氯化锂对人眼Tenon 囊成纤维细胞增殖的影响

目的：观察氯化锂（Lithium chloride）对人眼Tenon囊成纤维细胞（human Tenons capsule fibroblasts, HTFs）体外生长的抑制效应,并探讨其作用机制。 方法：磺基罗丹明（SRB）法和BrdU法检测细胞生长抑制率;采用流式细胞技术（FCM）检测细胞凋亡和细胞周期的变化;Hoechst 33258染色后荧光显微镜观察细胞形态学的改变。 结果：在40~160mmol/L范围内,氯化锂能够抑制HTFs的增殖,且呈剂量与时间依赖性。氯化锂使HTFs阻滞于G₂/M期,且能诱导细胞凋亡,高浓度组尤为明显。 结论：氯化锂能抑制HTFs增殖,机制为诱导细胞凋亡,并将细胞阻滞于G₂/M期。     

羟基喜树碱对人眼Tenon蒺s囊成纤维细胞的抑制作用

目的：研究羟基喜树碱（HCPT）对人眼Tenon＇s囊成纤维细胞（human Tenon＇s capsule fibroblasts,HTFs）的细胞周期、细胞毒性的影响,探讨其抗纤维化作用机制。方法：取本院眼库新鲜眼球（〈6h）的Tenon＇s囊组织,用组织块培养法进行成纤维细胞体外培养;流式细胞仪测定HCPT和丝裂霉素C（MMC）对HTFs细胞周期的影响;台盼蓝染色法鉴定HCPT和MMC对HTFs的抑制作用是否由药物的细胞毒性引起;RT-PCR检测HCPT、MMC作用24h后HTFs的Smad7 mRNA基因表达。结果：HTFs体外生长良好,可用于实验研究。不同浓度HCPT（0,0.25,1,4mg/L）作用后的HTFs细胞周期与对照组相比,G2期细胞百分数的组间差异均有统计学意义（P〈0.05）;不同浓度MMC（0,0.025,0.1,0.4mg/L）作用后的HTFs细胞周期与对照组相比,G1期细胞百分数的组间差异均有统计学意义（P〈0.05）。不同浓度HCPT和MMC作用后的HTFs活细胞率和空白对照组比较,差异均无统计学意义（P〉0.05）。4mg/LHCPT,0.4mg/LMMC作用HTFs24h后,Smad7 mRNA表达水平与空白对照组比较差异有统计学意义（P〈0.05）。结论：HCPT将HTFs阻滞于G2期,MMC将HTFs阻滞于G1期;HCPT,MMC抑制HTFs的作用和药物的细胞毒性无关;HCPT抑制HTFs的增殖可能是通过上调Smad7mRNA的表达阻断TGF-茁信号通路实现的。     

阿昔洛韦对体外培养人眼Tenon囊成纤维细胞增殖迁移的影响

目的:探索阿昔洛韦(ACV)对体外培养人眼Tenon囊成纤维细胞(HTFs)的增殖和凋亡的影响以及作用机制。方法:将HTFs分为ACV处理组和空白组;CCK8检测不同浓度梯度下的细胞增殖速率,划痕实验检测HTFs迁移能力,流式细胞术检测HTFs凋亡以及细胞周期。结果:与空白组相比,ACV处理组(终浓度分别为1.125、2.25、3.375、4.5mmol/L)HTFs增殖速率显著降低(P<0.05),且呈浓度依赖性。4.5mmol/L ACV处理组划痕细胞迁移率显著降低(P<0.05),细胞凋亡率显著增加(P=0.0005),细胞周期G0/G1期峰值升高(P=0.0011),S期下降(P=0.0006),细胞周期被阻滞在G0/G1期。结论:阿昔洛韦可以通过阻滞HTFs周期促进细胞凋亡,抑制HTFs的增殖和迁移。     

K-115增强自噬调控TGF-β1诱导的人Tenon囊成纤维细胞活化

目的：研究K-115对人Tenon囊成纤维细胞(HTFs)增殖和迁移的影响,并探讨其相关作用机制,为青光眼术后抗瘢痕治疗提供新思路。

方法：选取2018-09/2019-09于河北省人民医院行青光眼手术患者的Tenon囊组织,采用组织块法进行HTFs原代培养,应用转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导HTFs模拟青光眼滤过性手术后的细胞活化模型,并采用K -115处理细胞。将细胞分为4组：对照组采用溶剂二甲基亚砜(DMSO)处理; TGF-β1组采用10μg/L TGF-β1处理24h; TGF-β1+5 K-115组采用5μmol/L K-115预处理2h后加入10μg/L TGF-β1处理24h; TGF-β1+10 K-115组采用10μmol/L K-115预处理2h后加入10μg/L TGF-β1处理24h。通过细胞增殖实验观察细胞的增殖能力; 划痕试验检测细胞的迁移能力; 透射电子显微镜观察细胞内自噬小体的形成; Hoechst 33342/PI染色观察细胞凋亡情况。

结果：细胞增殖实验结果提示K-115可以抑制TGF-β1诱导的HTFs增殖; 划痕试验提示K-115可以抑制TGF-β1诱导的HTFs迁移; 透射电子显微镜结果显示K-115可以增强TGF-β1诱导的HTFs自噬。Hoechst 33342/PI染色提示K-115并未诱导细胞凋亡。

结论：K-115可能是通过增加HTFs自噬而非诱导凋亡机制调控TGF-β1诱导的HTFs增殖及迁移能力。     

汉防己甲素抑制人眼Tenon囊成纤维细胞的凋亡效应

目的研究汉防己甲素（Tet）抑制人眼Tenon囊成纤维细胞（TCFs）的凋亡效应。方法用组织块混合消化液培养法体外培养人眼TCFs,并对培养的传代细胞进行形态学鉴定。通过透射电镜、TUNEL法和流式细胞仪观察Tet抑制人眼TCFs的凋亡作用。结果人眼TCFs体外生长良好。透射电镜下见Tet处理后的人眼TCFs细胞质固缩,呈现凋亡表现;TUNEL法可见Tet组出现大量的阳性凋亡细胞;流式细胞仪检测TCFs经Tet作用后G0／G1期细胞减少22．2％,S期细胞增加20．53％,G2／M期细胞增加1．6％,Tet抑制TCFs细胞周期于G,期,Tet组凋亡率明显高于对照组（P=0．000）。结论Tet可以诱导人眼TCFs发生凋亡,进而发挥其抑制增生的作用。     

芹黄素对人眼Tenon囊成纤维细胞增生的影响

背景 青光眼滤过手术后人Tenon囊成纤维细胞(HTFs)的增生是滤过手术失败的丰要原因,寻找抑制术后HTFs增生的药物可提高滤过手术的成功率. 目的 观察芹黄素对HTFs体外生长的抑制效应并探讨其作用机制.方法 斜视手术中获取的人眼Tenon囊组织剪成1 mm×1 mm×1 mm的组织块,进行原代培养,免疫荧光法进行细胞波形蛋白检测以鉴定培养的HTFs.取第3～5代HTFs接种于96孔板中,加入0、20、40、80、160 μmol/L芹黄素后继续培养,于24、48、72 h后分别取一块96孔板,在酶联免疫检测仪上检测560 nm波长处各组细胞的吸光度(A560)值,磺基罗丹明B(SRB)法测定细胞的增生能力.分别在培养基中加入40、80、160 μmol/L芹黄素,同时在不同浓度芹黄素组培养基中均加入10 μg/L BrdU,继续培养48 h,在各组同一个视野下分别拍摄荧光显微镜和光学显微镜照片,计算BrdU的标记率,以未添加任何芹黄素(0μmol/L)组为对照组.用Hoechst 33258染色后在荧光显微镜下观察培养细胞的形态学改变,采用流式细胞技术检测细胞的凋亡情况和细胞周期的变化. 结果 培养的细胞生长状态良好,免疫荧光法检测可见细胞对波形蛋白呈阳性反应,为细胞质中均匀的绿色荧光,确定培养的细胞为HTFs.SRB法检测结果显示,HTFs的增生值(A560)随着芹黄素浓度的增加而逐渐下降,同浓度芹黄素组HTFs A560值随着作用时间的延长逐渐下降,差异均有统计学意义(F组别=480.306,P=0.000;F时间 =555.144,P=0.000).0、40、80 μmol/L芹黄素作用HTFs 48 h后BrdU的标记率分别为(87.860±0.632)％、(61.520±4.306)％、(23.480±4.472)％,各组之间的总体比较差异有统计学意义(F=299.347,P=0.000),其中40 μmol/L、80 μ mol/L芹黄素组HTFs BrdU的标记率均明显低于0 μmol/L芹黄素组,差异均有统计学意义(P＜0.05).Hoechse 33258染色发现,不同浓度芹黄素组的细胞数目减少,随着芹黄素浓度的增加,细胞核固缩和变形的细胞数目增加.流式细胞术检测发现,随着芹黄素浓度的增加,G0/G1期细胞的百分数逐渐增加,而S期和G2/M期细胞的百分数逐渐下降,差异均有统计学意义(FG0/G1 =58.621,P=0.000;Fs=32.357,P=0.001;Fc2/M =83.998,P=0.000).0、40、80、160 μmol/L芹黄素作用72 h后,细胞的凋亡率分别为(4.77±0.21)％、(13.24-±1.35)％、(18.33±1.86)％、(31.58±2.77)％,4个组的总体差异有统计学意义(F=204.791,P＜0.05). 结论 芹黄素通过诱导细胞凋亡,并将细胞阻滞于G0/G1期而抑制HTFs的增生,其作用呈剂量和时间依赖性.     

ILK SiRNA对TGF-β2诱导的人Tenon囊成纤维细胞增殖和凋亡的影响

目的：探讨小干扰RNA(the small interference RNA,SiRNA)沉默整合素链接激酶(integrin-linked kinase,ILK)基因对转化生长因子-β₂(transforming growth factor beta 2,TGF-β₂)诱导的人Tenon囊成纤维细胞(human Tenon fibroblasts,HTFs)增殖和凋亡的影响。

方法：体外培养HTFs细胞,波形蛋白(Vimentin)和角蛋白(keratin)免疫荧光染色进行鉴定。实验分组包括NC组：正常对照HTFs; H+T组：HTFs+5μg/L TGF-β₂; H+T+NC SiRNA组：HTFs+5μg/L TGF-β₂+50nmol/L阴性对照SiRNA; H+T+ILK SiRNA组：HTFs+5μg/L TGF-β₂+50nmol/L ILK SiRNA。50nmol/L ILK SiRNA转染HTFs细胞,5μg/LTGF-β₂刺激后,分别利用Western-blot检测细胞内ILK的蛋白表达,CCK-8检测细胞增殖能力,Hoechst 33342/PI双染检测细胞凋亡。

结果：Western-blot结果显示,TGF-β₂可以明显上调HTFs细胞内ILK的表达,ILK SiRNA可以明显抑制TGF-β₂诱导的ILK蛋白表达(P<0.05)。CCK-8检测结果显示,5μg/L TGF-β₂可以促进HTFs细胞增殖,ILK SiRNA转染后48h,细胞的增殖明显受到抑制,且低于正常对照组(P<0.05)。Hoechst 33342/PI双染结果显示,TGF-β₂并不诱导HTFs细胞发生凋亡(P>0.05),但ILK SiRNA可以诱导HTFs细胞发生明显凋亡,并出现少量坏死细胞(P<0.05)。

结论：ILK SiRNA可以抑制TGF-β₂诱导的HTFs增殖,并诱导HTFs细胞发生凋亡。     

小檗胺抑制兔Tenon囊和滤过道内成纤维细胞增殖的实验研究

目的:研究钙调素拮抗剂小檗胺(berbamine,BER)对兔Tenon囊成纤维细胞和兔小梁切除术后滤过道内成纤维细胞增殖的抑制作用。方法:体外培养兔Tenon囊成纤维细胞,经不同浓度BER处理不同时间后,细胞计数Kit8(CCK8)法检测BER对兔Tenon囊成纤维细胞增殖的抑制作用,流式细胞仪检测其凋亡率及细胞周期的变化。HE染色检测BER对兔小梁切除术后滤过道内成纤维细胞增殖的抑制作用。结果:兔Tenon囊成纤维细胞经不同浓度BER处理不同时间后细胞增殖受到抑制,并呈时间剂量依赖性。流式细胞仪检测发现BER处理后兔Tenon囊成纤维细胞呈现G1期阻滞,细胞凋亡率明显增加,20mg/LBER处理9h,细胞凋亡率从0.64%增加到31.86%。HE染色显示BER显著抑制兔小梁切除术后滤过道内成纤维细胞的增殖。结论:小檗胺在体内外均能抑制成纤维细胞的增殖,其可能是通过诱导细胞凋亡方式抑制兔Tenon囊和滤过道内成纤维细胞的增殖。     

黄芩素对人眼球筋膜囊成纤维细胞增生的影响

目的探讨黄芩素对人眼球筋膜囊成纤维细胞（human Tenon’s capsule fibroblasts，HTCFs）增生的抑制作用。方法采用MTT法检测黄芩素对体外培养的HTCFs增生的影响，并计算细胞生长抑制率为50％时黄苓素的药物浓度，用免疫组织化学法分析观察黄芩素对HTCFs增殖细胞核抗原表达的影响，流式细胞仪检测黄芩素对HTCFs细胞周期的影响。结果黄芩素可以抑制体外培养的HTCFs增生，且抑制能力与药物剂量成正比。50％细胞生长抑制率时的药物浓度为23．70μmol · L^-1。当黄芩素浓度≥30μmol · L^-1时能剂量依赖性地抑制细胞对增殖细胞核抗原的表达（P〈0．01）。流式细胞仪检测黄芩素可以将HTCFs的细胞周期阻滞在G0／G1期，以作用后48h最为显著。黄芩素还可以诱导HTCFs凋亡，以作用后12h的凋亡峰值最高（10．6％），且坏死细胞碎片较对照组显著增多。结论黄芩素既可以抑制HTCFs的增生，又可以诱导它的凋亡。黄芩素有望成为翼状胬肉和青光眼术后抗增生药物。     

汉防己甲素诱导人眼Tenon囊成纤维细胞的凋亡效应

目的 研究汉防己甲素(Tet)抑制人眼Tenon囊成纤维细胞(TCFs)的凋亡效应.方法 用组织块混合消化液培养法体外培养人眼TCFs,并对培养的传代细胞进行形态学鉴定.通过透射电镜、TUNEL法和流式细胞仪观察Tet抑制人眼TCFs的凋亡作用.结果 人眼TCFs体外生长良好.透射电镜下见Tet处理后的人眼TCFs细胞质固缩,呈现凋亡表现;TUNEL法可见Tet组出现大量的阳性凋亡细胞;流式细胞仪检测TCFs经Tet作用后G_0/G_1期细胞减少22.2%,S期细胞增加20.53%,G_2/M期细胞增加1.6%,Tet抑制TCFs细胞周期于G1期,Tet组凋亡率明显高于对照组(P=0.000).结论 Tet可以诱导人眼TCFs发生凋亡,进而发挥其抑制增生的作用.     

羟基喜树碱对人眼Tenon's囊成纤维细胞的抑制作用

目的：研究羟基喜树碱(HCPT)对人眼Tenon's囊成纤维细胞(human Tenon's capsule fibroblasts, HTFs)的细胞周期、细胞毒性的影响,探讨其抗纤维化作用机制。

方法：取本院眼库新鲜眼球(<6h)的Tenon's囊组织,用组织块培养法进行成纤维细胞体外培养; 流式细胞仪测定HCPT和丝裂霉素C(MMC)对HTFs细胞周期的影响; 台盼蓝染色法鉴定HCPT和MMC对HTFs的抑制作用是否由药物的细胞毒性引起; RT-PCR检测HCPT、MMC作用24h后HTFs的Smad7 mRNA基因表达。

结果：HTFs 体外生长良好,可用于实验研究。不同浓度HCPT(0,0.25,1,4mg/L)作用后的HTFs细胞周期与对照组相比,G2期细胞百分数的组间差异均有统计学意义(P<0.05); 不同浓度MMC(0,0.025,0.1,0.4mg/L)作用后的HTFs细胞周期与对照组相比,G1期细胞百分数的组间差异均有统计学意义(P<0.05)。不同浓度HCPT和MMC作用后的HTFs活细胞率和空白对照组比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。4mg/L HCPT,0.4mg/L MMC作用HTFs 24h后,Smad7 mRNA表达水平与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。

结论：HCPT将HTFs阻滞于G2期,MMC将HTFs阻滞于G1期; HCPT,MMC抑制HTFs的作用和药物的细胞毒性无关; HCPT抑制HTFs的增殖可能是通过上调Smad7 mRNA的表达阻断TGF-β信号通路实现的。     

姜黄素抑制人血管内皮细胞增殖的研究

目的观察姜黄素对体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖和凋亡的影响,寻找辅助治疗和预防翼状胬肉复发的新方法。方法用0~160μmol/L姜黄素作用体外培养的HUVEC,24~96h后观察不同浓度姜黄素对HUVEC的影响。MTT法及免疫组织化学染色增殖细胞核抗原(PCNA)检测细胞生长活性,流式细胞仪测定细胞周期时相变化。结果在40~160μmol/L浓度作用24~72h范围内,姜黄素可剂量和时间依赖性的抑制HUVEC增殖(P<0.05)。20,40,80,160μmol/L姜黄素作用24h后,流式细胞仪检测结果发现,姜黄素作用组均出现典型的亚二倍体凋亡峰,G0/G1期细胞百分比上升(P<0.05),S期细胞百分比下降(P<0.05),说明细胞阻滞于G0/G1期。当姜黄素的浓度在40~160μmol/L范围内能浓度依赖性地抑制细胞表达PCNA(P<0.05)。结论姜黄素可显著抑制HUVEC增殖,使细胞周期停滞于G0/G1期,并诱导其凋亡,作用呈时间和剂量依赖性。提示姜黄素通过抑制新生血管治疗翼状胬肉具有潜在的应用前景。     

骨桥蛋白及其单克隆抗体1A12对人Tenon's囊成纤维细胞的调控作用

目的：探讨骨桥蛋白（OPN）对人Tenon's囊成纤维细胞（HTFs）的调控作用。方法：实验研究。采用不同浓度（0、0.05、0.5、5 μmol/L）的OPN对HTFs进行处理,采用MTT法检测HTFs的增殖速度,采用细胞划痕实验检测HTFs的移行速度。实时荧光定量PCR（Real-time PCR）检测不同浓度的OPN处理后HTFs的血管内皮生长因子（VEGF）和转化生长因子β（TGF-β）的mRNA水平变化。采用Western blot检测不同浓度的OPN处理后HTFs的I 型胶原蛋白的表达。采用单因素方差分析对数据进行比较。结果：不同浓度OPN处理组HTFs增殖能力和移行速度差异有统计学意义（F =174.5、297.1,P ＜0.01）。OPN处理组的HTFs增殖能力增强,移行速度加快,而且随着OPN的浓度增加而增加。给予OPN单克隆抗体1A12（5 μmol/L OPN+20 μg/ml 1A12）处理后HTFs增殖和移行速度变慢。不同浓度的OPN处理后HTFs中VEGF和TGF-β的mRNA含量变化差异无统计学意义。OPN处理后HTFs中I型胶原蛋白的蛋白表达增加,呈浓度依赖性（F =30.2,P ＜0.01）。结论：OPN能促进HTFs增殖和移行,呈浓度依赖性,该效应可被OPN抗体1A12抑制。上调OPN可以诱导HTFs中I型胶原蛋白的表达,其单克隆抗体1A12能抑制这种效应。     

HSV-tk/GCV系统对人Tenon囊成纤维细胞的旁观者效应及其机制研究

目的观察HSV—tk／GCV系统对人Tenon囊成纤维细胞（HTFs）的旁观者效应并研究其作用机制。方法将转HSV—tk基因HTFs（HTFs—tk）与正常HTFs于两种接种密度下以不同比例混合，加入5μg／ml更昔洛韦作用5d，MTT法检测对HTFs的杀伤作用；染料传输法观察HTFs细胞间隙连接细胞间通讯（GJIC）的能力；免疫细胞化学检测Cx43分布；RT—PCR及Westernblot检测Cx43表达。结果旁观者效应随HTFs—tk／HTFs比例增加而增强，高细胞接种密度组明显强于低密度组；染料通过GJIC传输6级以上；Cx43主要分布于HTFs细胞膜并检测到其mRNA与蛋白表达。结论旁观者效应需要细胞间密切接触，Cx43介导GJIC可能是HSV—TK／GCV系统对HTFs产生旁观者效应的主要机制，HTFs表达Cx43可能在结膜伤口愈合反应中发挥重要作用。     

金雀异黄素对培养的人RPE细胞诱导凋亡作用的研究

目的 研究金雀异黄素(genistein,Gen)对培养的人视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞的诱导凋亡作用,探讨其作用机制.方法 0、25、50、100、200μmol·L-1 Gen分别作用RPE细胞24 h;MTT检测细胞活性;流式细胞仪检测细胞周期,定量分析凋亡;免疫印迹技术检测细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated proteinkinases,ERK)、p38MAPK的表达及活性.结果 不同浓度的Gen作用RPE细胞24 h后,细胞生长明显受到抑制,抑制率分别为6.44%、14.71%、28.97%、45.75%;细胞凋亡率明显增高,分别为16.87%、19.44%、23.14%、34.81%;细胞周期表现为S期和G2/M期阻滞,并伴随G0/G1期细胞减少;p-ERK1/2表达下调,p-p38表达下调.ERK1/2的激活与Gen诱导的细胞凋亡呈负相关,p38的激活与凋亡可能也存在一定的关系.结论 Gen可以抑制人RPE细胞的增殖,并诱导其凋亡,存在量效关系,且主要是通过ERK通路发挥生物学效应.     

TNP-470对人脐静脉内皮细胞生长的抑制作用

目的：观察TNP-470对人脐静脉内皮细胞系ECV-304细胞生长的影响。 方法：采用MTT、细胞生长曲线、倒置显微镜形态学观察、荧光染色、流式细胞术等方法观察不同浓度TNP-470对ECV-304细胞形态、细胞增殖和细胞周期的影响。 结果：MTT结果显示：在低浓度（0．2μg／D时,TNP-470对ECV-304增殖无明显抑制作用,从2μg／L开始产生抑制作用,且该抑制作用具有量效关系,IC50值为305μg／L;生长曲线：20,200,2000μg／LTNP-470处理细胞后,细胞增殖被抑制,且具有剂量一时相依赖性;倒置相差显微镜下观察：各时间段对照组细胞生长状态正常,排列整齐呈铺路石样;从2μg/L开始出现细胞增殖抑制现象,随作用时间的延长和浓度增高抑制作用更为明显：2000μg／L组见少部分脱落、悬浮细胞;流式细胞仪分析经20,200,2000μg／L的TNP-470作用24,36h后,细胞被阻滞在G0／G1期,G2／M和S期的细胞数减少（P〈0．05）,细胞分裂受抑制,增殖指数降低。 结论：TNP-470能使ECV-304细胞周期阻滞在G0／G1期,对细胞增殖具有抑制作用。     

全反式维甲酸对Rb细胞的生长及Cx43蛋白分子表达的影响

目的研究全反式维甲酸（ATRA）对视网膜母细胞瘤（Rb）细胞的生长及细胞间隙连接蛋白（Cx）43分子表达的影响，探讨其作用机制。方法设立3种浓度（10^-3mol／L、10^-6mol／L和10^-7mol／L）ATRA分别作用于Rb细胞，采用四甲基偶氮唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）比色法检测细胞生长抑制率，流式细胞术检测细胞周期改变及凋亡率，免疫组织化学方法检测细胞Cx43蛋白的表达。结果经ATRA作用后，Rb细胞增生率下降，G0／G1期细胞比例增高而S期比例相对下降，细胞凋亡率升高，Cx43蛋白表达上调。上述效应均呈药物浓度及作用时间依赖性。结论ATRA通过将Rb细胞生长周期阻滞于G0／G1期并促进凋亡而抑制其生长，同时可诱导细胞Cx43分子表达上调。     

单纯疱疹病毒胸腺激酶基因系统抑制体外培养的人眼球筋膜囊成纤维细胞增殖的研究

目的研究单纯疱疹病毒胸腺激酶(HSV-tk)基因系统对人眼球筋膜囊成纤维细胞(HTFs)增殖的抑制作用及其作用机制。方法构建含HSV-tk基因的逆转录病毒载体pL(tk)SN并转入包装细胞系PT67进行病毒包装,G418筛选抗性克隆并扩大培养收集病毒上清,测定病毒滴度。透射电镜观察鉴定病毒颗粒;聚合酶链反应(PCR)技术鉴定tk基因在病毒基因组中的整合。用病毒感染HTFs细胞,G418筛选并扩大培养,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术和免疫印迹法检测tk基因的表达;加不同浓度前药更昔洛韦(GCV)后,以MTT法检测tk基因对HTFs细胞增殖的抑制作用;采用Hoechst33258染色及流式细胞仪检测凋亡细胞;电镜观察细胞形态学改变。结果酶切鉴定结果显示成功构建了逆转录病毒载体pL(tk)SN,电镜下包装细胞产生的病毒颗粒呈椭圆形,直径约100nm;病毒基因组中,PCR扩增出了tk基因;测得病毒滴度为4×107cfu/ml;被转染的HTFs细胞,用RT-PCR及免疫印迹法检测到tk基因在mRNA与蛋白水平均有表达;HSV-tk-GCV系统对HTFs细胞增殖的抑制作用表现为剂量依赖性,5×10-3g/L的GCV作用5d可将细胞全部杀死,IC50为6×10-4g/L,HSV-tk-GCV系统对HTFs细胞的杀伤机制表现为坏死与凋亡,凋亡率随GCV浓度的升高而增加。结论HSV-tk基因系统能有效抑制人眼球筋膜囊成纤维细胞的增殖,作用机制表现为细胞的坏死与凋亡。(中华眼科杂志,2006,42:212-217)     

褪黑素对体外培养的视网膜母细胞瘤HXO-RB44细胞增生活性的影响察

目的 探讨褪黑素（MLT）对视网膜母细胞瘤(RB)HXO-RB44细胞增生活性的影响及相关机制。方法 利用四氮唑化合物（MTT）比色法,观察不同浓度的MLT对RB HXO-RB44细胞增生活性的影响;利用10-10、10-9、10-8、10-7 mmol/L的MLT对RB HXO-RB44分别进行干预,采用Hoechst荧光染色观察细胞凋亡的形态学变化;利用流式细胞仪测定不同浓度的MLT干预24 h后,RB HXO-RB44细胞内活性氧（ROS）的表达、细胞周期与凋亡情况。结果 浓度为10-7 mmol/L以下的MLT对HXO-RB44细胞并无抑制作用（P值均＞0.05）。10-6 mmol/L以上的MLT能够显著抑制HXO-RB44细胞增生（P＜0.01）。浓度为10-6、10-5、10-4 mmol/L的MLT干预后,随药物浓度的升高,HXO-RB44细胞内ROS的表达逐渐升高。Hoechst染色显示：不同浓度的褪黑素分别作用于培养的HXO-RB44细胞4、8、12、24 h后,细胞核固缩、核碎裂增多,细胞凋亡的程度随着MLT浓度的增大而加重。流式细胞仪检测：药物干预后,G0/G1期细胞明显增多,S期细胞减少,G2/M期细胞相对增多,随着MLT浓度的升高,HXO-RB44细胞凋亡率明显升高。结论 浓度大于10-6 mmol/L的MLT能够有效地抑制HXO-RB44细胞增生,其抑制效率随药物浓度的升高和作用时间的延长而增强;MLT的抗细胞增殖作用可能与其诱导HXO-RB44细胞内的活性氧产生、阻滞细胞周期于G0/G1期并诱导细胞凋亡有关。     

曲古抑菌素A抑制TGF-β1诱导人Tenon囊成纤维细胞活化的作用

目的：探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylase inhibitor,HDACi)曲古抑菌素A(trichostatin A,TSA)对TGF-β₁诱导人Tenon囊成纤维细胞(human Tenon fibroblasts, HTFs)增殖及Ⅰ型胶原纤维合成的影响。

方法：首先,将不同浓度(200、400、600、800nmol/L)TSA作用HTFs共24h后,MTT法检测其对细胞活力的影响; 然后,不同浓度(400、600nmol/L)TSA与5ng/mL TGF-β₁混合作用于HTFs共24h,MTT法检测其对细胞活力的影响; 最后,RT-PCR和Western-blot法分别检测不同浓度(400、600nmol/L)TSA与5ng/mL TGF-β₁混合以及600nmol/L TSA对HTFsⅠ型胶原纤维的mRNA及蛋白表达的影响。

结果：MTT证实,与对照组相比,400nmol/L及以上浓度TSA作用组,HTFs活力显著下降(P<0.05); 两种浓度(400、600nmol/L)TSA均可减弱TGF-β₁促HTFs增殖的作用(P<0.05); RT-PCR和Western-blot证实两种浓度(400、600nmol/L)TSA对TGF-β₁诱导上调的Ⅰ型胶原纤维在基因转录及蛋白表达水平有逆转作用。

结论：TSA能够抑制TGF-β₁诱导的HTFs增殖,并减弱Ⅰ型胶原纤维基因转录及蛋白表达水平。