小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的表达、纯化与鉴定

目的构建小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(mGM-CSF)工程菌,通过摸索其变、复性和纯化条件,得到高纯度高比活的重组mGM-CSF蛋白。方法以本实验室构建的hIL-2/mGM-CSF融合蛋白表达载体为模板,PCR扩增mGM-CSF基因,克隆入pET-11c表达载体,转化BL21,构建BL21/pET-11c/mGM-CSF工程菌,用本所专利方法提取包涵体,在含低浓度盐酸胍的复性液中复性,采用镍离子亲和层析纯化。结果工程菌采用TH肉汤培养,32℃、0.1mmol/LIPTG双重诱导,表达量达菌体蛋白总量的60.6%。提取包涵体在含1.5mol/L盐酸胍的谷胱甘肽复性液中复性效果最好,比活达4.2×106U/mg。经过亲和层析一步纯化,目的蛋白纯度达95%,比活与标准品相当。结论构建了高效表达mGM-CSF的工程菌,建立了其复性和纯化工艺,为进一步研究DC、GM-CSF体内抗肿瘤功能奠定了基础,并可为IL-2/GM-CSF双功能分子的生物学功能研究提供对照。     

人MT-1E融合蛋白在大肠杆菌中的表达及纯化

目的：体外表达人源性MT-1E融合蛋白并进行纯化。方法：采用RT-PCR方法获得人MT-1E基因的编码区，将其克隆入原核表达载体pQE40，并在大肠杆菌M15中表达，对蛋白的表达形式及诱导条件进行分析。用Ni-NT agarose亲和层析柱纯化目的蛋白。结果：重组蛋白在原核细胞中以可溶和不可溶两种表达形式存在。但以不可溶性形式为主。表达量随诱导时间延长而增加，在诱导8h时目的蛋白约占菌体总蛋白的32％。经亲和层析获得较高纯度的人MT-1E融合蛋白。结论：利用基因重组原核表达技术获得较纯的人源性MT-lE融合蛋白。为进一步研究金属硫蛋白的功能及特异性抗体的制备奠定了基础。     

小鼠ERA蛋白在大肠杆菌中的表达及其纯化

目的:对小鼠ERA蛋白(mERA)进行表达、纯化,为真核生物ERA功能研究奠定基础.方法:构建MBP-mERA融合表达载体.在大肠杆菌中诱导表达融合的小鼠ERA蛋白,经直链淀粉亲和层析纯化,Western Blotting鉴定所表达纯化的蛋白.结果:表达的MBP-mERA融合蛋白占菌体总蛋白的18 %;纯化后的融合蛋白纯度为70 %;Western Blotting证实了mERA蛋白的表达.结论:利用基因重组技术,在大肠杆菌中高表达了mera基因,并对融合蛋白进行了初步纯化.     

重组人IL-29的原核表达、纯化及活性分析

目的:在大肠杆菌中表达具有活性的重组人白细胞介素-29(IL-29). 方法:用PCR技术扩增人IL-29成熟蛋白的编码序列,克隆入原核表达载体pET-44 Ek/LIC中,构建融合表达载体pET-44 Ek/LIC-IL-29,转化大肠杆菌BL21(DE3),以IPTG诱导表达IL-29融合蛋白,经镍柱亲和层析纯化,然后用肠激酶消化除去N端融合标签得到完全天然状态的重组人IL-29,经N-端氨基酸测序鉴定纯化的IL-29,用细胞病变抑制法测定其活性. 结果:成功构建了表达载体pET-44 Ek/LIC-IL-29,DNA序列测定结果与预期结果一致. 在30℃培养条件下,IPTG诱导表达的IL-29融合蛋白占菌体蛋白总量43%左右,并且大部分以可溶形式存在. 纯化后的融合蛋白经肠激酶切割和回收后,所得目的蛋白(IL-29)纯度大于96%,该蛋白N-端序列与理论值一致,其抗病毒活性与IFN-α2b相当. 结论:获得了具有生物学活性的重组人IL-29.     

重组人血小板因子4的表达、纯化及活性鉴定

目的: 用基因工程手段去获取有活性的重组人血小板因子4(rhPF4),为下一步的基础理论研究和临床应用奠定基础.方法: 用PCR手段获得人PF4的编码序列,克隆入质粒pRSET,构建融合表达载体pRSET-PF4,转化大肠杆菌,以IPTG诱导表达融合的人PF4蛋白,经镍柱亲和层析纯化,用SDS-PAGE分析所表达的目的蛋白及纯化后蛋白,用鸡胚绒毛膜尿囊膜实验(CAM)验证rhPF4的活性.结果: 成功构建了表达载体pRSET-PF4,DNA序列测定结果与预期结果一致.IPTG诱导表达的rhPF4融合蛋白部分以可溶形式存在,占菌体总蛋白量的11%.亲和层析纯化后目的蛋白纯度为84%.CAM实验表明,经纯化获得的rhPF4对鸡胚血管形成具有抑制作用.结论: 成功地获得了具有高度生物学活性的rhPF4蛋白.     

人白细胞介素-10在大肠杆菌中的高效可溶性表达及一步纯化

目的:在大肠杆菌(E.coli)中表达和纯化人白细胞介素-10(IL-10)。方法:用PCR技术从质粒pH15C中扩增编码人IL-10成熟蛋白的cDNA序列,将其克隆到pET-44载体中,构建表达质粒pET-44-IL-10。用菌落PCR和限制性酶切鉴定重组质粒并进行序列分析。重组质粒转化E.coliRosettaBlue(DE3)表达含6×His的重组人IL-10蛋白。重组蛋白经Ni-NTA亲和层析纯化。结果:RosettaBlue(DE3)经1 mmol/L IPTG诱导、25℃培养,表达的IL-10主要以可溶性形式存在,表达效率为26%。超声破菌后的可溶性上清经一步Ni-NTA亲和层析进行纯化,所得蛋白纯度大于95%。结论:成功地得到了重组人IL-10纯品。     

人MT-1E融合蛋白在大肠杆菌中的表达及纯化

目的 :体外表达人源性MT 1E融合蛋白并进行纯化。方法 :采用RT PCR方法获得人MT 1E基因的编码区 ,将其克隆入原核表达载体pQE4 0 ,并在大肠杆菌M15中表达 ,对蛋白的表达形式及诱导条件进行分析 ,用Ni NTagarose亲和层析柱纯化目的蛋白。结果 :重组蛋白在原核细胞中以可溶和不可溶两种表达形式存在 ,但以不可溶性形式为主 ,表达量随诱导时间延长而增加 ,在诱导 8h时目的蛋白约占菌体总蛋白的 32 %。经亲和层析获得较高纯度的人MT 1E融合蛋白。结论 :利用基因重组原核表达技术获得较纯的人源性MT 1E融合蛋白 ,为进一步研究金属硫蛋白的功能及特异性抗体的制备奠定了基础。     

结核杆菌H37Rv株重组蛋白rESAT-6的表达纯化

目的表达纯化结核杆菌H37Rv株重组蛋白rESAT-6，为结核病血清学诊断价值研究及亚单位疫苗研制提供物质基础。方法重组质粒pET23b-ESAT-6转化Ecoli表达菌株BL21（DE3）pLysE，IPTG诱导重组蛋白rESAT-6表达。经SDS-PAGE电泳和Western blotting鉴定后，优化表达条件用镍离子鳌合亲和层析柱纯化重组蛋白。结果成功构建了重组质粒pET23b-ESAT-6并且重组蛋白rESAT-6以可溶性形式高效表达，表达量约占菌体总蛋白的14％。经亲和层析后得到高纯度有免疫反应性的重组蛋白（纯度〉95％）。结论高纯度有免疫反应性的重组蛋白rESAT-6为新型亚单位疫苗的研发及结核病血清学诊断价值的研究奠定了基础。     

用硫氧还蛋白融合表达系统表达小鼠内皮抑素

目的 利用硫氧还蛋白融合表达系统表达小鼠内皮抑素（endostatin）.方法 采用PCR技术从pMFGendo质粒上扩增出小鼠endostatin完整的cDNA序列,将其克隆至硫氧还蛋白融合表达载体pThiohisA中,转化大肠杆菌BL21,经IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）诱导表达重组融合蛋白,SDS-PAGE分析表达产物为包涵体,将包涵体纯化后通过镍柱亲和层析得到纯化的、可溶性的小鼠内皮抑素,经SDS-PAGE分析鉴定.结果 高效表达出相对分子量约32KD的重组融合蛋白,灰度扫描软件分析显示,其表达量占菌体总蛋白质的35.9%,经镍柱亲和层析获得了高纯度的小鼠内皮抑素重组融合蛋白,纯度可达95%,得率为0.27g/L.结论 用硫氧还蛋白融合表达系统在大肠杆菌中表达的小鼠内皮抑素重组融合蛋白易纯化并具有高活性.     

结核分支杆菌14KDa蛋白的基因克隆、表达、纯化及其抗原性的研究

目的基因克隆、表达、纯化结核分枝杆菌14KDa蛋白,研究其抗原性,评价其在血清学诊断中的价值。方法以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板,应用PCR技术扩增14KDa蛋白基因片断,将其插入到高效表达载体PET-22b（＋）上,构建重组质粒PET-22b（＋）/14KDa,重组质粒在大肠杆菌中由IPTG诱导表达,表达产物经金属离子鳌合亲和层析方法纯化,免疫印迹和酶联免疫吸附（ELISA）试验分析重组蛋白的抗原性。结果构建了具有正确基因序列的14KDa蛋白重组质粒,在大肠杆菌BL21（DE3）中以可溶性蛋白形式表达,重组蛋白的表达量占菌体蛋白的40.8%,经过一步金属离子鳌合亲和层析后得到纯度为94.3%的目的蛋白。免疫印迹试验结果表明该蛋白能与羊抗结核血清发生特异免疫结合反应。应用ELISA方法对结核血清参考品进行检测,敏感性和特异性分别为75.6%和96.0%。结论获得了能高效表达14KDa蛋白的大肠杆菌工程菌,目的蛋白以可溶性形式表达,该重组蛋白具有良好的免疫原性,可望成为结核血清学的诊断抗原之一。     

人腺苷激酶在大肠杆菌中的表达与纯化

目的 诱导人腺苷激酶组组蛋自在大肠杆菌中表达,并对表达的重组蛋白进行纯化.方法 将由人腺苷激酶基因开放阅读框与原核表达载体pET30a(+)连接构建的重组蛋白表达载体pET30a(+)/ADK转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)感受态细胞.1 mmol/L的IPTG诱导重组蛋白表达.离心收集菌体后结合使用溶菌酶、冻融和超声破碎的方法裂解菌体.用含2 mol/L和4 mol/L尿素的结合缓冲液洗涤包涵体去除部分杂蛋白.随后用含8 mol/L尿素的结合缓冲液变性溶解剩余包涵体沉淀.用Ni-NTA柱通过亲和层析纯化重组蛋白,用含8 mol/L尿素的洗脱缓冲液洗脱.收集样品透析复性.结果 成功构建人腺苷激酶原核表达载体且目的 蛋白以包涵体形式表达.经包涵体洗涤、变性溶解,亲和层析及分步透析复性获得纯度达85%以上的重组蛋白.结论 人腺苷激酶表达载体的成功构建以及重组蛋白的纯化.为进一步进行其结构和功能的研究奠定了基础.     

MIP4的突变体构建及其对嗜酸粒细胞趋化的抑制

目的：为研究MIP4（巨噬细胞炎性蛋白4）的突变体在拮抗嗜酸粒细胞的趋化作用中的活性。构建MIP4突变体（Met-MIP4)并进行原核表达和纯化，体外观察其拮抗嗜酸粒细胞的趋化作用。方法：将Met-MIP4基因片段插入到pR-SET-A融合表达载体中。诱导表达后，表达工程菌经超声裂菌后鉴定可溶性，细菌裂解上清经镍螯合亲和层析纯化，采用葡聚糖沉淀法分离和纯化嗜酸粒细胞，利用24孔Transwell双层板鉴定融合表达蛋白的趋化和抗趋化活性。结果：构建入融合表达载体pRSETA的基因在大肠杆菌中得到表达。裂菌后鉴定显示融合蛋白可溶部分占80%，经镍螯合亲和层析纯化后纯度达87%，分离的嗜酸粒细胞纯度达到90%，拮抗嗜酸粒细胞趋化活性实验表明，纯化的Met-MIP4蛋白具有明显拮抗嗜酸粒细胞的趋化作用。结论：Met-MIP4突变体基因在pRSETA融合表达载体中获得可溶性表达和纯化，生物学活性实验表明融合的pRSET-Met-MIP4蛋白具有拮抗嗜酸粒细胞的趋化作用的活性。为进一步开发其临床应用奠定了基础。     

丙型肝炎病毒截短型核心基因表达载体的构建与表达

目的构建重组丙型肝炎病毒核心基因表达载体pVec-core,并进行原核表达。方法人工合成丙型肝炎病毒截短型核心基因至pUC57载体上,经双酶切后,将其克隆至原核表达质粒pVec中,测序正确后将重组质粒pVec-core转化入表达宿主菌BL21,经IPTG诱导表达核心蛋白,SDS-PAGE检测目的蛋白的表达情况。采用GST亲和层析方法纯化融合蛋白并进行Western印迹法验证。结果丙型肝炎病毒核心基因表达载体构建成功,重组菌表达出相对分子质量约为40.6 kD重组融合蛋白,并以可溶形式存在于菌体中。蛋白经谷胱甘肽琼脂糖凝胶纯化,得到纯度较高的目的蛋白。经Western印迹分析,该蛋白可与HCV患者阳性血清发生特异性结合反应,具有良好的抗原活性。结论核心抗原表达载体在原核表达系统中高效表达,为利用其作为诊断抗原及研究核心蛋白的其他生物学功能奠定了基础。     

小鼠IL-4重组质粒的构建及目的蛋白的表达和纯化

目的 构建重组小鼠白细胞介素-4(rmIL-4)原核表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,纯化目的蛋白并鉴定.方法 将优化后的小鼠IL-4 cDNA片段克隆到原核表达载体pET-32a (+)上,获得重组质粒pET32/rmIL-4,转入BL21(DE3)中经IPTG诱导表达得到包涵体.经复性处理后,依次用阴离子交换柱和分子筛纯化蛋白.对纯化得到的蛋白用Western blot检验免疫学特异性,用mIL-4生长依赖性细胞株CTLL-2增殖实验和动物实验测定其生物学活性.结果 经酶切和测序证实重组质粒pET32/rmIL-4构建成功.诱导得到的包涵体用3 mol/L盐酸胍溶液洗涤后溶于加有β-巯基乙醇的7 mol/L盐酸胍溶液中变性,在pH9.5的条件下梯度透析复性.纯化出的蛋白经Western blot鉴定,能与抗小鼠IL-4抗体特异性结合;经细胞和动物实验鉴定,rmIL-4蛋白具有生物学活性,能刺激mIL-4生长依赖性细胞株CTLL-2增殖,使小鼠体内细胞因子发生从TH1到TH2的漂移.结论 成功制备了高纯度、具有生物学活性的小鼠IL-4,为进一步研究其生物学功能提供了条件.     

HA20-lys10在大肠埃希菌中的融合表达纯化和凝胶阻滞试验

目的表达和纯化流感病毒血凝素HA2氨基末端20个氨基酸与10个赖氨酸的融合蛋白HA20-lys10,并观察其与质粒结合的能力.方法用PCR方法构建流感病毒血凝素HA2氨基末端20个氨基酸与10个赖氨酸的融合基因HA20-lys10,并克隆于pET32a(+)原核表达载体.将重组表达质粒pET-HA-K转化大肠埃希菌BL21(DE3),当A(Abs)600nm达到0.6时,加入终浓度为1 mmol/L IPIG诱导目的蛋白的表达.表达产物用亲和层析一步法进行纯化,然后用凝胶阻滞试验观察重组蛋白结合质粒的能力.结果IPTG诱导后可获得相对分子质量约为27 000的目的蛋白,表达蛋白以可溶形式存在,占菌体蛋白20%以上.表达菌超声后,表达产物经亲和层析一步纯化后可获得纯度达85%以上目的蛋白.凝胶阻滞试验发现,纯化的重组蛋白在一定条件下可以与质粒结合,使质粒的迁移率明显改变.结论融合蛋白HA20-lys10有望用于受体介导基因转移,以提高基因转移的效率.     

小鼠白细胞介素-18高效真核分泌表达载体的构建及活性测定

目的克隆小鼠白细胞介素-18（mIL-18）基因，构建重组表达质粒，在结肠癌中表达重组小鼠白细胞介素-18（mIL-18），并对其生物学活性进行初步鉴定。方法利用RT-PCR方法从小鼠腹腔巨噬细胞（Mψ）扩增出成熟肽编码区cDNA（474bp），克隆到表达载体pSecTag2B（含有分泌信号肽Igc）中；然后转染成纤维细胞，培养上清用小鼠的IL-18 ELISA试剂盒检测分泌有活性的mIL-18。结果构建的pSecTag2B-mIL-18可在成纤维细胞中分泌表达，mIL-18可诱导T淋巴细胞分泌IFN-γ。结论成功构建pSecTag2B—mIL-18表达载体，表达的IL-18刺激T淋巴细胞分泌IFN-γ。     

小鼠周脂素基因的原核表达及纯化

目的构建小鼠周脂素（prilipin,Plin）原核表达载体,表达周脂素蛋白并进行初步纯化,为研究周脂素的功能奠定基础。方法通过酶切从pMD18-Plin重组载体上酶切下周脂素目的基因,定向插入原核表达载体pET-32a（＋）中,转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE及Western blot鉴定后,进行纯化。结果构建的pET-32a-Plin载体能够表达周脂素重组蛋白,表达量约占菌体总蛋白的50%,经初步纯化后,纯度达95%以上。结论成功构建了周脂素原核表达载体,并在原核系统中表达了重组蛋白,纯化的蛋白纯度较高,可用于后续试验。     

重组人C22orf37融合蛋白的克隆、表达、纯化及鉴定

目的：构建人C22orf37基因的原核表达载体,表达并纯化C22orf37重组蛋白．方法：应用PCR方法从人外周血白细胞eDNA文库中获得人C22orf37基因,成功构建人C22orf37融合表达载体,诱导表达His—C22orf37融合表达蛋白并对表达产物进行SDS-PAGE电泳分析和Western Blot鉴定．应用镍螯合层析法纯化重组融合蛋白,并对纯化产物进行纯度分析．结果：成功构建了人C22orf37重组融合载体pQE30-C22orf37,工程菌pQE30-C220rf37／DH5α经IPTG诱导后的菌体蛋白经SDS—PAGE电泳分析,在Mr约18000处出现了一条新生的蛋白条带,Western Blot结果显示该条带能够与His抗体特异性结合．应用Ni—NTA层纯化出目的蛋白,纯化后的蛋白经Primer Premier软件分析纯度约80％．结论：成功构建了人C22orf37的融合蛋白原核表达载体并成功表达与纯化了人C22orf37的融合蛋白,为下一步的C22orf37 mAb的制备和C22orf37蛋白表达的组织分布及功能研究奠定了基础．     

幽门螺杆菌Omp22-HpaA融合基因工程菌蛋白的表达

目的:优化幽门螺杆菌Omp22-HpaA基因工程菌pMAL-c2X-Omp22-HpaA-TB1的表达条件,并对其表达产物进行纯化和鉴定.方法:在不同诱导时机、不同诱导剂(IPTG)浓度和不同诱导时间条件下诱导pMAL-c2X-Omp22-HpaA-TB1的表达,测定目的蛋白的表达量.在优化条件下诱导工程菌表达,并应用SDS-PAGE方法对表达产物进行分析,采用Amyloss树脂预装柱对可溶性Omp22-HpaA蛋白进行分离、纯化,对纯化后的蛋白行Western blot分析.结果:工程菌培养2 h时加入IPTG(终浓度为0.4 mmol/L)诱导7 h,目的蛋白Omp22-HpaA表达量达到菌体总蛋白的20%以上.经纯化得到了较高纯度(＞90%)的目的蛋白,并具有良好的免疫原性.结论:建立了从pMAL-c2X-Omp22-HpaA-TB1可溶性表达产物中纯化较高纯度Omp22-HpaA融合蛋白的方法.     

小鼠金属硫蛋白—Ⅰ在大肠杆菌中的表达与分离纯化

目的：在大肠杆菌中表达小鼠金属硫蛋白－Ⅰ，并研究其分子结构和生物学功能。方法：将小鼠金属硫蛋白－Ⅰ基因克隆入融合表达载体pGEX-4T-1中，转化大肠杆菌BL21，得到含重组表达质粒pGMA的工程菌。结果：经IPTG诱导，表达出分子量约为33KD的融合蛋白。然后经Glutathione-Sepharose4B亲和纯化后，用凝血酶切除GST部分。经SephacrylS-100过滤纯化，得到结合有Cd^2 的小鼠金属硫蛋白－Ⅰ。产率约为3mg/L培养液。结论：成功制备了表达MT的工程菌。