内质网应激对光照诱导的人视网膜色素上皮细胞损伤的促进作用

背景 视网膜色素上皮(RPE)细胞的光损伤模型是多种视网膜变性类疾病的研究工具,光诱导RPE细胞损伤的主要病理基础是凋亡及炎症反应,但是内质网应激(ERS)反应是否参与其病理机制的研究国内外少有报道. 目的 探讨ERS对光损伤诱导的人RPE细胞凋亡的作用及其机制.方法 体外培养人RPE细胞株(ARPE-19),将培养的细胞分为正常对照组及光照3、6、12和24 h组,各光照组在培养箱内以(2 000± 500) lx的白色荧光灯光照细胞建立光损伤模型,正常对照组细胞在暗环境中培养且不给予光照射,筛选实验最适光照时间.将细胞分为正常对照组、光照组(光照12h)和苯基丁酸(4-PBA)预处理+光照组,4-PBA预处理+光照组先用ERS抑制剂4-PBA培养细胞30 min,然后光照细胞12h.采用流式细胞仪检测各组人RPE细胞的凋亡率和细胞内活性氧(ROS)的荧光强度;采用ELISA法检测各组细胞上清液中炎性因子白细胞介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)质量浓度;分别采用实时荧光定量PCR和Western blot法检测人RPE细胞中ERS标志物活化转录因子-6(ATF-6)、C/增强结合蛋白同源蛋白(CHOP)和细胞凋亡标志物半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-12(caspase-12) mRNA及其蛋白的表达. 结果 光照后细胞形态呈长梭形改变,边界不清,细胞质脱颗粒,细胞碎片增多,且随光照时间的延长而加重.流式细胞仪检测发现,随光照时间的延长,人RPE细胞内ROS含量逐渐增加,细胞凋亡率逐渐升高,差异均有统计学意义(F=763.00、119.30,均P＜0.01).ELISA法检测发现,与正常对照组比较,光照后6h细胞上清液中IL-1β和TNF-α质量浓度均明显升高,12h达峰.实时荧光定量PCR和Western blot检测显示,与正常对照组比较,光照后人RPE细胞中ATF-6、CHOP和caspase-12 mRNA及其蛋白的相对表达量均明显升高,均于光照后12h达峰或升高,故选择光照12 h为最适光照时间作为后续研究.4-PBA预处理+光照组细胞中ATF-6、CHOP和caspase-12 mRNA的相对表达量均明显低于光照组,差异均有统计学意义(F=281.69、473.88、308.45,均P＜0.01);ATF-6、CHOP和caspase-12蛋白的相对表达量均明显低于光照组,差异均有统计学意义(F=47.86、57.93、106.59,均P＜0.01);细胞凋亡率、细胞上清液中IL-1β和TNF-α质量浓度均明显低于光照组,差异均有统计学意义(F=88.64、245.47、101.01,均P＜0.01). 结论 (2 000±500)lx的光照可诱导人RPE细胞内ROS增加,并激活细胞的ERS反应,导致RPE细胞凋亡及炎症反应.ERS抑制剂4-PBA可抑制光损伤导致的ERS反应,进而降低RPE细胞凋亡率并抑制炎症反应过程.     

蓝光照射致人视网膜色素上皮细胞线粒体凋亡的途径及机制

背景 研究已证实蓝光照射可导致视网膜色素上皮细胞(RPE)凋亡,但其机制目前尚不完全清楚. 目的 探讨线粒体凋亡通路是否参与蓝光照射诱导体外培养的人RPE细胞凋亡过程.方法 分离新鲜的供体视网膜,对人RPE细胞进行原代培养和传代,用角蛋白单克隆抗体行细胞鉴定.将体外培养的人RPE细胞分为无光照组、单纯光照组、光照+硝苯地平组、光照+钙磷酸结合蛋白C(calphostin C)组、光照+佛波酯(PMA)组.光照组细胞用(2 000±500) lx的蓝光照射人RPE细胞6h,然后继续培养24 h后终止.采用Western blot法比较两个组间RPE细胞中凋亡相关调控因子bax、bcl-2、bcl-xl的相对表达,以评价蓝光照射对RPE细胞凋亡的影响.光照+硝苯地平组、光照+calphostin C组、光照+PMA组细胞在蓝光照射前1h分别在培养基中加入相应药物,然后以(2 000±500) lx的蓝光照射人RPE细胞6h,并继续培养24 h,采用Westernblot法检测5个组细胞中caspase-9蛋白表达量的变化,观察钙通道和蛋白激酶C(PKC)通路对RPE细胞线粒体的影响.结果 培养的细胞生长良好,细胞质内充满色素颗粒,呈铺路石样排列,对角蛋白呈阳性反应.无光照组和单纯光照组均可见bax、bcl-2及bcl-xl蛋白条带,相对分子质量分别为23 000、26 000和30 000.与无光照组比较,单纯光照组bax、bcl-2和bcl-xl蛋白表达相对值(A)下降,差异均有统计学意义(t=-4.409,P=0.012;t=7.575,P=0.002;t=6.068,P=0.004).与无光照组比较,单纯光照组、光照+calphostin C组、光照+PMA组细胞中caspase-9蛋白表达均升高,差异均有统计学意义(P=0.005、0.002、0.000),而光照+硝苯地平组与无光照组比较差异无统计学意义(P=0.191).与单纯光照组比较,光照+PMA组caspase-9蛋白表达升高,差异有统计学意义(P=0.005);而光照+硝苯地平组及光照+calphostin C组caspase-9蛋白表达差异均无统计学意义(P=0.057、0.643). 结论 蓝光致体外培养的人RPE细胞凋亡,同时细胞中caspase-9表达增强,凋亡抑制基因bcl-2及bcl-xl表达下降,凋亡促进基因bax蛋白表达增强.线粒体凋亡通路参与蓝光照射致RPE细胞凋亡的过程;PKC通路可能参与了蓝光导致的人RPE细胞凋亡.     

兔视网膜在不同阈值激光作用后MMP-9表达的变化

目的:观察兔视网膜在不同阈值577nm激光作用后MMP-9的表达变化.方法:将色素兔26只采用抽签法随机分为正常对照组2只、常规光凝组6只和阈下微脉冲光凝组18只.正常对照组不做任何处理,常规光凝组行577nm激光光凝,阈下微脉冲光凝组又亚分为三个亚组,分别行9%、12%、15%工作负载率的577nm阈下微脉冲激光光凝.采用免疫组织化学法检测各组兔眼视网膜上MMP-9的表达情况.结果:常规光凝组:RPE层及视细胞层MMP-9呈强阳性表达,较阈下微脉冲组明显增多,差异有统计学意义(P<0.05);阈下微脉冲组:9%工作负载率见RPE层及视细胞层MMP-9少许阳性表达,12%工作负载率见RPE层及视细胞层阳性表达增多、胞核也出现少许阳性表达,15%工作负载率RPE层及视细胞层中度阳性表达,三个亚组间差异无统计学意义(P>0.05).结论:577nm阈下微脉冲光凝在9%、12%、15%工作负载率下对视网膜色素上皮层具有高度选择性,对视网膜神经纤维层无明显损伤,较常规577nm激光光凝更加安全.     

一种改良的光诱导视网膜分级损伤大鼠模型

背景大鼠视网膜光损伤动物模型因诸多影响因素较难复制,使不同因子（如药物）对视网膜光损伤生物学效应的研究受到影响。目的改良大鼠视网膜光损伤动物模型的制作方法,建立大鼠视网膜光损伤程度分级模型。方法选用8～10同龄雄性SD大鼠24只,根据强光暴露时间的不同将动物按随机数字表法分为正常对照组和光损伤1、2、3h组,每组6只大鼠。为获得眼球的全视野光辐照,采用环形光照箱将LED灯集中分布在光照箱的上下和光照箱四周共8个方向,保证大鼠在光照箱内做单向环形活动时其右眼接受约5000lx的光照。实验中每只动物单独接受光辐照,以避免动物之间的相互干扰。光辐照后5d进行全视野视网膜电图（ERG）记录,并进行常规组织病理学观察,评价视网膜外核层（ONL）的厚度变化。结果5000lx强光暴露1、2、3h后暗适应条件下的ERG视杆细胞反应、标准光最大混合光反应的b波幅值分别下降了26．2％、52．5％、70．7％和24．4％、39．3％、58．1％,OPs波、视锥细胞反应、20Hz闪烁光反应也均有明显下降,不同光照时间组间各波平均振幅值的总体差异均有统计学意义（视杆：F=71．690,P=0．000;混合光反应：F=56．250,P=0．000;OPs：F=23．610,P=0．000;视锥：F=27．130,P=0．000;20Hz：F=27．030,P=0．000）;不同光照时间组间各波平均隐含时的总体差异均有统计学意义（视杆：F=1．370,P=0．282;混合光反应：a波：F=0．800,P=0．508;b波：F=11．840,P=0．000;视锥：F=2．080,P=0．136）。振幅下降及隐含时延长的程度均与光暴露时间有关。视网膜的光损伤以视网膜颞上区域明显,光辐照1、2、3h后该区域ONL厚度较正常对照组分别减少了11．3％、25．6％、72．5％,各组的平均ONL厚度随光照时间的延长逐渐变薄,差异有统计学意义（F=410．270,P=0．000）。结论光强度为5000lx连续光辐照后可以造成大鼠视网膜损伤,光辐照1、2、3h后损伤程度分为轻、中、重3级,主要损伤部位在大鼠视网膜颞上区域。研究提出了一种视网膜光损伤程度标准的建议。     

rhEPO对光损伤诱导的RPE细胞Caspase-3表达的作用

目的 探讨促红细胞生成素（EPO）抗光损伤的人视网膜色素上皮（RPE）细胞凋亡的具体作用机制.方法 取成人ARPE-19细胞株传代培养的2～5代细胞建立光损伤模型,采用酶联免疫吸附实验（ELISA）和免疫组织化学法定量检测不同含量EPO干预治疗前后RPE细胞Caspase-3表达的变化,并添加特异性Jak2激酶抑制剂AG490和PKB抑制剂CTMP,检测RPE细胞Caspase-3表达的变化.结果 重组人促红细胞生成素（rhEPO）可明显减少RPE细胞光损伤后Caspase-3的表达,以40 U/ml EPO组结果最明显;加入AG490,EPO对Caspase-3的抑制作用被阻断;加入CTMP,Caspase-3的表达又增强.结论 rhEPO抗光损伤诱导的RPE细胞凋亡作用机制之一可能是抑制Caspase-3的表达,Jak2的PIK3/PKB途径可能是EPO抑制Caspase-3的一条作用途径.     

PDGF对人RPE细胞中MMP-2、MMP-9和TIMP-1表达的影响

背景研究表明血小板源性生长因子（PDGF）能调节多种细胞中基质金属蛋白酶／基质金属蛋白酶组织抑制剂（MMP／TIMP）的表达和平衡,但视网膜色素上皮（RPE）细胞中MMP／TIMP的表达与PDGF作用剂量和作用时间的关系尚不明确。目的观察PDGF对RPE细胞中MIP-2、MMP-9和TIMP-1表达的影响。方法体外培养人RPE细胞系ARPE-19,将达到70％～80％融合的细胞分为5个组。分别将0、0．1、1、10、50mg／LPDGF加入RPE细胞培养基作用36h,分别采用逆转录PCR（RT—RCR）法和Western blot法检测各组RPE细胞中MMP-2、MMP-9和TIMP-1 mRNA及其蛋白的表达。PDGF组采用10mg／LPDGF组PDGF分别刺激RPE细胞24、36和48h,对照组用不含PDGF的培养液培养,采用逆转录PCR（RT—RCR法和Western blot法分别检测RPE细胞中MMP-2、MMP-9和TIMP-1 mRNA及蛋白的表达。结果随着PDGF质量浓度的增加和刺激时间的延长,RPE细胞生长速度加快,细胞增生明显。PDGF刺激RPE细胞36h,随着PDGF质量浓度的增加,MMP-2 mRNA和MMP-9 mRNA在RPE细胞中表达相对值逐渐增加,各组间差异均有统计学意义（MMP-2 mRNA：F=79．304,P=0．000;MMP-9 mRNA：F=8．465,P=0．003）,其中1、10、50mg／LPDGF组RPE细胞中MMP-2 mRNA和MMP-9 mRNA表达相对值明显高于0mg／L PDGF组,差异均有统计学意义（P〈0．05）。RPE细胞中MMP-2和MMP-9蛋白表达相对值随着PDGF质量浓度的增加而逐渐增加,各组间差异均有统计学意义（MMP-2：F=26．550,P=0．000;MMP-9：F=80．993,P=0．000）,其中1、10、50mg／LPDGF组RPE细胞中MMP-2和MMP-9蛋白表达相对值明显高于0mg／L PDGF组,差异均有统计学意义（P〈0．05）。各质量浓度PDGF组RPE细胞中TIMP-1 mRNA和蛋白表达相对值差异均无统计学意义（F=0．143,P=0．962;F=1．955,P=0．178）。随着10mg／L PDGF刺激RPE细胞时间的延长,RPE细胞中MMP-2 mRNA和MMP-9 mRNA表达逐渐增加,差异均有统计学意义（MMP-2 mRNA：F时间=83．250,P=0．002;MMP-9 mRNA：F时间=6．785,P=0．019）;各时间点RPE细胞中MMP-2和MMP-9蛋白表达相对值明显增加,差异均有统计学意义（MMP-2：F时间=11．185,P=0．041;MMP-9：F时间=968．413,P=0．000）。PDGF作用不同时间点对照组与PDGF组间MMP-2、MMP-9 mRNA及蛋白在RPE细胞中的表达差异均有统计学意义（分组：均P=0．000,时间点：P〈0．05）,而各时间点2个组间RPE细胞中TIMP-1表达相对值的差异均无统计学意义（P〉0．05）。结论PDGF上调PRE细胞中MMP-2和MMP-9的表达,其作用呈剂量和时间依赖性,但对PRE细胞中TIMP-1的表达无明显影响。PDGF导致RPE细胞中MMP／TIMP的平衡失调,从而导致细胞外基质的破坏,促进RPE细胞的迁移。     

夜间光照对氧诱导的视网膜病变小鼠视网膜新生血管形成的影响

背景 氧诱导的视网膜新生血管形成是多种视网膜血管性疾病的病理学基础,预防视网膜新生血管的形成可缓解视网膜病变对视网膜的损害程度.研究表明夜间睡眠时给予光照可能对早期糖尿病视网膜病变(DR)患者有利,但其对早产儿视网膜病变(ROP)患者视网膜新生血管有无影响报道较少.目的 观察夜间光照对氧诱导视网膜病变(OIR)小鼠视网膜新生血管形成的影响.方法 将64只SPF级新生C57BL/6J小鼠按随机数字表法随机分为正常对照组、单纯夜间光照组、OIR模型组、OIR联合夜间光照组,每组16只小鼠.正常对照组和单纯夜间光照组小鼠生长于正常空气(氧体积分数21％);OIR模型组和OIR模型联合夜间光照组小鼠于出生后第7天置于高氧环境(75％±2％)生长,出生第12天调整氧体积分数为正常;OIR联合夜间光照组和单纯夜间光照组于出生后第12～17天给予夜间光照,光照度为100 Ix.各组小鼠均于出生后第17天摘除眼球,采用ADP酶法制备视网膜铺片,了解视网膜血管的改变情况;视网膜组织切片行苏木精-伊红染色并计数突破视网膜内界膜的新生血管内皮细胞核数;免疫组织化学法观察各组小鼠视网膜中血管内皮生长因子(VEGF)的表达,实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)法检测各组视网膜中VEGFmRNA的表达.实验动物的使用和喂养遵循ARVO声明.结果 正常对照组和单纯夜间光照组小鼠视网膜血管形态均无明显差异.OIR模型组视网膜铺片显示视网膜中央部大片无血管区,大量结构异常的新生血管形成.与OIR模型组相比,OIR模型联合夜间光照组视网膜中央无血管区面积以及新生血管分布密度减少.在实验后第17天时,正常对照组和单纯夜间光照组视网膜新生血管内皮细胞核数分别为(0.97±0.83)个和(1.00±0.72)个,OIR模型组为(38.57±5.01)个,而OIR联合夜间光照组小鼠视网膜新生血管内皮细胞核数为(16.92±3.39)个,总体差异有统计学意义(F=78.767,P=0.000),OIR联合夜间光照组视网膜新生血管内皮细胞核数明显少于OIR模型组,差异有统计学意义(t=20.446,P＜0.01).免疫组织化学法检测显示OIR模型联合夜间光照组中VEGF蛋白表达明显少于OIR模型组.正常对照组、单纯夜间光照组、OIR模型组和OIR联合夜间光照组小鼠视网膜VEGF mRNA相对表达量分别为1.00±0.00、0.94±0.07、2.08±0.50和1.43±0.21,各组间的总体差异有统计学意义(F=11.268,P=0.003),OIR模型联合夜间光照组表达较OIR模型组下调,差异有统计学意义(t=20.163,P＜0.05).结论 夜间光照可减少OIR小鼠视网膜新生血管的形成.     

不同波长光照射对rd12和C57BL/6J小鼠视网膜光损伤的对比研究

目的 探讨不同波长光照射对rd12和C57BL/6J小鼠视网膜光损伤的影响.方法 取rd12和C57BL/6J小鼠各32只,随机分成对照组、白光组、中波长光(505 nm)组和短波长光(405 nm)组,各组光照强度为(800±130) Lux,每天照射12h,持续7d.于光照前1d和光照后1、4、7d进行视网膜电流图(ERG)检测,光照7d后通过活体组织氧化应激活性氧(ROS)高质荧光检测ROS水平,免疫荧光法和蛋白质免疫印迹法检测抗过氧化物酶6(PRDX6)的表达,测定半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)活性.结果 C57BL/6J小鼠ERG反应随光照时间延长振幅逐渐降低,短波长光组下降最明显,光照后1、4、7d各组明视反应b波振幅率比较,差异均有统计学意义(F=4.412,5.082,9.980;P＜0.01).7d时对照组、白光组、中波长光组和短波长光组b波振幅率分别下降至(85±10)％、(70±19)％、(57±22)％、(46±19)％比较,其中,短波长光组与白光组比较,差异有统计学意义(t=3.19,P＜0.01).ROS含量测定显示,rd12小鼠各组ROS相对量比较,差异有统计学意义(F=16.08,P＜0.01),短波长光较其它组明显升高.PPDX表达比较,差异有统计学意义(F=7.214,P＜0.05).短波长光组较其它Caspase-3相对活性检测结果比较,差异有统计学意义(F=7.530,P＜0.05).C57BL/6J小鼠各组ROS含量、PRDX6蛋白及Caspase-3活性测定结果比较,差异均无统计学意义(F=3.625,1.993,1.133;P＞0.05).rd12与C57BL/6J小鼠各组比较,仅短波长光组Caspase-3相对活性检测结果差异有统计学意义(t=5.474,P＜0.05).结论 短波长光照射对小鼠视网膜具有损伤作用,其对rd12小鼠的影响较C57BL/6J小鼠显著.损伤机制可能与氧化损伤有关.     

MEK/ERK参与大鼠脉络膜新生血管基质金属蛋白酶-2和基质金属蛋白酶-9的表达调控

目的 探讨基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)和MMP-9在大鼠脉络膜新生血管(choroidal neovascularization,CNV)内的表达及其可能的调控机制.方法 将23只成年雄性棕色挪威大鼠随机分为2组,一组为玻璃体内注药组,视网膜光凝后即刻玻璃体内注射3μL PD98059;另一组为单纯光凝组,单纯行视网膜光凝.观察时间为光凝后3d、7d和14 d.各时间点处死大鼠后摘除眼球,免疫组织化学法和免疫荧光法观察MMP-2和MMP-9在大鼠CNV内不同时间点的表达特点.眼底荧光血管造影(fundusfluorescence angiography,FFA)和HE法观察玻璃体内注射PD98059对CNV生成的作用,Western blotting检测观察注药对CNV内MMP-2和MMP-9表达的影响.结果 光凝后3d,单纯光凝组光凝区即有MMP-2和MMP-9的阳性表达;光凝后7d和14 d二者表达均逐渐增强.光凝后7d,玻璃体内注药组MMP-2和MMP-9均显著被抑制,分别被抑制约69％和80％.Western blotting检测结果示玻璃体内注射组可显著抑制ERK的磷酸化,光凝后3d及7d的抑制率分别为54％和60％,而对ERK总量的表达无明显作用.FFA和HE显示,玻璃体内注药组光凝后14 d减少光凝局部CNV的荧光素渗漏约51％,抑制CNV厚度达57％.免疫荧光法检测结果示光凝后7d,玻璃体内注药组抑制MMP-2和MMP-9的表达分别为73％和64％.结论 MMP-2和MMP-9参与了大鼠CNV的生成,光凝后3d即有阳性表达,至光凝后14 d表达进一步增强,MEK/ERK通路至少部分参与了MMP-2和MMP-9在CNV内的生成调控.     

17β-雌二醇抗BALB/c与C57BL/6小鼠视网膜光照损伤的比较

目的：通过建立BALB/c与C57BL/6小鼠视网膜光损伤模型，研究17β-雌二醇(17β-estradiol， E2)的视网膜神经保护作用，为成功构建E2抗视网膜光损伤模型提供实验数据。

方法：成年雌性BALB/c、C57BL/6小鼠各40～45只，实验分组如下：正常对照组，去势手术对照组，去势光照组(小鼠去势手术14d后进行持续10 000lx白光光照刺激4、8、12、16、24h组)，玻璃体腔注射假手术组，生理盐水组和E2预处理组(去势手术14d后暗适应24h后分别行玻璃体腔注射2μL生理盐水或10^-5mol/L E2)，每组各6只。通过石蜡切片HE染色、TUNEL染色、视网膜电图检测视网膜形态及功能变化。

结果：去势光损组视网膜内核层/外核层厚度从白光10 000lx光照4h组开始显著减小； 玻璃体腔注射E2预处理可显著抑制两种品系小鼠视网膜各层细胞的凋亡(P<0.01)以及C57BL/6小鼠视网膜电图检测中最大混合反应a波和b波波幅的下降(P<0.05)。

结论：相同光照条件对两种品系小鼠光损敏感性存在差异； E2对BALB/c小鼠无论是视网膜形态学及功能学上都产生了保护作用，而对C57BL/6小鼠功能学保护作用显著。     

三氧化二砷对表皮生长因子诱导的视网膜色素上皮细胞增生和迁移的影响

背景 细胞因子失衡所导致的视网膜色素上皮(RPE)细胞的异常增生和迁移是增生性玻璃体视网膜病变( PVR)的主要病理变化之一.三氧化二砷(As2O3)是中国传统中药中的有效成分,可有效抑制肿瘤细胞的增生和迁移.但As2O3对细胞生长因子引起的RPE细胞增生和迁移的影响尚未明确. 目的 探讨As2O3对表皮生长因子(EGF)诱导的ARPE-19细胞增生和迁移的影响.方法 用无血清培养基对RPE细胞系ARPE-19细胞进行培养,将终浓度为0、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0和20.0 μmol/L的As2O3分别加入到无血清培养基和含10 mg/L EGF的ARPE-19细胞培养液中作用24 h和48 h,通过噻唑蓝(MTT)比色法检测各培养组ARPE-19细胞活性的吸光度(A)值,以探讨As2O3对细胞的药物毒性作用,并筛选安全、有效的As2O3作用浓度.用10 mg/L EGF加入培养基诱导ARPE-19细胞迁移,分别在培养板中加入0、0.5、1.0、2.0μmol/L As2O3 作用24 h和48 h,并通过划痕试验和Transwell试验检测As2O3对EGF诱导的ARPE-19细胞迁移的影响.结果 MTT法检测发现不同浓度As2O3组作用24 h和48 h后,无血清培养组细胞A值随As2O3浓度的升高而逐渐下降,总体差异有统计学意义(F浓度=38.269,P=0.000;F时间=0.874,P=0.358).与空白对照组(0μmol/LAs2O3组)比较,0.5～ 5.0 μmol/L As2O3组ARPE-19细胞A值的差异均无统计学意义(P＞0.05).对含10 mg/LEGF组的ARPE-19细胞,药物对细胞A值的影响呈现浓度和时间依赖性(F浓度=152.155,P=0.000;F时间=51.649,P=0.000).与对照组比较,0.5～2.0μmol/L As2O3加入24 h和48 h后,A值的变化差异均无统计学意义(P＞0.05),而0.5、1.0、2.0μmol/L As2O3加入10 mg/L EGF诱导的ARPE-19细胞中作用24h和48 h后,A值的变化差异均无统计学意义(F浓度=2.215,P=0.126;F时间 =2.230,P=0.155).5.0 ～20.0 μmol/L As2O3作用于EGF诱导的ARPE-19细胞中作用后,细胞A值明显下降,与空白对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.05),5.0～20.0 μmol/L As2O3作用24 h后,对EGF诱导的ARPE-19细胞增生抑制率分别为12％、32％、37％;作用48 h后细胞抑制率分别为39％、44％和53％.划痕试验结果显示,0.5～2.0 μmol/L As2O3对EGF诱导的ARPE-19细胞的横向迁移具有抑制作用.Transwell试验结果表明,0.5～2.0 μmol/L As2O3对10 mg/L EGF诱导的ARPE-19细胞纵向迁移有明显的抑制作用,0.5、1.0、2.0μmol/L As2O3作用12h对ARPE-19细胞的抑制率分别为22％、33％和46％. 结论 As2O3在一定浓度范围内对ARPE-19细胞无毒性作用,2.0 μmol/L以下浓度的As2O3对EGF诱导的ARPE-19细胞增生无明显影响,但可影响细胞的迁移能力,5.0 μmol/L以上浓度的As2O3可明显抑制ARPE-19细胞的增生.     

Lat-B对家兔巩膜胶原重塑的影响

目的研究latrunculin-B（Lat-B）对兔巩膜通透性的影响,为细胞骨架因子在青光眼治疗中的应用及眼后节疾病的药物传递研究提供新的思路和理论依据。方法 36只家兔随机分为平衡盐液（BSS）组、二甲基亚砜（DMSO）组及Lat-B组,每组12只,分别用BSS、DMSO和Lat-B局部点眼,于用药前1h及用药后1、2、3、4、5、6、24h分别测量眼压,于24h后处死动物并获取部分巩膜组织,自制巩膜滤过装置测试巩膜通透性的变化,部分巩膜组织行免疫组织化学染色以检测前部巩膜组织中基质金属蛋白酶-2（MMP-2）和组织金属蛋白酶-2抑制剂（TIMP-2）的表达。光学显微镜下观察实验兔眼部各组织结构的形态学变化。结果 Lat-B组、BSS组与DMSO组点眼前后各时间点眼压的总体变化差异有统计学意义（F=25.76,P〈0.01）,Lat-B点眼后不同时间点与点眼前比较眼压呈下降趋势,差异有统计学意义（Ftime=4.50,P〈0.01）,点眼后1h即可引起眼压降低,降眼压作用可持续24h;BSS组与DMSO组点眼前后各时间点眼压变化的差异无统计学意义（P〉0.05）;Lat-B点眼后的前部巩膜对BSS的滤过较BSS组和DMSO组明显增加,3组的总体比较差异有统计学意义（F=47.50,P〈0.01）;Lat-B组、BSS组和DMSO组MMP-2及TIMP-2表达的吸光度（A）值的总体比较差异均有统计学意义（F=28.70,F=22.30,P〈0.01）。MMP-2、TIMP-2的表达Lat-B组与BSS组比较差异有统计学意义（P〈0.01）,与DMSO组比较二者的表达均降低,差异均有统计学意义（P〈0.01）;BSS组和DMSO组间MMP-2及TIMP-2比较差异均无统计学意义（P〉0.05）。结论 Lat-B能够有效降低眼压,明显提高巩膜的房水流出易度,并可通过上调MMP-2、TIMP-2的表达导致巩膜胶原重塑。     

NEP1-40对视网膜缺血-再灌注损伤过程中视网膜细胞的保护作用

背景 视网膜缺血-再灌注损伤（RIRI）可导致细胞凋亡,凋亡是一个复杂的过程,与许多基因有关,探讨药物对RIRI后视细胞凋亡的保护作用具有重要意义. 目的 探讨Nogo-A在大鼠RIRI模型中的表达及其与细胞凋亡的关系,研究Nogo受体竞争性拮抗剂NEP1-40对视网膜细胞的保护作用. 方法 将78只SD大鼠按随机数字表法随机分为正常组、RIRI组和NEP1-40组,RIRI组及NEP1-40组大鼠分别用前房升高眼压的方法升高眼压至大鼠视网膜苍白,持续60 min,然后恢复眼压至视网膜色泽恢复,制作RIRI大鼠模型.术后6h、12 h及1、2、3、7d用过量的水合氯醛处死大鼠,制备视网膜标本.透射电子显微镜下观察各时间点各组大鼠视网膜的超微结构,采用TUNEL法检测视网膜细胞的凋亡情况,并计算细胞凋亡指数（AI）.采用免疫组织化学法检测视网膜组织中Nogo-A蛋白的表达,并采用逆转录PCR（RT-PCR）法半定量检测Nogo-A mRNA在视网膜中的表达. 结果 正常组大鼠视网膜各层结构正常;RIRI组大鼠视网膜再灌注12h后可见少量视网膜细胞器的线粒体嵴异常及空泡化,再灌注后1 ～2d可见凋亡小体;NEP1-40组视网膜的视细胞外节膜盘略疏松,部分线粒体嵴短小,空泡化,未见凋亡小体,视网膜细胞超微结构损害明显轻于RIRI组.TUNEL检测显示细胞凋亡出现于再灌注后6h,并逐渐递增,再灌注后1d凋亡细胞数目达高峰,2d后开始下降,但再灌注后3d仍可见TUNEL阳性细胞.NEP1-40组各时间点间凋亡细胞数目较RIRI组明显减少.正常组、RIRI组和NEP1-40组大鼠在不同时间点细胞AI的差异均有统计学意义（F分组=100.850,P=0.000;F时间=34.309,P=0.000）,其中RIRI组和NEP1-40组大鼠视网膜细胞AI明显高于正常组,而NEP1-40组AI明显低于RIRI组,差异均有统计学意义（均P＜0.05）.Nogo-A蛋白及其mRNA主要表达于RIRI后的视网膜,再灌注后6h大鼠视网膜中Nogo-A蛋白及其mRNA均开始增加,至再灌注id时表达达高峰,然后逐渐减弱,但再灌注后7d仍有表达.3个组大鼠不同时间点视网膜中Nogo-A蛋白的表达差异有统计学意义（F分组=164.139,P=0.000; F时间=21.772,P=0.000）,Nogo-A mRNA的表达差异有统计学意义（F分组=93.889,P=0.000;F时间=6.349,P=0.000）,NEP 1-40组和RIRI组大鼠视网膜中Nogo-A蛋白及其mRNA的表达均明显高于正常组,而NEP1-40组大鼠视网膜中Nogo-A蛋白及其mRNA在各时间点的表达均低于RIRI组,差异均有统计学意义（P＜0.05）. 结论 Nogo-A可促进RIRI后视网膜细胞的凋亡,NEP1-40能抑制Nogo-A的表达,从而减少视网膜细胞的凋亡,对RIRI后的视网膜细胞有保护作用.     

国产猪源纤维蛋白黏合剂玻璃体腔注射后对兔眼视网膜组织的生物安全性研究

背景 猪源纤维蛋白黏合剂已广泛应用于临床手术中,能够起到止血和闭合伤口的作用.目前眼科学者认为猪源纤维蛋白黏合剂在玻璃体切割术中可替代长效气体或硅油作为填充物,但国产猪源纤维蛋白黏合剂是否对视网膜有毒性作用仍在研究中. 目的 研究国产猪源纤维蛋白黏合剂在眼内应用后对视网膜组织的生物安全性. 方法 15只青紫兰兔任选一眼作为实验眼,对侧眼作为对照眼.兔眼行玻璃体切割术,实验眼术毕于玻璃体腔内注射猪源纤维蛋白胶0.5 ml,对照眼注射等量平衡盐溶液.术后1、3、7、15、30 d用裂隙灯及直接/间接检眼镜检查眼前后节的炎症反应,术后1、3、7d用Schi(o)tz眼压计测量眼压,分别于术前和术后30 d进行视网膜电图(ERG)检查,评估视网膜的功能变化,术后30 d行眼科B型超声检查.玻璃体腔内注射后第30天摘除眼球并制备视网膜切片,光学显微镜下检查视网膜的组织形态学变化,透射电子显微镜下观察视网膜的超微结构变化. 结果 实验组15只兔眼中出现并发症者7只眼,其中晶状体损伤后发生白内障者3只眼,术后增生性玻璃体病变和视网膜脱离者5只眼,眼内炎者1只眼.对照组15只兔眼晶状体损伤后发生白内障者2只眼,术中发生视网膜损伤者2只眼.眼内注射后30d实验组未出现并发症的8只眼及对照组的11只眼均未见明显的眼内炎症反应,术后眼压均正常,2个组间及手术前后各时间点间的眼压变化差异均无统计学意义(F分组=0.008,P=0.929;F时间=3.600,P=0.075).实验组及对照组间兔眼注药前后ERG a波、b波振幅的总体差异均无统计学意义(a波:F分组=0.728,P=0.405;b波:F分组=0.222,P=0.644);各组兔眼手术前后ERG a波、b波振幅的总体差异均无统计学意义(a波:F时间=0.516,P=0.482;b波:F时间=0.057,P=0.814).眼内注射后30 d,实验眼和对照眼视网膜组织层次清晰,无水肿及阳性细胞浸润,各层视网膜的细胞及视网膜光感受器、视网膜色素上皮的色素细胞形态均正常,亚细胞器结构清晰,细胞膜和核膜完整,线粒体嵴排列整齐. 结论 国产猪源纤维蛋白黏合剂玻璃体腔注射后对兔眼视网膜无毒性作用.     

特异性转化生长因子-β_2 shRNA对人眼Tenon囊成纤维细胞的抑制作用

目的观察转化生长因子-β2（TGF-β2）特异性短发夹RNA（shRNA）对人眼Tenon囊成纤维细胞（TCFs）TGF-β2表达的影响及对人TCFs增生的抑制作用。方法根据小干扰RNA（siRNA）的设计原则,针对TGF-β2基因序列特征构建特异性shRNA载体,转染培养的人TCFs。MTT比色法检测细胞的增生情况;ELISA法检测shRNA对TGF-β2蛋白表达的抑制作用。结果 TGF-β2shRNA转染组的细胞增生及TGF-β2蛋白的表达均受到抑制。转染24、48、72h后MTT比色法检测显示,TGF-β2shRNA转染组培养的Tenon囊的成纤维细胞的增生值分别为0.5426±0.05、0.5210±0.03、0.4055±0.04,明显低于阴性对照组的0.5655±0.03、0.5378±0.03、0.5268±0.04,3个组和各时间点的总体差异均有统计学意义（F组=54.691,P=0.000;Ftime=66.888,P=0.000）。ELISA法检测显示,TGF-β2shRNA转染组TGF-β2蛋白的表达水平下降,24、48、72hTGF-β2蛋白的表达量分别为（543.58±25.32）、（400.26±30.74）、（202.72±23.24）ng/L,明显低于阴性对照组的（659.78±20.95）、（547.45±24.65）、（442.87±17.43）ng/L及空白组的（721.75±30.19）、（756.61±30.19）、（787.60±18.37）ng/L,3个组和各时间点的总体差异均有统计学意义（F组=163.082,P=0.000;F时间=31.498,P=0.000）。结论 TGF-β2特异性shRNA能显著抑制人TCFsTGF-β2的表达,载体介导的TGF-β2特异性shRNA对眼前节术后的抗瘢痕化治疗具有潜在的可能性。     

α-硫辛酸对视网膜缺血-再灌注损伤大鼠视网膜中血管内皮生长因子和基质金属蛋白酶表达的影响

目的探讨α-硫辛酸对大鼠视网膜缺血-再灌注损伤中血管内皮生长因子（VEGF）和基质金属蛋白酶-9（MMP-9）表达的影响及作用机制。方法按随机数字表法将78只SPF级健康成年Wistar大鼠分为正常对照组6只及α-硫辛酸组和缺血-再灌注组各36只。α-硫辛酸组和缺血-再灌注组根据再灌注时间的不同分为6、12、24、48h,3d和7d组。采用前房灌注生理盐水升高眼压的方法建立视网膜缺血-再灌注动物模型,其中α-硫辛酸组大鼠自造模前3d开始腹腔注射α-硫辛酸100mg/（kg.d）,缺血-再灌注组大鼠以同样的方法注射等体积生理盐水。在上述时间点分别处死大鼠并摘除眼球,行苏木精-伊红染色评估各组大鼠在各时间点视网膜组织的结构变化;应用免疫组织化学法检测大鼠视网膜缺血-再灌注损伤后不同时间点视网膜组织中VEGF和MMP-9的表达,并对各组VEGF和MMP-9的表达量进行比较。结果缺血-再灌注组大鼠在再灌注后6h出现视网膜水肿和视网膜神经节细胞（RGCs）的轻度改变,随着时间的延长,RGCs的结构改变明显加重。α-硫辛酸组视网膜水肿和RGCs结构的异常变化过程同缺血-再灌注组,但程度较轻。实验前后正常对照组大鼠视网膜中未见VEGF的表达;缺血-再灌注组于再灌注后12h开始出现VEGF的表达,随着时间的延长VEGF表达逐渐增加,到再灌注后48h达到高峰。各时间点缺血-再灌注组和α-硫辛酸组VEGF在视网膜的表达水平明显高于正常对照组,差异均有统计学意义（P〈0.05）,但各时间点α-硫辛酸组VEGF在视网膜的表达水平明显低于缺血-再灌注组,差异均有统计学意义（P〈0.05）。正常对照组大鼠视网膜未检测到MMP-9的表达;缺血-再灌注组在再灌注后6h可检测到MMP-9在视网膜中的表达,24h后其表达水平达到高峰。各时间点缺血-再灌注组MMP-9的表达明显高于正常对照组（P均〈0.05）,α-硫辛酸组视网膜中MMP-9的表达与缺血-再灌注组比较明显下降,差异均有统计学意义（P〈0.05）。缺血-再灌注组视网膜VEGF和MMP-9的表达呈正相关（r=0.834,P〈0.05）。结论视网膜缺血-再灌注损伤可诱导VEGF及MMP-9的表达在视网膜中过度表达,α-硫辛酸可通过抑制视网膜缺血-再灌注损伤中VEGF及MMP-9的表达而对视网膜起保护作用。     

马来酸噻吗洛尔滴眼液预防高度近视眼LASIK术后屈光回退的随机对照研究

背景 屈光回退是高度近视眼准分子激光角膜原位磨镶术（LASIK）术后较常见的并发症,影响手术的长期稳定性.目前尚无预防LASIK术后屈光回退的方法. 目的 观察马来酸噻吗洛尔滴眼液对高度近视眼LASIK术后屈光回退的预防效应.方法 采用前瞻性干预性临床随机对照研究.选取2012年2-9月在遵义医学院附属医院行LASIK的高度近视患者60例60眼,屈光度为（-7.16±0.95）D.将患者按随机数字表法分成试验组和对照组,2个组患者术后均给予常规抗炎用药,试验组患者在术后第1天开始滴加质量分数0.5％马来酸噻吗洛尔滴眼液,每日2次,1个月后改为每天晨起点眼1次.测量2个组患者术前,术后1周及1、3、6个月的裸眼视力、最佳矫正视力（BCVA）、等效球镜度（SE）、角膜前表面曲率和眼压,并测量术前及术后1、3、6个月术眼的中央角膜厚度（CCT）,术前测算残余角膜基质厚度.采用重复测量方差分析、独立样本t检验和Bonferroni检验对2个组在不同时间点间的数据进行分析. 结果 试验组及对照组间患者术前的年龄、裸眼视力、BCVA、SE、眼压、角膜前表面曲率、CCT及残余角膜基质厚度的差异均无统计学意义（P＞0.05）.2个组间手术后不同时间点的裸眼视力差异有统计学意义（F分组=3.91,P＜0.05;F时间=3.80,P＜0.05）,其中术后6个月试验组裸眼视力优于对照组（t=2.97,P＜0.05）,试验组术后6个月裸眼视力优于术后7d,差异有统计学意义（P＜0.05）.2个组术眼在术后不同时间点BCVA的差异无统计学意义（F分组=2.44,P＞0.05;F时间 =2.31,P＞0.05）.2个组间术眼术后SE的有统计学意义（F分组=11.52,P＜0.05）,术后不同时间点术眼SE的整体比较差异有统计学意义（F时间=22.06,P＜0.05）,术后6个月试验组术眼SE高于对照组（t=2.47,P＜0.05）,术后7d及术后1个月、3个月试验组术眼的校正眼压明显低于对照组（F分组=14.83,P＜0.05）,术后2个组间CCT的增幅差异无统计学意义（F分组=0.04,P＞0.05）.术后试验组角膜前表面曲率变化平稳,但对照组随着时间的延长角膜前表面曲率逐步增加（F时间=18.73,P＜0.05）.结论 高度近视眼LASIK术后早期局部使用0.5％马来酸噻吗洛尔滴眼液能减少屈光回退,提示0.5％马来酸噻吗洛尔滴眼液通过降低眼压而阻止角膜膨隆,其可能是预防术后屈光回退的主要机制.     

糖尿病小鼠视网膜中JNK3 mRNA表达的动态变化

背景 糖尿病视网膜病变（DR）是糖尿病常见的眼部并发症,其发病机制与多种因素有关,c-jun N末端激酶（JNK）作为一种凋亡基因,在糖尿病的病理过程中发挥着重要作用,其研究已成为近些年的热点之一,而JNK3作为JNK的亚基因之一,在DR中的研究目前较少.目的 定量检测JNK3在糖尿病小鼠视网膜中的表达,探讨JNK3在DR中的作用.方法 选取SPF级6～8周龄C57BL/6雄性小鼠48只,适应性喂养1周后按照随机数字表法分为糖尿病组和正常对照组.30只糖尿病组小鼠用一次性腹腔内注射柠檬酸钠缓冲液溶解的质量分数1％链脲佐菌素（STZ）的方法诱导糖尿病模型,18只对照组小鼠腹腔内注射等容量柠檬酸钠缓冲液.分别于造模后2、4、8周摘除小鼠左眼眼球,提取视网膜组织,采用实时定量PCR法检测JNK3 mRNA在小鼠视网膜中表达的动态变化.结果 造模后2、4、8周,糖尿病组小鼠血糖水平明显高于正常对照组,差异均有统计学意义（t=-5.675、-5.498、-5.347,P＜0.01）.糖尿病组和正常对照组在造模后不同时间点小鼠视网膜中JNK3 mRNA相对表达量（A值）的差异均有统计学意义（F分组=102.345,P＜0.05;F时间 =131.679,P＜0.05）;其中造模后4周和8周糖尿病组小鼠视网膜中JNK3 mRNA相对表达量分别为3.21±0.14和5.43±0.37,均明显高于正常对照组的2.54 ±0.42和2.26±0.67,差异均有统计学意义（t=4.073、23.399,P＜0.05）;糖尿病组内比较可见,造模后8周小鼠视网膜中JNK3 mRNA相对表达量明显高于2周和4周值,差异均有统计学意义（t=10.756、16.857,P＜0.05）.结论 JNK3在糖尿病小鼠视网膜中表达量上调,其早期表达量随时间延长而增加.JNK3可能参与早期DR的发生和发展.     

重组人促红细胞生成素对大鼠视网膜缺血-再灌注损伤的保护作用

目的 制作Sprague-Dawley (SD)大鼠视网膜缺血-再灌注(RIR)损伤模型,探讨腹腔内注射重组人促红细胞生成素(rHuEPO)对急性RIR损伤所致的大鼠视网膜神经元损伤的保护作用及其对热休克蛋白72(HSP72)表达的影响.方法 采用前房灌注的方式建立RIR损伤模型,灌注压110 mm Hg(1 mm Hg=0.133kPa),缺血时间1h;腹腔注射rHuEPO.78只SD大鼠随机分组:正常组6只,EPO组、EPO+槲皮黄酮组、RIR组各24只,均以右眼为实验眼.采用免疫组织化学法和末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法(TUNEL)分别测定正常对照组和各实验组大鼠再灌注24h、48 h、72 h和1周视网膜中HSP72及凋亡细胞的表达,观察各组大鼠视网膜病理学改变.结果 ①正常组大鼠视网膜中HSP72表达微弱,各实验组大鼠视网膜中HSP72表达自再灌注12 h开始增强,24h达到高峰,随后逐渐减弱,72 h时表达稍高于正常.再灌注后各时间段,EPO组大鼠视网膜中HSP72表达均高于RIR组、EPO+槲皮黄酮组(P＜0.05).②正常大鼠视网膜中几乎没有凋亡细胞.再灌注后12 h,各实验组大鼠视网膜中可见凋亡细胞,24 h达高峰,48 h后凋亡细胞数逐渐减少;再灌注后各组大鼠视网膜中凋亡细胞数比正常组多(P＜0.05).③再灌注后,RIR组,EPO+槲皮黄酮组大鼠内层视网膜明显水肿,炎性细胞侵入,膜结构逐渐破坏;EPO组大鼠视网膜结构保持相对完整,炎性细胞相对较少.结论 ①HSP72在正常大鼠视网膜中表达微弱,RIR损伤后表达增多.腹腔注射EPO可以明显诱导大鼠视网膜中HSP72的表达增多.②EPO可以减少大鼠RIR损伤后视网膜细胞凋亡,减少视网膜内炎性细胞的浸润,保护视网膜结构,对视网膜具有明显的保护作用.其机制可能与使HSP72表达上调有关.(中国眼耳鼻喉科杂志,2012,12:30-35)