甲状腺髓样癌人源噬菌体单链抗体的筛选及初步鉴定

目的：从大容量甲状腺髓样癌（medullary thyroid carcinoma,MTC）人源噬菌体单链抗体（single chain variable fragments,scFv）库中筛选出特异的抗MTC单链抗体,并对其生物学特性进行鉴定。方法：分别以甲状腺上皮细胞TEC细胞株和MTC细胞TT细胞株为抗原进行5轮“吸附-洗脱-扩增”的富集循环,筛选出抗MTC抗体,将筛选出的阳性克隆感染E.coli HB2151;异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG）诱导抗体可溶性表达,HiTrapTM Anti E-tag柱纯化表达抗体;SDS-PAGE和Western blot检测抗体表达和相对分子质量;ELISA检测可溶性scFv的特异性和免疫活性,分为TT细胞组、SW480细胞组、TEC细胞组和PBS空白对照组,分别检测各组在酶标仪A450 nm处的吸光度;四甲基偶氮唑盐比色分析法（methyl thiazolyl tetrazolium,MTT）分别检测TT细胞组、SW 480细胞组与不同浓度svFv反应并读取A490 nm处的吸光度,设置空白对照PBS组,分别计算细胞抑制率。结果：5轮筛选后,抗体得到了明显富集。随机挑取单个细菌克隆,phage ELISA 和scFv ELISA阳性率分别为65%和50%。SDS-PAGE、Western blot结果显示MTC特异性抗体分子量为28 kD左右。ELISA结果显示,TT细胞组的吸光度（0.41±0.12）较SW 480细胞组（0.20±0.03）、TEC细胞组（0.13±0.01）、PBS空白对照组（0.07±0.01）明显增加（P=0.000）。MTT法结果显示,TT细胞组和SW 480细胞组在scFv浓度为0.1、1、10 μmol/L时,2细胞株间抑制率有统计学意义,统计量分别是t=2.881,P=0.02;t=5.073,P=0.006;t=7.324,P=0.000,且在scFv浓度为10 μmol /L时,对TT细胞的抑制率最高（0.59±0.15）％。结论：利用噬菌体抗体库技术成功获得了特异性的抗MTC人源单链抗体。     

人源肺腺癌噬菌体抗体库的构建及筛选

目的:构建人源噬菌体单链抗体ScFv基因文库,并从中筛选出抗肺癌抗体。方法:提取肺癌患者癌旁淋巴结组织,通过RT-PCR扩增出重链可变区基因(VH)和轻链可变区基因(VL),再经剪切-重叠-延伸PCR(SOE-PCR)将VH 和VL连接得到单链抗体ScFv。将双酶切后的ScFv基因片段克隆入噬菌体表达载体pCANTAB5E,得到初级噬菌体抗体库。以肺腺癌细胞株A549为抗原对抗体库进行“吸附-洗脱-扩增”筛选富集,共进行4轮筛选,鉴定抗体库性能。结果:成功构建噬菌体单链抗体库。在亲和筛选过程中,肺癌单链抗体得到富集,收获率逐轮提高,第4轮为第1轮的115倍。随机选取10个克隆,通过ELISA法检测到其中7个与肺癌细胞呈阳性反应,阳性率为70%。结论:通过噬菌体展示技术得到肺癌相关人源单链抗体,筛选后的单链抗体能与肺腺癌细胞A549特异性结合。     

人源乳腺癌噬菌体抗体库的构建及初步筛选

目的构建人源乳腺癌噬菌体单链抗体库,并筛选乳腺癌特异性单链抗体(Scfv)。方法利用乳腺癌患者癌旁淋巴组织来构建抗乳腺癌噬菌体抗体库。通过正常乳腺细胞(MCF-10F)和乳腺癌细胞(MCF-7)筛选富集后,用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测噬菌体抗体活性。结果成功的构建了1个4.2×107的噬菌体抗体库,并从该库中筛选到6株对乳腺癌细胞株MCF-7有结合活性的阳性克隆。结论从人源乳腺癌噬菌体抗体库中筛选到6株特异性噬菌体抗体,为下一步进行单链抗体的乳腺癌放射性核素显影及治疗奠定了基础。     

尘肺病噬菌体单链抗体库的构建及鉴定

目的:构建具有良好多样性的人尘肺病噬菌体单链抗体( ScFv)库.方法:收集25例尘肺病患者外周血标本共50 mL,密度梯度离心法分离淋巴细胞,Trizol法提取总RNA,逆转录后参考文献设计并合成半巢式PCR引物,扩增抗体重链(VH)和轻链(VL)可变区基因,Linker连接VH和VL,继而连接到噬菌体载体pCANT...     

人源肺腺癌噬菌体抗体库的构建及初步筛选

目的构建人源肺腺癌噬菌体单链抗体库,并筛选肺腺癌细胞A549特异性单链抗体。方法利用肺腺癌患者癌旁淋巴结组织构建肺腺癌噬菌体单链抗体库。从该抗体库中筛选特异性识别A549细胞的单链抗体,将阳性克隆菌转化E．coliHB2151进行可溶性表达。抗体亲和层析纯化后经SDS—PAGE、Westernblot鉴定,通过ELISA法鉴定其与人肺腺癌细胞结合的特异性。结果成功构建了1个4．6×10^7的噬菌体抗体库。在筛选过程中,肺腺癌噬菌体单链抗体得到富集,收获率逐轮得到提高,第5轮为第1轮的181倍。在E．coliHB2151中实现了单链抗体的可溶性表达。SDS—PAGE与Westernblot结果显示抗体相对分子质量为30×10^3左右。细胞ELISA测定结果显示可溶性抗体具有较高的特异性,能与A549细胞结合,而不与MDA—MB-435细胞结合。结论从肺腺癌病人癌肿周围淋巴结扩增免疫球蛋白基因成功地构建人源肺腺癌噬菌体单链抗体库,并从中筛选到肺腺癌特异性抗体。     

抗人β-淀粉样肽特异性单链抗体的噬菌体抗体库的构建与初步鉴定

目的:运用噬菌体展示技术构建抗人β-淀粉样肽(Aβ)特异性单链抗体的抗体库并进行初步鉴定.方法:从Aβ免疫的BALB/c小鼠脾淋巴细胞中提取总RNA,分离纯化mRNA,经逆转录合成其总cDNA.以PCR方法分别扩增出抗体的重链(VH)和轻链(VL)可变区基因片段,再经重组PCR将两基因片段由编码十五肽(Gly4Ser)3的接头连在一起,克隆到噬菌粒载体pCANTAB 5E中,转化至大肠杆菌TG1,经辅助噬菌体M13K07超感染后回收全部重组噬菌体,构建噬菌体抗体库,SDS-PAGE鉴定纯度.结果:经琼脂糖凝胶电泳分析,RT-PCR方法扩增的抗体VH和VL基因片段大小约350bp和325 bp,与预期VH,VL基因片段理论值相符.经重组PCR得到大小约750 bp的ScFv基因片段.ScFv基因片段经双酶切后成功定向克隆到噬菌粒载体,回收后构建成库容量为1.1×10<'8>的噬菌体抗体库,经SDS-PAGE鉴定,得到M,约为30000 ku,纯度较好的scFv抗体.结论:成功构建了库容量大的特异性噬菌体抗体库,为抗人Aβ特异性抗体的筛选、生物活性鉴定、临床实验诊断方法建立和治疗应用打下基础.     

抗人B型钠尿肽噬菌体抗体库的构建及噬菌体抗体的筛选

目的利用噬菌体表面展示技术构建抗人B型钠尿肽（BNP）的单链噬菌体抗体库及筛选抗人BNP的特异性单链噬菌体抗体。方法从正常人外周血淋巴细胞提取总RNA，扩增抗体重链和轻链可变区基因片段．加入连接子并构建单链噬菌体抗体库。用人BNP包被的免疫管筛选噬菌体。经过4轮的富集筛选，从最后一轮噬菌体感染的大肠杆菌TG1中随机挑选加个单菌落，用ELISA方法测定阳性噬菌体抗体．并将这些噬菌体抗体与BSA进行交叉反应试验。结果EUSA测试表明，加个单菌落中有8株吸光度较高而且交叉反应较弱的阳性噬菌体抗体，DNA测序符合预期目标。结论成功构建人B型钠尿肽噬菌体抗体库，并筛选出表达人源性BNP单克隆抗体噬菌体．为下一步抗BNP单链抗体的表达纯化及临床应用打下了基础。     

噬菌体展示技术构建重组人TNF-α单链抗体库

目的 应用噬菌体展示技术构建抗重组人肿瘤坏死因子-α(rhTNF-α)的单链抗体库.方法 利用噬菌体表面展示技术、绕过杂交瘤技术,提取经免疫BALB/c小鼠淋巴细胞总RNA,用相应引物扩增小鼠免疫球蛋白VH基因和VL基因,构建VH、VL抗体库.由Linker-primer mix经重叠延伸反应将重链可变区基因与轻链可变区基因拼接成单链抗体.再用RS primer mix以单链抗体为模板进行第二次聚合酶链反应,从而获得全套抗rhTNF-α的单链抗体基因.以SfiⅠ/NotⅠ,位点定向插入pCANTAB-5E噬菌粒载体,转化大肠杆菌TG1后,经M13KO7辅助噬菌体拯救,构建成全套抗rhTNF-α单链抗体表面展示文库.结果 成功构建了rhTNF-α全套单链抗体噬菌体表面展示文库.经M13KO7超感染后,噬斑计数滴度为2.1×1011 pfu.结论 rhTNF-α全套单链抗体噬菌体表面展示文库的构建,为研究rhTNF-α抗体结合位点,了解其结构与功能的关系以及研究用于临床免疫治疗的新型抗体打下了基础.     

甲状腺髓样癌2例及文献复习

目的：探讨甲状腺髓样癌临床病理特点及鉴别诊断要点。方法：对2例甲状腺髓样癌进行了临床资料及光镜和免疫组化染色显示,癌细胞甲状腺球蛋白（-）,降钙素（＋＋）,角蛋白（-）、CEA（＋＋）、嗜铬素（＋）,Sym（-）肿瘤间质中见有大小不一的团块状分布的淀粉样物质沉积,其刚果红染色呈阳性甲基紫染色（-）。结论：甲状腺髓样癌是甲状腺癌中较少见的一种类型,需与其他甲状腺癌相区别,其诊断主要依靠组织病理学和免疫组化。     

人破伤风免疫噬菌体抗体库的建立及鉴定

目的：建立人破伤风免疫噬菌体抗体库，筛选抗破伤风类毒素的抗体基因，并在大肠杆菌中表达可溶性Fab段。方法：从破伤风类毒素免疫志愿者中分离淋巴细胞，提取细胞总RNA，用一组人IgG Fab基因特异性引物，从合成的cDNA中经PCR扩增出抗体轻链(VL CL)和重链Fd(VH CHl)基因，分别经Xba Ⅰ／Sac Ⅰ和Spe Ⅰ／XhoⅠ酶切克隆入噬菌粒pComb3。用破伤风外毒素作为抗原进行筛选富集获得特异性抗破伤风类毒素的噬菌体抗体，切去噬菌体外壳蛋白基因Ⅲ(gⅢ)，表达可溶性人抗破伤风类毒素的Fab段。结果：经核苷酸序列分析证实，所获得的基因为人IgGFab基因；用ELISA鉴定表明，表达的人IgGFab抗体能特异性地与破伤风外毒素结合。结论：利用噬菌体抗体库技术筛选可得到与破伤风外毒素特异性结合的人抗破伤风类毒素基因工程抗体。     

人源性噬菌体抗体库中抗CEA单抗的筛选与初步鉴定

目的：探讨利用噬菌体抗体库技术制备抗CEA的人源性单抗的可行性。方法：以纯化的CEA为抗原，应用噬菌体表面呈现技术，通过3轮亲和 富集及2轮淋巴细胞吸附实验，从已构建好的人源性噬菌体抗体库中筛选出抗CEA的人源性单抗，随机挑出10株单克隆在大肠杆菌中进行表达，并采用ELISA 、SDS－PAGE及基因测序进行初步鉴定。结果：ELISA显示有9株单抗具有与CEA特异性结合的能力，挑选其中2株具有较高亲和力的单克隆，经12％SDS－PAGE蛋白电泳，在分子量约为25kd处可见一新增蛋白带，与基因编码蛋白的理论计算相符合，基因测序结果与Gene Bank等相比对具有较高的序列同源性。结论：噬菌体抗体库技术是研制人源性单抗的有效途径。     

大肠癌抗原cDNA噬菌体表达库的构建及鉴定

目的 :构建人源性大肠癌抗原cDNA噬菌体表达文库 .方法 :从人大肠癌组织中提取总RNA ,纯化mRNA ,用RT PCR反转录合成cDNA第一链 ,用LD PCR合成cDNA第二链 ,除去小于 5 0 0bp的小片段 ,与去磷酸化的λTriplEx2噬菌体连接 ,体外包装 .转染E .coliXL1 Blue大肠杆菌 ,滴定文库的滴度 ,确定文库容量大小 ,用ITPG和X gal测定重组率 .用SfiⅠ酶切鉴定插入的cDNA片段大小 .结果 :构建成含 2 .39× 10 6重组子的人大肠癌抗原cDNA噬菌体表达文库 ,重组率为 97.5 % ,插入外源cDNA片段大小范围从 1～ 4kb ,平均长约 2 .4kb .结论 :成功构建人大肠癌抗原cDNA噬菌体表达文库 ,适合于大批量筛选cDNA克隆的大肠癌相关抗原基因     

噬菌体抗体库的构建及抗AFP人单抗的筛选

目的 运用噬菌体抗体库技术,制备人源性抗ＡＦＰＦａｂ段,为进一步的研究和临床运用打下基础。方法 用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增人免疫球蛋白重链Ｆｄ及к链基因,构建噬菌体抗体库,筛选出人抗ＡＦＰＦａｂ片断,用ＥＬＩＳＡ检测其特异性结果 初步克隆出人抗ＡＦＰＦａｂ,该Ｆａｂ具有结合ＡＦＰ的活性。结论噬菌体抗体库技术绕过了细胞杂交这一步骤,较好的解决人体杂交瘤低效的难题,为人源性单抗的制备开辟了广阔的前景。     

人源天然Fab噬菌体抗体库的构建及抗c-Met抗体的筛选?鉴定

目的:构建大容量人源天然Fab噬菌体抗体库,筛选抗c-Met特异性抗体并进行初步鉴定.方法:采集20位健康成人的骨髓淋巴细胞.用PCR扩增人Fab片断抗体基因,插入载体pComb3XSS内,构建人源天然Fab抗体库.以固相化的抗原对抗体库进行6轮筛选后,随机挑选60个克隆用Phage ELISA、BstO I酶切片断分析进行检测,阳性克隆作可溶性表达和鉴定.结果:构建的Fab噬菌体抗体库的库容为1.2×109,从中筛选到1株与c-Met特异性结合的人源抗体克隆,命名为AM2-26.DNA序列分析证明为人免疫球蛋白可变区基因,Western blot证实为人源抗c-Met Fab抗体片段,ELISA特异性鉴定阳性.结论:构建了大容量人源天然Fab抗体库,从中获得1株抗c-Met人源Fab抗体片段,有望为抗肿瘤药物的研制提供新的候选分子.     

抗广州管圆线虫噬菌体抗体库的构建及初步筛选

目的以广州管圆线虫感染的小鼠脾细胞为源,构建抗广州管圆线虫抗体库,并筛选可用于广州管圆线虫病早期诊断的目的抗体。方法提取感染广州管圆线虫的小鼠脾细胞RNA,并逆转录合成cDNA第一链,PCR扩增出抗体轻链和重链基因,将轻、重链基因先后连接到表达载体pComb3上,转化大肠杆菌XLI-Blue,构建组合文库。用广州管圆线虫排泄分泌抗原(EsAg)作为筛选抗原,进行富集筛选,用ELISA法鉴定阳性克隆。结果成功构建了小鼠抗广州管圆线虫噬菌体抗体文库,库容为2.32×106,滴度为1.7×1013cfu/ml。筛选到了抗广州管圆线虫排泄分泌抗原特异性抗体克隆5株,用过氧化物酶标记的抗M13抗体进行初步鉴定,具有一定的特异性。结论构建的抗广州管圆线虫噬菌体抗体库达到了要求,为研制广州管圆线虫金标诊断试剂盒奠定了基础。     

用于大容量人源天然噬菌体抗体库的表达载体的构建及鉴定

目的构建一个应用于大容量Fab段天然噬菌体抗体库的表达载体。方法用定点突变技术将表面呈现噬菌粒载体pDF上的BssHⅡ酶切位点改为BglⅡ酶切位点,然后分别在抗体轻链和重链位置插入自杀基因SacB,构建含自杀基因的噬菌粒载体pDF-D-SacB;利用抗乙肝表面抗原抗体的基因为模板,PCR扩增重链和轻链基因片段。将PCR扩增的轻链基因和重链基因分别插入载体pDF-D-SacB内,利用电转化的方法将其转入Trans1-Blue大肠杆菌,构建2个初级质粒,再利用初级质粒超感染BSl365菌,使其轻链与重链发生重组,获得重组质粒,进一步获得抗乙肝表面抗原抗体的噬菌体。之后利用该噬菌体感染大肠杆菌Trans1-Blue进行扩增,得到大量抗乙肝表面抗原的噬菌体抗体。最后,通过酶联免疫吸附剂测定检测所获得的抗体。结果通过向pDF重轻链区域插入SacB基因,改造抗体基因克隆位点,构建了pDF-D-SacB载体;经检测,pDF-D-SacB可以表达具有功能的Fab噬菌体抗体,可以在分泌Cre蛋白酶的细菌胞内发生预期的Cre-Loxp介导的定点重组。结论所获得的含自杀基因的噬菌粒载体pDF-D-SacB适用于构建大容量噬菌体抗体库。     

抗人卵巢癌单链抗体噬菌体表面呈现文库的构建、初步筛选及鉴定

目的：构建抗人卵巢癌全套单链抗体基因噬菌体表面呈现库。方法：利用噬菌体表面呈现技术，构建基因库。经过panning筛选富集后，用ELISA方法检验抗原结合活性。结果：从单个噬菌体克隆中筛选到26个具有抗原结合活性的阳性克隆。结论：噬菌体表面呈现技术为构建抗人卵巢癌全套单链抗体基因噬菌体表面呈现库提供了一条更为有效的新途径。     

抗HCMV人源化噬菌体抗体库的构建

目的构建抗巨细胞病毒噬菌体抗体库,为制备巨细胞病毒感染治疗用单克隆抗体奠定基础.方法以巨细胞病毒感染患者外周血淋巴细胞为材料,建立噬菌体抗体库,并对其进行鉴定.结果构建完成了一个库容为6.5 ×106cfu/ml的噬菌体抗体库.结论人源化抗巨细胞病毒噬菌体抗体库的建立为下一步抗体的筛选和表达奠定了基础.