利用噬菌体表面展示技术克隆抗人DR5抗体可变区基因

目的:利用噬菌体表面展示技术制备抗人DR5单链抗体.方法:从抗DR5杂交瘤细胞中提取总RNA,RT-PCR扩增VH和VL基因,并利用重叠扩增PCR将VH和VL拼接为scFv基因.将scFv与PAK100载体通过相同的酶切位点连接后,转化大肠杆菌XL1-Blue,经VSCM13辅助噬菌体拯救,构建成鼠抗人DR5单链抗体库...     

大容量人天然噬菌体单链抗体库的构建

目的：构建大容量和具有良好多样性的人天然噬菌体单链抗体库。方法：从人外周血分离淋巴细胞，提取mRNA后用RT—PCR技术采用新设计的引物扩增VH和VL基因片段，两者分别与Linker连接后，采用改进的重叠延伸PCR法将VH基因和VL基因连接成人单链抗体（scFv）基因（VH—Linker—VL片段），继而连接到噬菌粒载体pCANTAB5E中，连接产物通过电转化方法转入大肠杆菌TG1，构建噬菌体scFv抗体库。结果：所有VH、VL亚类基因都得到了扩增和有效的连接．经电转化E.coli TG1和噬菌体的超感染，构建了总库容达到了6×10^8的单链抗体库。结论：成功地构建了一个多样性良好的人源天然噬菌体抗体库，可用于制备具有应用前景的人源抗体。     

大容量人天然噬菌体单链抗体库的构建

目的：构建大容量和具有良好多样性的人天然噬菌体单链抗体库。方法：从人外周血分离淋巴细胞,提取mRNA后用RT-PCR技术采用新设计的引物扩增VH和VL基因片段,两者分别与Linker连接后,采用改进的重叠延伸PCR法将VH基因和VL基因连接成人单链抗体（scFv）基因（VH-Linker-VL片段）,继而连接到噬菌粒载体pCANTAB5E中,连接产物通过电转化方法转入大肠杆菌TG1,构建噬菌体scFv抗体库。结果：所有VH、VL亚类基因都得到了扩增和有效的连接,经电转化E.coliTG1和噬菌体的超感染,构建了总库容达到了6×10^8的单链抗体库。结论：成功地构建了一个多样性良好的人源天然噬菌体抗体库,可用于制备具有应用前景的人源抗体。     

人源肺腺癌噬菌体抗体库的构建及筛选

目的:构建人源噬菌体单链抗体ScFv基因文库,并从中筛选出抗肺癌抗体。方法:提取肺癌患者癌旁淋巴结组织,通过RT-PCR扩增出重链可变区基因(VH)和轻链可变区基因(VL),再经剪切-重叠-延伸PCR(SOE-PCR)将VH 和VL连接得到单链抗体ScFv。将双酶切后的ScFv基因片段克隆入噬菌体表达载体pCANTAB5E,得到初级噬菌体抗体库。以肺腺癌细胞株A549为抗原对抗体库进行“吸附-洗脱-扩增”筛选富集,共进行4轮筛选,鉴定抗体库性能。结果:成功构建噬菌体单链抗体库。在亲和筛选过程中,肺癌单链抗体得到富集,收获率逐轮提高,第4轮为第1轮的115倍。随机选取10个克隆,通过ELISA法检测到其中7个与肺癌细胞呈阳性反应,阳性率为70%。结论:通过噬菌体展示技术得到肺癌相关人源单链抗体,筛选后的单链抗体能与肺腺癌细胞A549特异性结合。     

抗人β-淀粉样肽特异性单链抗体的噬菌体抗体库的构建与初步鉴定

目的:运用噬菌体展示技术构建抗人β-淀粉样肽(Aβ)特异性单链抗体的抗体库并进行初步鉴定.方法:从Aβ免疫的BALB/c小鼠脾淋巴细胞中提取总RNA,分离纯化mRNA,经逆转录合成其总cDNA.以PCR方法分别扩增出抗体的重链(VH)和轻链(VL)可变区基因片段,再经重组PCR将两基因片段由编码十五肽(Gly4Ser)3的接头连在一起,克隆到噬菌粒载体pCANTAB 5E中,转化至大肠杆菌TG1,经辅助噬菌体M13K07超感染后回收全部重组噬菌体,构建噬菌体抗体库,SDS-PAGE鉴定纯度.结果:经琼脂糖凝胶电泳分析,RT-PCR方法扩增的抗体VH和VL基因片段大小约350bp和325 bp,与预期VH,VL基因片段理论值相符.经重组PCR得到大小约750 bp的ScFv基因片段.ScFv基因片段经双酶切后成功定向克隆到噬菌粒载体,回收后构建成库容量为1.1×10<'8>的噬菌体抗体库,经SDS-PAGE鉴定,得到M,约为30000 ku,纯度较好的scFv抗体.结论:成功构建了库容量大的特异性噬菌体抗体库,为抗人Aβ特异性抗体的筛选、生物活性鉴定、临床实验诊断方法建立和治疗应用打下基础.     

人源抗Rh(D)单链抗体基因的克隆和表达

目的:构建人源抗红细胞Rh(D)抗原单链噬菌体抗体库。方法:应用噬菌体展示技术,从分泌抗Rh(D)抗体的细胞中提取总RNA,逆转录合成cDNA第一条链,多次PCR扩增和克隆抗体可变区基因(VH/VLcDNA),经重叠延伸拼接(SOE)用编码连接肽(Gly4Ser)3的互补序列组成scFv基因,经酶切克隆入载体pCANTAB5E,使之呈现于噬菌体表面。使用完整Rh+型红细胞进行四轮淘汰筛选,ELISA对所获抗体进行初步鉴定。结果:构建的噬菌体抗体库库容为1.2×107,噬菌体DNA中全长scFv基因的插入率为0.80,用辅助噬菌体援救后,得到滴度为3×108pfu/ml的初级噬菌体抗体库。以完整Rh+型红细胞进行四轮淘汰筛选,出现特异性富集。经DotELISA实验鉴定,得到1株与Rh+型红细胞特异结合的scFv噬菌体抗体。结论:运用噬菌体抗体库技术构建了人源抗红细胞Rh(D)抗原的噬菌体抗体库,为进一步对所获克隆株进行序列分析、可溶性抗体表达和纯化奠定了基础。     

人源甲状腺髓样癌噬菌体抗体库的构建及初步鉴定

目的：应用噬菌体抗体展示技术,构建大容量天然人源甲状腺髓样癌（medullary thyroid carcinoma,MTC）噬菌体单链抗体库。方法：提取ＭＴＣ病人癌周淋巴结总RNA,通过RT-PCR方法获得抗体可变区基因VH和VL基因片断,以它们为模板分别扩增VH-Linker和VL-Linker,再用剪切重叠延伸ＰＣＲ技术将之拼接组装成单链抗体可变区基因片段（single chain fragment variable,scFv）后引入酶切位点SfiⅠ和NotⅠ。将scFv基因克隆入噬菌粒栽体pCANTAB-5E后经电转入大肠杆菌Ecoli TG1,之后经辅助噬菌体M13K07超感染,构建人源MTC噬菌体单链抗体库。PCR鉴定scFv片段阳性插入率,1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆双酶切产物。结果：MTC周围淋巴结总RNA的琼脂糖电泳结果可见清晰的28 S、18 S条带;VH基因的大小约为370 bp,VL基因为350 bp,组装后的scFv基因约为750 bp。用pUC19标准质粒测定转化效率达到108 cfu/μg,scFv的阳性插入率为87.5％（21/24）。结论：成功地构建了人源MTC噬菌体展示文库,为进一步筛选具有MTC细胞特异性的人源噬菌体单链抗体奠定了实验基础。     

从大容量噬菌体抗体库中筛选人源性抗角蛋白scFv

目的从大容量噬菌体抗体库中筛选人源性抗角蛋白单链抗体(scFv),测定其特异性结合活性并进行基因序列分析。方法以混合分子量人表皮角蛋白包被固相,对构建的大容量噬菌体抗体库进行筛选,经4轮“吸附洗脱扩增”后,挑取单克隆,用ELISA法测定特异性结合活性,并对阳性克隆抗体基因进行DNA指纹分析及序列同源性分析。结果经4轮筛选,获得9株可表达抗人角蛋白单链抗体的克隆,酶切鉴定正确后,经DNA指纹分析及序列同源性分析证明为不同的抗体基因。结论利用噬菌体抗体库技术获得了人源性抗角蛋白单链抗体,为临床应用研究提供了具有更广阔应用前景的人源小分子抗体。     

人源性抗乳腺癌HER-2噬菌体单链抗体库的构建与筛选

目的：构建人源性抗乳腺癌噬菌体单链抗体（scFv）库,筛选和鉴定抗乳腺癌人类表皮生长因子受体2（HER2）特异性scFv,为HER2和CXC趋化因子受体4（CXCR4）双靶向融合蛋白的研制提供靶向HER2的高亲和力序列。 方法：取已确诊的乳腺癌患者癌旁淋巴组织,提取总RNA;构建可变区基因的T载体库,将重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）基因与pCANTAB连接肽连接,获得pCANTAB-scFv,电转化感受态大肠杆菌TG1;以M13K07辅助噬菌体进行感染,获噬菌体抗体库;利用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测筛选后获得的噬菌体抗体活性,以免疫组织化学法检测抗体亲和力,并通过测序进一步鉴定。 结果：成功构建大容量pCANTAB-scFv抗体库,获得的scFv长度为750 bp,VH和VL长度分别为375和330 kb;电转化大肠杆菌TG1后酶切验证插入片段大小正确,得到库容为2.48×108的大容量抗体库;通过噬菌体展示和淘洗筛选,富集针对乳腺癌细胞株SKBR-3表面抗原的抗体库;所得抗体对HER2有高度的亲和力和特异性,对乳腺癌组织HER2抗原也具有较高的亲和力;测序结果与人IgG抗体进行对比,所获得的scFv具有高度的人源性。 结论：主要构建了大容量人源性抗乳腺癌细胞的噬菌体scFv库,并筛选获得可特异性识别人乳腺癌HER2的高亲和力scFv,为制备以HER2为靶点的抗肿瘤HER2和CXCR4双靶向融合蛋白提供了载体。     

从大容量人源噬菌体抗体库中筛选抗黑素瘤特异性抗体

目的：用黑素瘤（MM）细胞系筛选大容量人源噬菌体抗体库，获得能与MM细胞特异性结合的人源性单链抗体（scFv）．方法：用完整的MM细胞对大容量人源噬菌体抗体库进行4轮“吸附-洗脱-扩增”筛选，并通过细胞ELISA法对随机挑选的克隆进行抗原结合活性测定，得到的阳性克隆进一步做DNA序列测定和免疫组化染色鉴定．结果：从80个随机挑选的克隆中，筛得1株抗MM细胞的抗体，该抗体对人的鳞癌细胞、角质形成细胞、黑素细胞、角蛋白、胰蛋白酶、转铁蛋白及小鼠igG等细胞或抗原的结合反应均呈阴性．免疫组化染色显示，该抗体与MM细胞系Libr的染色呈阳性，对黑素细胞和痣细胞的染色呈阴性．DNA测序结果表明，该抗体VH属于人IgG VH5亚群，VL属于人Vκ亚型．结论：通过筛选噬菌体抗体库获得到1株抗MM细胞的特异性抗体，为MM的靶向治疗研究奠定了基础．     

抗恶性疟原虫富含组氨酸蛋白Ⅱ单链抗体库的构建及筛选

目的构建抗恶性疟原虫富含组氨酸蛋白Ⅱ(Histidine-rich protein Ⅱ,HRP-Ⅱ）单链抗体库,并筛选出阳性克隆。方 法用噬菌体抗体库技术构建抗恶性疟原虫ＨＲＰ－Ⅱ单链抗体库,并以ＨＲＰ－Ⅱ为靶抗原对该库进行了三轮“亲和吸附 一援救一感染扩增”的富集,挑取单菌落筛选并鉴定阳性克隆。结果获得目的基因并成功构建抗恶性疟原虫 ＨＲＰ－Ⅱ的 单链抗体库,库容为 １０６,并从中筛选出８株阳性克隆。结论 噬菌体抗体库技术具有高效的筛选性能,抗 ＨＲＰ－Ⅱ单链 抗体的制备为其在恶性疟的免疫快速诊断方法中的应用奠定了基础。     

Modification and identification of a vector for making a large phage antibody library

Background The large phage antibody library is used to obtain high-affinity human antibody, and the Loxp/cre site-specific recombination system is a potential method for constructing a large phage antibody library. In the present study, a phage antibody library vector pDF was reconstructed to construct diabody more quickly and conveniently without injury to homologous recombination and the expression function of the vector and thus to integrate construction of the large phage antibody library with the preparation of diabodies. Methods scFv was obtained by overlap polymerase chain reaction (PCR) amplification with the newly designed VL and VH extension primers. loxp511 was flanked by VL and VH and the endonuclease ACC Ⅲ encoding sequences were introduced on both sides of loxp511. scFv was cloned into the vector pDF to obtain the vector pDscFv. The vector expression function was identified and the feasibility of diabody preparation was evaluated. A large phage antibody library was constructed in pDscFv. Several antigens were used to screen the antibody library and the quality of the antibody library was evaluated. Results The phage antibody library expression vector pDscFv was successfully constructed and confirmed to express functional scFv. The large phage antibody library constructed using this vector was of high diversity. Screening of the library on 6 antigens confirmed the generation of specific antibodies to these antigens. Two antibodies were subjected to enzymatic digestion and were prepared into diabody with functional expression. Conclusions The reconstructed vector pDscFv retains its recombination capability and expression function and can be used to construct large phage antibody libraries. It can be used as a convenient and quick method for preparing diabodies after simple enzymatic digestion, which facilitates clinical trials and application of antibody therapy.     

特异性抗SSA/Ro噬菌体抗体的制备及其基因序列分析

目的　由已构建的人源单链可变区噬菌体抗体库中制备出抗SSA/Ro单克隆抗体 ,并对这些抗体的基因序列进行分析。方法　将冻存的抗体库菌种复苏制备噬菌体抗体库。用PCR、基因序列分析及酶切的方法对其进行鉴定。以组织培养皿法对该噬菌体抗体库进行富集筛选 ,用ELISA方法对富集后次级抗体库进行鉴定。制备单克隆抗体并鉴定其特异性 ,对单克隆抗体的可变区基因序列进行测序分析。结果　所制备的噬菌体抗体库的滴度为 1 6× 10 12 cfu/ml,外源基因的插入重组率为 80 % ,插入片断为人抗体可变区基因 ,且该抗体库具有良好的多样性。富集筛选回收的噬菌体数逐渐增加 ,富集后的抗SSA/Ro噬菌体抗体次级库吸光度 (A)值为富集前的 2 8倍 ,且该次级库有良好的抗SSA/Ro特异性。经富集制备出 5个特异性抗SSA/Ro单克隆抗体 ,这些单克隆抗体重链及轻链可变区基因分别与VH1、VH3、VH4、Vκ1、Vκ2、Vκ3基因家族有高度同源性。结论　本实验室构建的scFv噬菌体抗体库可以用于特异性抗体的筛选及单克隆抗体的制备。制备出的抗SSA/Ro单克隆抗体可变区基因序列与人胚系基因比较有突变 ,为研究相关疾病的发病机理开创了新的途径     

人源抗Peroxiredoxin Ⅰ肺腺癌噬菌体抗体的制备及鉴定

目的构建人源噬菌体抗体库,从中筛选出抗PeroxiredoxinⅠ(PrxⅠ)肺腺癌人源单链抗体。方法提取肺癌患者癌旁淋巴结组织,通过RT-PCR扩增出重链可变区基因(VH)和轻链可变区基因(VL),再经剪切-重叠-延伸PCR(SOE-PCR)将VH和VL连接得到单链抗体(ScFv);将双酶切后的ScFv基因片段克隆入噬菌体表达载体pCANTAB5E,得到初级噬菌体抗体库。PCR检测TG1中ScFv基因插入率;1%琼脂糖凝胶电泳鉴定SfiI和NotI双酶切质粒的结果;以肺腺癌细胞株D549及在肺癌中高表达的抗氧化蛋白PrxI为靶抗原对抗体库进行筛选富集。将阳性克隆用IPTG诱导表达。用SDS-PAGE及Westernblotting鉴定该抗体;用ELISA法、免疫细胞化学法鉴定该抗体与人肺腺癌细胞的结合特异性。结果成功构建噬菌体单链抗体库。ScFv基因插入率为77%,双酶切鉴定检测到目的条带。在亲和筛选过程中,肺癌单链抗体得到富集,收获率逐轮提高,第6轮为第1轮的180倍。随机选取10个克隆,通过ELISA法检测到其中6个与A549细胞呈阳性反应,阳性率为60%。SDS-PAGE及Westernblottin...     

全人源抗狂犬病病毒G蛋白单链抗体制备及中和活性鉴定

目的:构建全人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库,筛选针对狂犬病病毒G蛋白不同表位的单链抗体(scFv)并鉴定其中和活性?方法:分离130例经狂犬病疫苗免疫接种志愿者的外周血淋巴细胞,提取总RNA,逆转录制备cDNA,构建全人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库?以纯化的狂犬病病毒G蛋白包板筛选,对阳性克隆进行可溶性表达,并鉴定中和活性?结果:构建全人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库,库容为5.0 × 107,经核酸序列分析,证实插入片段为scFv?经过5轮筛选,从富集的次级抗体库中随机挑出140个克隆,通过phage-ELISA鉴定得到4株核酸序列不同的scFv抗体?经His-Trap纯化后进行中和活性鉴定,获得1株有中和活性的scFv,其中和效价为0.13 IU/mg?结论:构建全人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库,获得1株具有中和活性的抗狂犬病病毒G蛋白scFv抗体,为进一步研发狂犬病治疗性抗体药物奠定了基础?