紫外线照射前后日本血吸虫尾蚴抗原的初步分析

目的探讨日本血吸虫尾蚴经紫外线(UV)照射后抗原成分的改变。方法日本血吸虫尾蚴经UV(400 μW/cm2)照射1 min 后,取其可溶性抗原经照射尾蚴抗原(UVCA)与未经照射的尾蚴可溶性抗原(NCA)同步进行SDS-PAGE和免疫印迹试验。结果经UV照射后,日本血吸虫尾蚴新出现了Mr 212 000和82 000抗原带,Mr 116 000、26 000和16 000抗原带浓度明显升高;NCA的Mr 67 000分子仅能被UVCA免疫猪血清识别,而不能被感染猪血清识别,Mr 79 000和94 000与免疫猪血清的反应也明显强于感染猪血清。结论UV照射后新出现或含量增加的抗原成分以及仅免疫猪血清所识别的抗原分子可能是照射尾蚴激发高度保护性免疫的主要因素。     

日本血吸虫Mr为8000钙结合蛋白基因的表达及其融合蛋白免疫反应性的评价

目的 将亚克隆在pET32a( )质粒上的日本血吸虫Mr为8000钙结合蛋白(calcium-binding protein，CBP)基因进行表达及蛋白纯化。并对表达产物用Westem blotting及ELISA方法进行免疫反应性的评价。方法 将重组表达质粒pET328( )-CBP转化人宿主菌BL2l中，IPTG诱导表达后超声裂菌，离心后取上清进行SDS-PAGE，观察融合蛋白的表达情况；用金属Ni鏊合物亲和层析树脂(Ni-NTA)柱子纯化目标蛋白；将SDS-PAGE后的蛋白从凝胶转移到聚氟乙烯膜上，分别用6-组氨酸(6-His)抗体、日本血吸虫尾蚴感染6周的兔血清及紫外照射减毒尾蚴免疫的兔血清作一抗进行免疫印迹，将纯化后的融合蛋白作为包被抗原，ELISA法检测正常兔血清及感染兔血清，对该蛋白的免疫反应性作出评价。结果 重组菌株用IPTG诱导后于Mr=29000处有一表达条带，该蛋白与硫氧还蛋白融合表达，带有6-His基团，用抗6-His抗体做免疫印迹有特异性的反应条带，而用尾蚴感染兔血清及紫外照射减毒尾蚴免疫的兔血清做免疫印迹都没有特异性的目标反应带出现，ELISA的结果显示该蛋白与血吸虫感染兔血清没有免疫反应性。结论 CBP蛋白与硫氧还蛋白融合表达后为可溶性蛋白且相对分子质量约为29000，该蛋白与尾蚴感染兔血清及紫外照射减毒尾蚴免疫的兔血清均无免疫反应性，这可能与该蛋白为尾蚴期特异性抗原有关。     

日本血吸虫(云南品系)未成熟卵可溶性抗原免疫保护性观察(摘要)

目的对日本血吸虫云南品系未成熟卵可溶性抗原(solubleimmatureeggsantigen,SIEA)免疫鼠体内日本血吸虫成虫的睾丸及卵黄腺组织进行超微结构观察,探讨SIEA抗日本血吸虫生殖作用机制;观察日本血吸虫云南品系未成熟卵可溶性抗原(SIEA)的抗病免疫作用;观察小鼠经云南品系SIEA免疫后用皖鄂品系血吸虫尾蚴攻击感染,是否也能诱导产生抗病免疫效果.方法制备日本血吸虫云南品系未成熟卵可溶性抗原(SIEA).取适量SIEA加等量福氏佐剂,背部皮下多点注射免疫ICR小鼠后分2组,分别用大理钉螺和华东钉螺逸出的血吸虫尾蚴(30±2)条,攻击感染.于感…     

紫外线照射日本血吸虫尾蚴疫苗保护性抗原的筛选

目的：分析经紫外线照射处理后日本血吸虫尾蚴蛋白的差异性表达，并从中筛选出有效的保护性抗原组分。方法：收集尾蚴，制备抗原，进行SDS-PAGE电泳后，转印至硝酸纤维素膜上，与照射尾蚴免疫血清和正常感染血清分别进行免疫印渍(Western blot)试验，比较两反应条带的差异性，筛选出惟有免疫血清所能识别的特有的抗原组分，并测定其分子量。结果：在童虫抗原中发现一条能被免疫血清所识别的特异性抗原条带，并测得其分子量为75kDa。结论：紫外线照射致弱尾蚴可诱导宿主产生特异性抗体，被该抗体所识别的抗原分子量为75kDa。     

日本血吸虫Mr为8000钙结合蛋白基因的表达及其融合蛋白免疫反应性的评价

目的将亚克隆在pET32a( )质粒上的日本血吸虫Mr为8 000钙结合蛋白(calcium-binding protein, CBP) 基因进行表达及蛋白纯化,并对表达产物用Western blotting 及ELISA方法进行免疫反应性的评价。方法将重组表达质粒pET32a( )-CBP 转化入宿主菌BL21中,IPTG诱导表达后超声裂菌,离心后取上清进行SDS-PAGE,观察融合蛋白的表达情况;用金属Ni鏊合物亲和层析树脂(Ni-NTA)柱子纯化目标蛋白;将SDS-PAGE后的蛋白从凝胶转移到聚氟乙烯膜上,分别用6-组氨酸(6-His)抗体、日本血吸虫尾蚴感染6周的兔血清及紫外照射减毒尾蚴免疫的兔血清作一抗进行免疫印迹,将纯化后的融合蛋白作为包被抗原,ELISA法检测正常兔血清及感染兔血清,对该蛋白的免疫反应性作出评价。结果重组菌株用IPTG诱导后于Mr=29 000处有一表达条带,该蛋白与硫氧还蛋白融合表达,带有6-His基团, 用抗6-His抗体做免疫印迹有特异性的反应条带,而用尾蚴感染兔血清及紫外照射减毒尾蚴免疫的兔血清做免疫印迹都没有特异性的目标反应带出现,ELISA 的结果显示该蛋白与血吸虫感染兔血清没有免疫反应性。结论CBP蛋白与硫氧还蛋白融合表达后为可溶性蛋白且相对分子质量约为29 000,该蛋白与尾蚴感染兔血清及紫外照射减毒尾蚴免疫的兔血清均无免疫反应性,这可能与该蛋白     

日本血吸虫病流行区再感染人群血清IgG4抗体的特异性免疫 …

目的 对构建人群再感染易感性的预测系统提供有价值的信息。方法 采用Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ技术，以日本血吸虫病流行区化疗后再感染人群的４３份血清中ＩｇＧ４抗体，对日本血吸虫的可溶性虫卵抗原（ＳＥＡ）和可溶性成虫粗抗原（ＳＷＡＰ）进行免疫识别。结果 ＳＥＡ中２００ｋｕ、７０ｋｕ及５５￣６０ｋｕ蛋白组分和ＳＷＡＰ的８７ｋｕ蛋白组分被２１份以上血清的ＩｇＧ４抗体识别。结论 上述血吸虫蛋白分子可能是人群日     

日本血吸虫成虫67kD蛋白的分离与鉴定

目的：分离日本血吸虫感染及免疫血清识别的成虫抗原（AWA）中的特异蛋白带，为血吸虫病免疫诊断提供新的抗原分子。方法：免疫印迹法分析AWA的特异蛋白带，电泳层析法分离靶抗原。结果：获得了感染血清和免疫血清识别的67kD蛋白。结论：电泳层析法是一种分离血吸虫抗原的有效方法。     

日本血吸虫不同发育阶段与旋毛虫抗原交叉性的研究

运用ＥＩＴＢ技术分析日本血吸虫（Ｓｊ）尾蚴、肝期童虫及雌雄成虫与旋毛虫（Ｔｓ）肌蚴抗原的交叉性。结果显示：Ｓｊ尾蚴、肝期童虫、成虫各阶段不同程度地被抗－ＴｓＳＡＲＳ，ＴｓＩＲＳ识别，其识别的抗原分子量在１５￣１００（尤５０￣７０）ｋＤ之间，两种抗血清识别的带型基本相同。所识别的各期Ｓｊ抗原中以尾蚴抗原最多，次为肝期童虫。３０天成虫仅雌虫抗原与上述两种抗血清在９７ｋＤ处显出一条弱带。抗－Ｓｊ♂ＡＲＳ     

日本血吸虫病流行区再感染人群血清IgG_4抗体的特异性免疫识别

目的对构建人群再感染易感性的预测系统提供有价值的信息。方法采用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ技术,以日本血吸虫病流行区化疗后再感染人群的４３份血清中ＩｇＧ４抗体,对日本血吸虫的可溶性虫卵抗原（ＳＥＡ）和可溶性成虫粗抗原（ＳＷＡＰ）进行免疫识别。结果ＳＥＡ中２００ｋｕ、７０ｋｕ及５５～６０ｋｕ蛋白组分和ＳＷＡＰ的８７ｋｕ蛋白组分被２１份以上血清的ＩｇＧ４抗体识别。结论上述血吸虫蛋白分子可能是人群日本血吸虫病再感染易感状态相关的抗原表位。     

紫外线致弱尾蚴免疫兔血清筛选血吸虫成虫cDNA文库

目的：寻找照射致弱尾蚴中起免疫保护作用的抗原分子，为血吸虫病疫苗研究提供新的侯选抗原。方法：用紫外线照射致弱尾蚴免疫兔血清筛选日本血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ，Ｓｊ）成虫ｃＤＮＡ文库，并对阳性克隆的插入基因片段进行ＰＣＲ扩增及测序分析。结果：经三轮筛选，获１０个阳性克隆，其插入的Ｓｊ ｃＤＮＡ片段大小为１．５～１．８ｋｂ。初步测序获５个部分序列，其中２个序列分别与Ｓｊ动力蛋白     

Sj-UV-致弱尾蚴单链抗体库的构建及筛选

目的构建和鉴定日本血吸虫(Schistosoma japonicum,Sj)紫外线(UV)-照射致弱尾蚴单链抗体(single chain Fv,ScFv)表达文库,并以此作为高通量的库源筛选出针对有潜在保护力的Sj尾蚴66-68 kDa抗原(Schistosoma japonicum cercariae antigen 66-68kDa,SCA66-68kDa)的单链抗体。方法选择最佳紫外灯照射条件,构建UV-致弱尾蚴小鼠模型,通过其血清被动转移实验证实其是否具有抗血吸虫攻击感染的保护效果;随后提取该小鼠脾脏mRNA,利用噬菌体展示技术构建UV-照射致弱尾蚴单链抗体库,并从库容量、多样性等方面进行鉴定;运用直接菌落挖集法以SjSCA66-68kDa筛选该抗体库,获得阳性克隆进行蛋白表达,再与SCA进行反应,验证其与SjSCA66-68kDa反应的特异性。结果构建UV-致弱尾蚴动物模型中的血清转移至小鼠体内得到42.5%的减虫率,显著高于日本血吸虫感染血清转移组的减虫率(28.0%);日本血吸虫UV-致弱尾蚴单链抗体库的库容量测定为1.9×108,重组率为100%;运用抗原直接菌落挖集法筛选共获得6个SCA66-68kDa阳性克隆,经SDS-PAGE、Western-blot分析结果显示可溶性ScFv获得了正确表达,且与相应抗原SjSCA66-68kDa特异性结合,证实成功获得了特异性抗SjSCA66-68kDa单链抗体。结论成功构建了高效日本血吸虫UV-致弱尾蚴单链抗体库,从该库筛选共获得6个阳性克隆,均能诱导表达SjSCA66-68kDa特异性可溶性单链抗体。     

Expression of Schistosoma japonicum 8 kDa calcium-binding protein gene and evaluation of the immunoreactivity of its fusion protein.

OBJECTIVE: To obtain the expression of Schistosoma japonicum 8 kDa calcium-binding protein gene subcloned into the pET32a(+) soluble expression plasmid and carry out purification and immunoreactivity assessment of the expressed protein. METHODS: The recombinant plasmid was transferred to BL21 E.coli. strain, and induced with IPTG before bacterial lysis ultrasonically. The supernatant was analysed by SDS-PAGE after centrifugation. The target protein was purified with Ni-NTA agarose and transferred to the PVDF film for immunoreactivity test by Western blotting with anti-6-His antibody, the serum of rabbits 6 weeks after cercariae infection and the serum from UV-attenuated cercariae-immunized rabbits. The purified protein was used as the coating antigen for enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to examine the sera from normal and cercariae-infected rabbits. RESULTS: The molecular weight of the target protein was 29,000 after IPTG induction. The fusion protein presented a single band immunoreactive to anti-6-His antibody, which was not reactive to the serum from cercariae-infected or UV-attenuated cercariae-immunized rabbit. CONCLUSIONS: The calcium-binding protein is expressed as thioredoxinfusion protein with a relative molecular weight of about 29,000. The fusion protein possesses no immunoreactivity to cercariae-infected or UV-attenuated cercariae-immunized rabbit sera, possibly because of the specificity of the protein at the cercariae stage.     

日本血吸虫成虫和虫卵可溶性抗原及其组分抗原的研究

目的:探讨日本血吸虫雄虫、雌虫、虫卵的可溶性抗原雄虫(AWA-m、雌虫AWA-f、虫卵SEA)及其组分抗原的特性.方法:用DE22纤维素层析柱对日本血吸虫AWA-m,AWA-f,SEA抗原进行纯化,得到相应组分抗原.分别以SDS-PAGE和Western blot对组分抗原进行全面分析,并与相应未经纯化的可溶性抗原作比较.结果:经DE22纤维素层析处理的AWA-m,AWA-f,SEA,均能获得含多种蛋白的组分抗原.SDS-PAGE结果表明,AWA-m见10条主带和9条次带,其中Mr 37 000,28 000,25 000为特异性条带,出现8条免疫反应阳性带;而AWA-m组分抗原为9条蛋白带和6条免疫反应阳性带.AWA-f见15条蛋白带,其中Mr 26 500为特异性条带,组分抗原为8条蛋白带.AWA-f粗抗原及其组分抗原均见9条反应带.SEA见8条主带和10条次带,13条为免疫反应阳性条带;SEA组分抗原见11条带,其中9条为免疫反应阳性带.结论:AWA-m,AWA-f,SEA经DE22纤维素层析纯化获得组分抗原,方法简单、可靠.该组分抗原含有粗抗原的主要免疫反应成分,去除了多种与日本血吸虫病免疫反应无关的蛋白.     

日本血吸虫成虫分泌抗原的鉴定

目的制备日本血吸虫成虫分泌代谢抗原,对其免疫原性以及免疫反应性进行初步鉴定。方法日本血吸虫尾蚴感染家兔,42 d后剖杀获取成虫,将虫体置无血清DMEM培养基中,5%CO2孵箱37℃培养4 h,得到成虫分泌代谢抗原;用该抗原免疫小鼠,ELISA法检测小鼠血清特异性抗体反应;用该抗原包板,ELISA法检测血吸虫感染人血清抗体效价;采用十二烷基硫酸钠聚丙酰烯胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对其组分进行分析,然后用Western blot分析其对抗成虫分泌代谢抗原单抗发生反应的蛋白条带。结果成功制备日本血吸虫成虫分泌代谢抗原;免疫小鼠可产生较高滴度(1∶16 000)抗体反应;急性血吸虫病患者、慢性血吸虫病患者、晚期血吸虫病患者和钩虫病患者血清抗该抗原的抗体效价分别为1∶800、1∶400、1∶800和1∶100,华支睾吸虫患者和正常人血清均为阴性;SDS-PAGE显示其具有4条蛋白条带,分子量分别是13、40、60和180 ku左右;Westernblot结果表明该抗原能够被抗成虫分泌代谢抗原单抗在5ku左右处识别。结论制备的日本血吸虫成虫分泌代谢抗原具有较强的免疫原性和免疫反应性。     

紫外线照射前后日本血吸虫尾蚴可溶性虫体蛋白组分的比较

目的利用蛋白质组学技术分离、鉴定日本血吸虫正常尾蚴及紫外线致弱尾蚴虫体间差异表达蛋白。方法分别收集与制备血吸虫正常尾蚴和致弱尾蚴虫体总蛋白,经固相pH梯度双向凝胶电泳分离。凝胶银染并利用ImageMaster2DSoftware5.0凝胶图像分析软件进行比较分析,选取差异表达蛋白点经基质辅助激光解析离子飞行时间质谱仪进行鉴定。结果二维凝胶电泳图像分析结果显示:正常尾蚴和致弱尾蚴各分离出至少1277、1173个清晰、独立的蛋白点,蛋白点匹配率为72.7%,大多数蛋白点相对分子量处于22000～95000范围内,理论等电点为5～8。尾蚴经紫外线致弱前后共发现18个差异表达蛋白,其中5个蛋白于致弱尾蚴中表达消失,12个表达下调,1个表达增强,未见新增表达蛋白。其中13个差异表达蛋白经MALDI-TOF-MS鉴定分析,获悉其肽指纹图谱、理论等电点、分子量及表达水平变化等相关信息。结论利用二维电泳、MALDI-TOF-MS等蛋白质组学技术,共鉴定出13个致弱尾蚴差异表达蛋白,为进一步阐明致弱尾蚴诱导宿主产生高免疫保护力的分子机制提供了实验基础。     

紫外线致弱尾蚴免疫兔血清筛选血吸虫成虫cDNA文库

目的 :寻找照射致弱尾蚴中起免疫保护作用的抗原分子 ,为血吸虫病疫苗研究提供新的候选抗原。方法 :用紫外线照射致弱尾蚴免疫兔血清筛选日本血吸虫 (Schistosomajaponicum ,Sj)成虫cDNA文库 ,并对阳性克隆的插入基因片段进行PCR扩增及测序分析。结果 :经三轮筛选 ,获 10个阳性克隆 ,其插入的SjcDNA片段大小为 1 5～1.8kb。初步测序获 5个部分序列 ,其中 2个序列分别与Sj动力蛋白轻链 5 (DLC 5 )及Sj线粒体基因明显同源 ,其余 3个序列为未知的新基因片段。结论 :获得的阳性克隆插入基因片段可能为编码抗日本血吸虫感染的抗原基因     

血水草白屈菜红碱杀灭日本血吸虫尾蚴预防感染的研究

目的:探讨血水草白屈菜红碱(Chelerythrine,CHE)杀灭尾蚴、预防日本血吸虫感染的保护性效果。方法:实验室配置浓度分别为100 mg/L,50 mg/L,25 mg/L,12.5 mg/L,6.25 mg/L,3.125 mg/L的CHE溶液,采用玻片法灭蚴,观察15 min,30 min,60 min,120 min时尾蚴的死亡率;实验室防护动物血吸虫感染的实验,所用CHE溶液浓度同前。结果:尾蚴接触药物25 mg/L,60 min死亡率为88%,50 mg/L、60 min死亡率为100%。100 mg/L组药物浸杀尾蚴30 min后,对小鼠的防护率为100%;50 mg/L组药物浸杀尾蚴30min的防护率为82.35%。结论:CHE具有杀灭日本血吸虫尾蚴的作用。