非小细胞肺癌EGFR基因突变与放射敏感性的相关性

目的 探讨表皮生长因子受体(EGFR)基因突变与非小细胞肺癌(NSCLC)放射敏感性的相关性及可能机制.方法 选取EGFR基因突变的NSCLC细胞株PC-9、H1975和EGFR野生型NSCLC细胞株A549.克隆成型实验检测放射敏感性,流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期,Western blot检测凋亡蛋白和修复蛋白表达.结果 PC-9、H1975细胞放射敏感性明显高于A549细胞,4Gy照射下克隆存活率分别为10.0％、5.5％和44.3％;4 Gy照射后48 h PC-9和H1975细胞凋亡率显著高于A549细胞,分别为18.300％、17.533％和11.733％.A549细胞发生G0/G1期阻滞显著高于PC-9、H1975细胞,4Gy照射后48 h G0/G1期细胞分别为74.480％、70.293％和57.016％.A549细胞在4Gy照射后促凋亡蛋白Bax表达缺失,凋亡蛋白Caspase-3、抗凋亡蛋白Bcl-2、修复蛋白DNA-PKcs在24 h仍有表达.而PC-9、H1975细胞在4Gy照射后Bax、Caspase-3表达增多,Bcl-2不表达,DNA-PKcs表达减少.结论 EGFR 19外显子缺失突变细胞PC-9和21外显子点突变细胞H1975,相对EGFR野生型细胞A549对放射线敏感,其机制与细胞周期G0/G1期阻滞、Bax表达增多、DNA-PKcs、Bcl-2表达降低有关.     

下调PD-L1 表达对吉非替尼耐药性非小细胞肺癌细胞的影响

目的：研究下调程序性细胞死亡配体1(programmed cell death ligand 1,PD-L1)表达对吉非替尼耐药性（gefitinibresistant,GR）非小细胞肺癌细胞的作用及机制。方法：通过RT-qPCR和Western blot检测各非小细胞肺癌细胞程序性细胞死亡1(programmed cell death 1,PD1)和PD-L1 mRNA和其蛋白表达水平;获得GR细胞H1703/GR,CCK-8检测细胞活性,Western blot检测PD1和PD-L1蛋白表达;转染sh-PD-L1进入H1703/GR细胞,CCK-8检测细胞活性,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot检测PI3K/Akt/mTOR通路相关蛋白的表达;加入PI3K/Akt/mTOR通路激活剂IGF-1,CCK-8检测细胞活性,流式细胞术检测细胞凋亡。结果：与人永生化肺上皮细胞株16HBE相比,非小细胞肺癌细胞株GLC82、A549、PC9、SK-MES-1、H1703、L78、H460、H661中PD1和PD-L1 mRNA及蛋白表达均上调（P<0.05、P<0....     

埃兹蛋白通过L1细胞黏附分子信号通路促进肺癌转移

目的 研究埃兹蛋白(Ezrin)促进人肺癌发生转移的分子机制.方法 通过RT-PCR、Western blot检测肺癌细胞系中Ezrin的表达;划痕试验检测Ezrin对肺癌细胞系迁移能力的影响;Western blot检测Ezrin调控L1细胞黏附分子(L1CAM)的机制.结果 Western blot结果显示,与低转移肺癌细胞系H460、EBC-1比较,高转移细胞系95D及PC9具有更高的Ezrin蛋白表达(P＜0.05);用基因方法沉默95D细胞Ezrin表达后(siEzrin-95D),细胞划痕试验结果发现与95D细胞比较,siEzrin-95D细胞的迁移能力明显减弱(P＜0.05).与95D及H460细胞比较,基因沉默95D及H460细胞Ezrin表达后,其L1CAM的表达明显下调(P＜0.05).结论 Ezrin可能通过调节L1CAM的表达促进肺癌转移.     

Rap2c基因真核表达质粒的构建与表达

目的：为了探讨Rap2c基因与肺癌发生的关系,克隆人Ras家族小G蛋白Rap2c的cDNA,构建其真核表达质粒并在人肺癌细胞株A549和H1299中表达。方法人骨肉瘤细胞株U2OS提取细胞总RNA,经逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）逆转录成cDNA,PCR扩增Rap2c,酶切后插入pcDNA3．1（＋）构建真核表达质粒 pcD-NA3．1（＋）-Rap2c,采用酶切及测序鉴定。重组质粒转染A 549和H 1299细胞,Western blot 检测其目的基因表达。结果双酶切及测序结果显示重组质粒pcDNA3．1（＋）-Rap2c成功构建,Werstern blot 检测到 A549和H 1299细胞有相应蛋白表达。结论成功构建人Rap2c基因真核表达质粒,为后续研究奠定了基础。     

MicroRNA 122促进吉西他滨对体外非小细胞肺癌细胞系A549的杀伤作用

目的 探讨microRNA 122（miRNA122）对细胞毒性化疗药吉西他滨对体外杀伤非小细胞肺癌细胞株的影响.方法 利用脂质体转染miRNA122的表达载体;CCK-8测定系列浓度梯度吉西他滨检测对非小细胞肺癌细胞株A549的抑制率,计算IC50值;平板克隆实验检测吉西他滨对A549细胞杀伤的影响;流式细胞仪-Annexin/PI双染实验检测吉西他滨诱导A549细胞凋亡率.结果 吉西他滨对A549细胞具有明显地体外杀伤作用,其IC50值为（78.65±5.25）nmol/L,转染miRNA122能够上调吉西他滨的活性,其IC50值为（10.26±1.18）nmol/L;流式细胞术结果显示：A549细胞凋亡率诱导转染空载体组为26.24％±1.94％,诱导转染miRNA122组为63.30％±3.96％.miRNA122能够显著上调吉西他滨诱导A549细胞凋亡率.RT-PCR和蛋白印迹实验表明,转染miRNA122能够显著上调A549细胞内miRNA122的表达水平,降低miRNA122靶基因和调控基因的表达水平.结论 miRNA122能够上调吉西他滨对非小细胞肺癌细胞系A549的体外杀伤作用.     

高表达MYH9通过激活AKT/c-Myc通路抑制非小细胞肺癌细胞凋亡

目的 探讨肌球蛋白重链9(MYH9)对非小细胞肺癌（NSCLC）细胞增殖、凋亡和对顺铂敏感性的影响并探讨其作用机制。方法 常规培养6株NSCLC细胞系（A549、H1299、H1975、SPCA1、H322、H460）和1株正常支气管上皮细胞系（16HBE）采用Western blot法检测MYH9的表达情况;采用免疫组织化学染色法检测NSCLC患者组织MYH9的表达,实验分为癌组织（49例）和癌旁组织（43例）;常规培养H1299和H1975细胞系,使用CRISPR/Cas9技术构建MYH9敲除的NSCLC细胞系,实验分为sgNC组,sgMYH9组,采用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)、克隆形成实验检测敲除MYH9对肺癌细胞增殖的影响;Western blot实验、细胞凋亡流式细胞术检测MYH9对细胞凋亡的影响;通过IC50法检测敲除MYH9的肺癌细胞对顺铂敏感性的影响,实验分为sgNC组、sgMYH9组;培育小鼠肿瘤异种移植物模型验证MYH9体内生物学功能,实验分为sgNC组、sgMYH9组。结果与癌旁组织相比,MYH9在癌组织中上调（P<0.001）,高表达患者具有更短的生...     

lncRNA ATP6V1B1-AS1对非小细胞肺癌增殖与侵袭的作用及其机制

目的 探究长链非编码RNA(lncRNA) ATP6V1B1-AS1对非小细胞肺癌增殖与侵袭的作用及其机制。方法 实时定量PCR(qRT-PCR)检测非小细胞肺癌细胞系（A549、SK-MES-1、1299、H460）及正常人支气管上皮细胞系（16-HBE）中ATP6V1B1-AS1的表达;从UCSC Xena数据库下载癌症基因组图谱（TCGA）泛癌数据集,分析泛癌中ATP6V1B1-AS1表达情况。采用CCK8实验、Transwell实验检测对照组、过表达ATP6V1B1-AS1组、敲减ATP6V1B1-AS1组细胞增殖及侵袭能力;Western blotting检测侵袭相关蛋白E-cadherin、MMP9、Snail表达。通过生物信息学方法构建ATP6V1B1-AS1参加调控的内源竞争RNA(ceRNA)网络,分析ATP6V1B1-AS1对非小细胞肺癌增殖与侵袭可能的作用机制。利用基因本体（GO）数据库及京都基因和基因组数据库（KEGG）富集分析ATP6V1B1-AS1参与调控的生物学功能。结果 与正常人支气管上皮系比较,非小细胞肺癌细胞系A549、 H460、H1299、SKM...     

厄洛替尼对非小细胞肺癌增殖和自噬的影响

目的:探讨厄洛替尼对人非小细胞肺癌细胞HCC827?A549?H1299增殖及自噬的影响?方法:将体外培养的人肺癌HCC827?A549?H1299细胞株分为对照组(CON组)?溶剂对照组(DMSO组)和厄洛替尼处理组,采用CCK-8法检测厄洛替尼对细胞增殖的抑制作用,采用Western blot及细胞免疫荧光法检测自噬相关蛋白LC3?Beclin-1表达?结果:厄洛替尼以剂量依赖的方式抑制HCC827?A549?H1299细胞增殖,增殖抑制率由高到低分别为HCC827?A549?H1299,3株细胞的半数抑制浓度分别为8.72?32.09?87.46 μmol/L;与对照组相比,厄洛替尼显著上调LC3-Ⅱ及Beclin-1表达 (P < 0.05);厄洛替尼诱导HCC827?A549?H1299细胞株自噬,且其诱导作用呈剂量依赖性(P < 0.05)?结论:厄洛替尼选择性抑制非小细胞肺癌增殖,并诱导非小细胞肺癌细胞自噬?     

CRISPR/Cas9系统构建ROCK2基因敲除肺癌细胞系

目的 利用CRISPR/Cas9编辑系统对人肺癌细胞系A549、H460细胞中Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶2(ROCK2)基因进行稳定敲除,并对其敲除效果进行验证。初步探讨ROCK2基因敲除肺癌细胞株的细胞水平上的功能改变。方法 利用Rock-2 CRISPR 质粒和Rock-2 HDR 质粒转染构建A549、H460 ROCK2基因敲除稳定细胞株。蛋白质印迹法验证敲除效果、用定量逆转录-聚合酶链反应(RT-qPCR)检测ROCK2基因的mRNA表达水平。平板克隆形成实验、MTT法检测各细胞株的增殖能力。结果 A549、H460肺癌细胞中ROCK2基因稳定敲除株构建成功。与原始细胞株相比,ROCK2敲除株细胞中的蛋白表达水平完全缺失,细胞内的mRNA表达水平显著下降,而且能降低A549、H460肺癌细胞的增殖能力。结论 利用CRISPR/Cas9基因编辑系统获得ROCK2基因敲除的肺癌细胞系,为进一步研究ROCK2对肺癌生长的影响奠定基础。     

SIRT1对肺癌A549细胞增殖和迁移的影响

目的 通过调节肺癌A549细胞中沉默信息调节因子1(SIRT1)的表达,探讨SIRT1对肺癌细胞增殖和转移的影响及其分子机制.方法 培养肺癌A549细胞,用重组腺病毒感染A549细胞上调/下调SIRT1的表达;通过MTT实验、克隆形成实验、划痕实验和Transwell迁移实验检测上调/下调SIRT1表达对肺癌A549细胞增殖和转移的影响;干扰SIRT1表达后用Western blot检测SIRT1对肺癌A549细胞中上皮细胞向间质细胞转化(EMT)相关蛋白标记物ZO-1、β-连环蛋白(β-catenin)、Snail和ZEB1表达的影响.结果 上调/下调SIRT1表达对肺癌A549细胞增殖无明显影响,但是可以促进/抑制肺癌A549细胞迁移;下调SIRT1表达后EMT相关上皮性标记蛋白ZO-1表达增多,间质性标记蛋白β-catenin、Snail和ZEB1表达减少.结论 SIRT1可能通过影响EMT相关标记蛋白的表达促进肺癌A549细胞迁移.     

人肺癌组织细胞中HIN-1基因甲基化分析

目的:HIN-1(High in normal-1)是新近鉴定的一个抑癌基因,在乳腺癌细胞中,HIN-1启动子区的高甲基化导致其表达沉默。本研究拟探讨肺癌组织和6种肺癌细胞株中抑癌基因HIN-1启动子区内的甲基化修饰水平。方法:甲基化特异性PCR(MSP)和Biosulfite(亚硫酸氢钠)测序法鉴定样品中HIN-1启动子内CpG甲基化状态,RT-PCR法检测5-aza-dc处理前后HIN-1在细胞内的表达水平。结果:在60例肺癌样本中,HIN-1启动子甲基化阳性样本为35例(阳性率58.3%),而5例正常肺组织样品均为阴性反应。采用RT-PCR法分析了肺癌细胞株H157,H358,H1299,A549,H727,DMS53内HIN-1基因的表达水平,发现前4种细胞株内HIN-1表达水平极低,也是在这4种肺癌细胞中,HIN-1基因启动子呈高甲基化状态。用去甲基化试剂5-aza-dc处理上述4种细胞96h后,所有这4种细胞内均出现HIN-1基因的重新活化。结论:抑癌基因HIN-1启动子高甲基化导致的HIN-1表达抑制可能是肺癌发生发展的重要因素。     

电离辐射对肺癌H460细胞凋亡的影响及其机制

目的：以RNA干扰（RNAi）沉默肺癌H460细胞ATRX基因,探讨电离辐射对肺癌H460细胞凋亡的影响及其作用机制。方法：以靶向ATRX基因的慢病毒表达载体转染293T细胞,所得慢病毒2次感染肺癌细胞H460,通过puromycin阳性筛选获得ATRX 沉默的细胞模型,命名为sh-ATRX1-H460、sh-ATRX2-H460和sh-ATRX3-H460细胞,以sh-control-H460细胞作为对照。根据沉默结果分为sh-control-H460组和sh-ATRX3-H460组,分别给予0、2和8 Gy X射线照射。Western blotting法检测细胞中ATRX、多聚腺苷酸二磷酸核糖基聚合酶1（PARP1）和caspase-3蛋白表达量;AnnexinⅤ-FITC/PI试剂盒和流式细胞术检测各组细胞凋亡率。结果：成功获得ATRX沉默的肺癌sh-ATRX3- H460细胞模型。与照射前比较,2和8 GyX射线照射后sh-control-H460组细胞中ATRX蛋白表达量增加,sh-ATRX3-H460组细胞中无ATRX蛋白表达;与照射前比较,照射后sh-control-H460组和sh-ATRX3-H460组细胞凋亡率均明显升高（P<0.05或P<0.01）;8 Gy X线照射后sh-ATRX3- H460组细胞凋亡率明显高于sh-control-H460组（P<0.01）;2组细胞中cleaved PARP1蛋白表达量均增加且规律相似;sh-control-H460组细胞中procaspase-3蛋白表达量无明显变化,8 Gy X射线照射后sh-ATRX3-H460组细胞中procaspase-3蛋白表达量明显增加。结论：RNAi可以实现ATRX沉默,ATRX沉默能够增加辐射诱导的细胞凋亡,其机制可能与PARP1-caspase-3通路有关联。     

沉默lncRNA-UCA1对乏氧诱导NSCLC细胞A549放射抵抗的作用机制

目的探究沉默长链非编码RNA尿路上皮癌相关基因1(lncRNA-UCA1)对乏氧诱导的非小细胞肺癌(NSCLC)细胞A549放射抵抗的作用机制。 方法选取NSCLC细胞A549及人正常支气管上皮细胞HBE,平板克隆实验、qRT-PCR分别检测不同NSCLC细胞在常氧和乏氧状态下对放射的敏感性及lncRNA-UCA1的表达水平。将A549细胞实验分为si-NC组(未干预)及si-RNA组(转染lncRNA-UCA1)。流式细胞术检测乏氧状态下两组细胞放射敏感性、细胞分期和凋亡率。裸鼠成瘤实验检测乏氧状态下两组裸鼠成瘤能力。Western blotting检测两组B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(BAX)、磷酸化蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶(p-Akt)及磷酸化雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)含量。 结果A549细胞放射敏感性显著高于HBE;乏氧状态下A549细胞lncRNA-UCA1表达水平显著高于常氧状态。沉默lncRNA-UCA1可以逆转放射诱导的周期阻滞,诱导细胞凋亡。与si-NC组比较,si-RNA组肿瘤增殖变慢,肿瘤体积变小,p-Akt、p-mTOR和Bcl-2蛋白含量显著下调,BAX蛋白含量显著上调。 结论沉默lncRNA-UCA1能激活Akt/mTOR通路抑制NSCLC A549细胞的放射抵抗,增加其放射治疗敏感性。     

p14ARF基因功能性恢复对人肺癌细胞放射敏感性的影响

目的 了解专职调控细胞周期的ｐ１４ＡＲＦ蛋白功能恢复或增强能否影响体外肺癌细胞的放射敏感程度。方法 选择了４株具有不同基因背景的肺癌细胞系,为综们引入人野生型ｐ１４ＡＲＦ基因。用ＲＴ－ＰＣＲ、Ｗｅｓｔｅｒｎ蛋白印迹和免疫组化检测外源性、ｐ１４ＡＲＦ人主使ＲＮＡ及蛋白表达,并筛选出阳性克隆,以母细胞系和转染空载体的阴性细胞为对照,分析转染ｐ１４ＡＲＦ的细胞在周期分布、放射存活分数及放射诱导的凋亡比例     

圆柱瘤基因（CYLD）的增强表达介入Fas/FasL途径诱导人肺癌细胞株A549/H460坏死的研究

目的探讨圆柱瘤基因（CYLD）在肺癌细胞株A549/H460的表达,及增强其表达对Fas/FasL途径诱导肺癌细胞死亡的影响,并探讨其可能的机制。方法选取5例肺腺癌手术患者癌组织标本作为实验组,自身癌旁正常组织作为对照组,进行CYLD基因实时荧光PCR定量分析;肺癌细胞株A549/H460分别进行CYLD基因增强质粒转染,同样采取实时荧光定量PCR及统计学检验对转染效果进行分析;转染前后的A549/H460细胞株FasL膜蛋白刺激进行培养24 h,通过流式细胞分析细胞死亡情况。结果 5例癌组织和癌旁正常组织均有CYLD表达,且差异有统计学意义（P〈0.05）,对照组为实验组的2.53倍;CYLD基因在A549细胞的表达较转染前高1.40倍,在H469细胞则比转染前高1.83倍;A549/H460细胞的坏死率较转染前增加,尤其是在提前加入zVAD-fmk后进行Fas信号诱导坏死率增加显著。结论肺癌细胞CYLD基因的表达较正常肺组织下调,有效增强肺癌细胞株A549/H460的CYLD基因表达后,FasL膜蛋白可通过Fas信号诱导其显著坏死。     

APE1在非小细胞肺癌中的表达特点及其与预后的关系

目的 探讨脱嘌呤/嘧啶核酸内切酶(apurinic/apyrimidinic endonuclease, APE1) 在非小细胞肺癌中的表达特点及其与患者预后的关系.方法 应用免疫组化方法检测103例非小细胞肺癌组织和36例正常肺组织中APE1的表达情况,按染色强度将其分为低表达组和高表达组,并分析APE1在非小细胞肺癌表达情况与临床病理及患者预后的关系.结果 正常肺组织及肺癌组织均有APE1表达,但正常肺组织以细胞核表达为主,肺癌组织主要在细胞质表达;APE1的表达与患者的年龄、性别、肿瘤大小、有无淋巴结转移及组织类型无明显关系;生存分析显示APE1的表达强弱与患者的预后明显相关.结论 APE1蛋白表达增强与定位的改变与肺癌发生及发展有关,APE1基因表达增强可能是非小细胞肺癌患者预后不良的指标之一.     

环巴胺选择性增加肺癌细胞放射增敏的研究

目的 研究环巴胺对肺癌细胞和正常肺上皮细胞的放射敏感性的影响.方法 采用MTT测定细胞的生长和存活率;采用克隆形成实验观察环巴胺对肺癌细胞放射敏感性的影响;蛋白免疫印迹法检测Shh蛋白的表达;siRNA转染NIH-H226细胞观察降低Shh的表达对放射敏感性的影响.结果 MTT结果显示2.5 μmol/L环巴胺24 h处理对本实验研究的所有肺癌细胞系和正常肺上皮细胞系的生长和增殖未见明显的影响.采用2.5 μmol/L剂量的环巴胺预处理明显增加了NIH-H520、NIH-H1437、NIH-H1975、A549和NIH-H226 5种人肺癌细胞的放射敏感性,而并不影响IMR90、CCD-16Lu和BEAS-2B 3种正常肺上皮细胞的放射敏感性.在5种肺癌细胞系中可以检测到Shh蛋白不同程度的表达,而3种正常肺上皮细胞无Shh蛋白表达.Shh-siRNA转染的NIH-H226细胞的放射敏感性明显提高.结论 环巴胺可以降低肺癌细胞中的Shh蛋白表达水平.采用Shh-siRNA明显降低肺癌细胞中Shh蛋白表达,增加了细胞的放射敏感性,但抑制了环巴胺的放射增敏疗效.本实验结果证实环巴胺可以选择性提高肺癌细胞的放射治疗敏感性,调节Shh表达可能是其重要的机制之一.