁1单独处理与对照组间无明显差异（F=1.03,P=0.318）。TGF-?茁1与BMP9联合处理较BMP9单独处理可使COLⅠa2、OPN、OCN mRNA转录水平明显增高（COLⅠa2的F处理=250.30,P=0.000;OPN 的F处理=795.64,P=0.000;OCN的F处理=206.55,P=0.000）,COLⅠa2增高发生较早和显著（F=250.30,P=0.000）;细胞内OPN、OCN蛋白阳性表达显著增强。TGF-β1联合BMP9处理能刺激信号通路相应的Smad荧光素报告活性（?字2=32.84,P=0.000）。结论：在BMP9诱导MSC成骨分化中,联合应用TGF-?茁1具有促进成骨作用,BMP9与TGF-?茁1在成骨分化中可能存在互补效应。     

异种脱蛋白松质骨载体的制备及性能评价

目的研究探讨异种脱蛋白松质骨性能,以制备综合性能优异的骨组织工程载体材料。方法我们将取材于成年猪股骨远端松质骨通过理化方法制作成脱蛋白松质骨载体,并对载体形态结构、组成成分、载体与种子细胞黏附及生长增殖情况以及生物力学特性进行检测分析。同时将载体材料复合自体骨髓间充质干细胞和骨形态生长因子植入成年山羊横突间进行组织工程化成骨融合,观察成骨情况,并通过免疫酶组织染色方法检测异种脱蛋白松质骨的免疫原性。结果脱蛋白松质骨具有天然网状孔隙结构,其无机成分为羟基磷灰石,有机成分为Ⅰ型胶原,力学性能保存良好,有良好的细胞相容性,免疫原性检测阴性。异种脱蛋白松质骨复合rhBMP-2和MSCs植入体内后多点成骨,效果满意。结论异种脱蛋白松质骨是一种良好的载体材料。     

LncRNA AK051397在BMP-2诱导的C2C12成骨分化中的作用

目的研究骨形态发生蛋白2（bone morphogenetic protein-2,BMP-2）诱导后表达上调的LncRNA AK051397在C2C12成骨分化过程中的作用。方法 BMP-2诱导C2C12成骨分化过程,实时定量PCR技术与碱性磷酸酶（ALP）染色检测成骨相关指标。对C2C12细胞在BMP-2诱导下,成骨分化过程中的LncRNAs表达变化进行芯片分析（ArrayStar LncRNA Array）,筛选出表达明显上调的LncRNAs,最后采用siRNA干扰的方法下调LncRNAs表达后分析其对成骨分化过程的影响。结果 BMP-2诱导C2C12成骨分化过程中,成骨指标ALP、SPT增高,成肌指标MYOG降低。芯片结果表明,LncRNA AK051397在BMP2诱导后表达明显上调,处理组与未处理组相比升高4.9倍（P〈0.05）。干扰AK051397后成骨分化指标ALP、SP7表达下降,MYOG表达上升。结论 LncRNA AK051397在C2C12细胞中具有促进成骨分化的作用,同时也具有抑制细胞成肌分化的作用。     

纯钛表面二氧化钛纳米管对人牙周膜干细胞增殖及成骨分化的影响

目的:探讨纯钛表面二氧化钛(TiO2)纳米管改性后对人牙周膜干细胞(human periodontal ligament stem cells,hPDLSCs)增殖?成骨分化能力的影响?评价TiO2纳米管改性作为种植体表面改性方法的作用?方法:将实验组钛片进行阳极氧化TiO2纳米管处理,对照组仅进行抛光处理?将hPDLSCs与两组钛材分别复合培养,检测其增殖及成骨相关蛋白的表达水平?结果:成功在钛材表面制备了多孔?有序?管径约为100 nm的TiO2纳米管;实验组hPDLSCs较对照组1 d的增殖活性及4 d的ALP活性没有明显差异;而4?7 d实验组细胞的增殖活性低于对照组;而7 d?14 d及21 d实验组细胞ALP活性高于对照组;21 d时,实验组 Col-I?OCN?Runx-2的基因表达水平明显高于对照组?结论:通过阳极氧化可在钛材表面制备多孔有序的TiO2纳米管层;且TiO2纳米管能有效促进hPDLSCs在钛表面的骨向分化?     

兔骨髓间充质干细胞复合带部分松质骨的小牛皮质骨成骨实验研究

目的:探讨带部分松质骨的小牛皮质骨材料作为组织工程材料的可能,为该材料的临床应用提供实验依据.方法:分离兔骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs);BMSCs与带部分松质骨的小牛皮质骨复合培养,测定细胞黏附率及细胞毒性,应用电镜观察细胞在骨材料表面生长情况.并饲养3月龄新西...     

可同时释放两种骨形态发生蛋白复合支架的制备

目的 研制一种可同时释放骨形态发生蛋白2 (BMP-2)和骨形态发生蛋白7(BMP-7)的生物活性复合支架,以应用于骨组织工程的研究.方法 分别采用复乳溶剂挥发法和相分离法制备负载BMP-2和BMP-7的聚乳酸/羟基乙酸-聚乙二醇(PGLA-PEG)微球和三维多孔的聚己内酯(PCL)支架.然后采用改良的二氯甲烷熏蒸法将PGLA-PEG微球黏附在PCL支架上,形成同时负载BMP-2和BMP-7的复合支架,并检测BMP-2和BMP-7的缓释效果.将人成骨细胞系hFOB1.19分别种植在复合支架和传统支架中,研究支架上的细胞增殖能力和成骨分化能力.结果 制备的复合支架能同时缓慢地释放BMP-2和BMP-7.细胞培养第10天,复合支架上的细胞活性优于传统支架(P＜0.01),细胞形态正常.复合支架上细胞的碱性磷酸酶和Ⅰ型胶原蛋白、骨钙素、骨桥蛋白3种成骨基因的mRNA水平均高于传统支架(P＜0.05,P＜0.01).结论 成功研制出一种可同时释放BMP-2和BMP-7的生物活性复合支架,并可用于骨组织工程的研究.     

人脱落乳牙牙髓干细胞与人恒牙牙髓干细胞成骨分化及破骨能力的差异

目的比较处于生理性根吸收时期的自然脱落乳牙牙髓干细胞（SHED）和恒牙牙髓干细胞（DPSCs）的成骨分化及破骨能
力,探讨两者在成骨和破骨相关分子的表达情况。方法体外分离、培养和纯化处于生理性根吸收时期的自然脱落乳牙牙髓干
细胞与恒牙牙髓干细胞;两种干细胞在成骨诱导14 d 和21 d,分别进行ALP染色、茜素红染色,并通过Real-time PCR检测
SHED和DPSCs矿化诱导后的成骨与破骨相关基因表达。结果倒置显微镜下观察,SHED和DPSCs形态均为长梭形;两种干
细胞经矿化诱导后,茜素红染色可见SHED的矿化结节计数多于DPSCs（P<0.05）,SHED的ALP活性亦强于DPSCs（P<0.05）。
RT-PCR检测结果显示,经矿化诱导后两种干细胞均表达成骨与破骨相关基因Runx2、OCN、ALP、OPG和RANKL,但DPSCs的
Runx2、OCN 和ALP的表达水平均低于SHED（P<0.05）,且SHED反应细胞破骨/成骨能力的RANKL/OPG 的比值显著高于
DPSCs（P<0.05）。结论与DPSCs相比,SHED不仅具有较强的成骨分化能力,还兼有较强的破骨能力,为SHED参与生理性根
吸收骨改建的调控机制提供实验依据。
     

大鼠骨髓间充质干细胞的分离冻存及向成骨细胞和软骨细胞诱导分化

目的 建立大鼠骨髓间充质干细胞（MSC）体外分离、纯化、增殖、冻存的方法,并观察其体外分化为成骨细胞及软骨细胞的潜能活性.方法 取SD大鼠的股骨及胫骨,冲取骨髓液,采用密度梯度离心法结合贴壁培养法以及单独用贴壁培养法分离纯化MSC,增殖,并测定其生长曲线.MSC在12.5%DMSO条件下经液氮冻存半年复苏,测其存活率.对第3代大鼠MSC进行成骨矿化诱导,测定其碱性磷酸酶（ALP）活性及成骨矿化情况.对第3代大鼠MSC进行诱软骨细胞的诱导分化,测定诱导后的细胞表型情况.结果 大鼠MSC为均一的梭形的成纤维细胞样生长,贴壁及增殖能力强,生长曲线呈S型.MSC于液氮冻存半年后复苏,其存活率为80%.在成骨诱导剂作用下,MSC具有成骨能力,诱导后ALP活性显著提高,并出现矿化结节沉积.在成软骨诱导剂作用下,可见细胞由成纤维细胞样的梭形变为椭圆形及肾形,并分泌异染基质,甲苯胺蓝染色呈阳性,表现为软骨细胞分化特点.结论 获得的SD大鼠MSC生长旺盛,增殖能力强.在特定诱导条件下,大鼠MSC体外可定向分化为成骨细胞及软骨细胞,具有成骨及成软骨分化潜能.     

大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导条件下的成骨特性

目的:探讨大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)在诱导条件下的成骨特性.方法:使用密度梯度法分离成年大鼠骨髓MSCs,以地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素C为成骨诱导剂.结果:形态学表明,MSCs贴壁细胞呈集落生长,有成纤维细胞外观.地塞米松低剂量组诱导7 d后碱性磷酸酶(alkalian phosphatase,ALP)表达明显升高,阳性细胞数为(15.1±2.6)个,而对照组ALP表达较弱,阳性细胞数为(12.0±3.5)个,两组比较P 《0.01.地塞米松成骨诱导剂低剂量组促进MSC成骨,在诱导7d时即出现钙化结节,而对照组未出现;地塞米松低剂量组诱导21 d钙化结节为(9.0±1.7)个,而对照组为(2.0±1.8)个,两组比较P《0.01.结论:低剂量地塞米松成骨诱导剂能诱导MSC向成骨细胞分化,可以为体内骨组织工程提供种子细胞.