纳米载体介导的抗转录激活因子核酶对血管内皮细胞表面主要组织相容性复合物Ⅱ分子的抑制

移植血管病(GVD)仍是心脏移植成功与否的关键因素。尽管GVD的发病机制尚不十分清楚,但Labarrere等[1]证实内皮细胞表面主要组织相容性复合物(MHC)Ⅱ分子与GVD密切相关。MHCⅡ分子转录激活因子(CⅡTA)是MHCⅡ结构及诱导性表达最关键的总调节因子,只在MHCⅡ阳性细胞中出现[2 ,3 ] 。本文以抗CⅡTA的核酶抑制血管内皮细胞系表面MHCⅡ抗原的表达,为心脏移植排斥问题的解决开辟了一条新途径。一、方法和结果1.ECV30 4细胞株中MHCⅡ抗原的表达:用流式细胞仪检测内皮细胞系ECV30 4细胞株中MHCⅡ抗原的表达,其表面HLA DR、DP、…     

抗组织相容性复合物Ⅱ类分子转录激活因子核糖核酸酶P的切割活性

目的 研究抗组织相容性复合物(MHC)Ⅱ类分子转录激活因子(CⅡTA)核糖核酸酶P(RNaseP)抑制肝细胞表面MHC Ⅱ分子的表达。方法 M1—RNA是RNaseP的催化活性单位,设计并克隆针对C Ⅱ TA第629位点的M1-RNA(M1—629—GS)及其对应的C Ⅱ TA靶序列,分别插入腺相关病毒载体psNAV(psNAV—M1—629-GS)及pGEM—7zf(+)载体(pGEM—629),进行体外转录和切割反应鉴定其活性。通过纳米载体介导psNAV—M1—629—GS稳定转染人胎肝细胞,流式细胞术检测MHC Ⅱ类抗原表达,逆转录聚合酶链反应检测CⅡTA mRNA水平。结果 M1—629—GS与pGEM—800体外切割产物电泳见预期切割条带(553 nt和176 nt)。psNAV—M1—629—GS~+肝细胞表面人白细胞抗原(HLA)—DR、DP、DQ的诱导型表达分别为(1.01±0.51)％、(4.37±1.28)％、(1.98±0.42)％,对照组psNAV-M1—452-GS~+分别为(10.81±3.09)％、(40.12±2.60)％、(5.71±0.11)％,两组比较分别下调90.65％、89.11％及65.32％;psNAV—M1-629一GS~+克隆诱导型CⅡTA mRNA与β-actin比值为0.94±0.25,空载体组比值为2.30±0.49,M1—629—GS可明显下调C Ⅱ TA mRNA含量(t=5.56,P<0.01)。结论 抗C Ⅱ TA RNasep-M1—629—GS可发展为新一代抗肝移植排斥的核酸药物。     

血管内皮细胞主要组织相容性复合物-Ⅱ类分子转录激活因子小干扰RNA的抑制作用

目的:探讨主要组织相容性复合物(MHC)-Ⅱ类转录激活因子(CⅡTA)的小干扰RNA(siRNA),对血管内皮细胞表面MHC-Ⅱ类分子表达的抑制作用。方法:设计并合成针对CⅡTA编码区第176、741及3061位点的siRNA(分别为siRNA1、siRNA2、siRNA3)。通过纳米载体介导siRNA稳定转染脐静脉血管内皮细胞系,流式细胞术检测经典的MHC-Ⅱ(HLA-DR、-DP、-DQ)类抗原表达,RT-PCR检测CⅡTA及其调控的MHC-Ⅱ类及Ii分子的mRNA水平。结果:siRNA3组内皮细胞系表面HLA-DR、-DP、-DQ抗原表达分别降低了91.97%、96.65%及89.67%,同时CⅡTA、MHC-Ⅱ类及Ii分子的mRNA含量明显减少。结论:siRNA3抑制了CⅡTA的mRNA含量,并阻止其调控的MHC-Ⅱ类分子的表达。     

主要组织相容性复合物Ⅱ类转录激活因子在五种人类恶性血液病细胞系中的表达

目的 探讨5种血液病细胞株的主要组织相容性复合物(MHC)—Ⅱ类抗原表达及对干扰素(IFN)—γ诱导MHC分子表达的反应性与MHCⅡ类分子转录激活因子(CⅡTA)表达的关系。方法 采用Western blot、免疫组化和(或)流式细胞术检测肿瘤细胞CⅡTA蛋白及MHC分子表达,逆转录PCR检测肿瘤细胞CⅡTA基因表达。混合淋巴细胞反应检测肿瘤细胞刺激外周血T细胞反应的能力。结果 肿瘤细胞MHCⅡ类分子表达与CⅡTA表达一致;诱导型表达CⅡTA的Jurkat细胞,经IFN—γ作用后其MHCⅠ、Ⅱ类抗原表达增高(分别为20％、42％);IFN—γ诱导后仍不表达CⅡTA的肿瘤细胞,其对IFN—γ促MHCⅡ表达的作用不反应。Jurkat诱导后刺激T细胞表达高水平的白细胞介素-2 mRNA(是未诱导时的51倍)。结论 某些恶性血液病细胞株对IFN-γ不能诱导MHC分子表达与CⅡTA诱导性表达缺陷有关,表明CⅡTA参与调控肿瘤细胞MHCⅠ、Ⅱ类抗原表达,可能在肿瘤免疫逃逸中起重要作用。     

CⅡTA基因调控胰腺肿瘤细胞MHCⅡ类分子表达的体外研究

目的 研究CⅡTA基因对人胰腺癌CaPanC-2细胞和小鼠胰腺癌PanC-02细胞主要组织相容性复合物(MHC)Ⅱ类分子表达的影响.方法 将携带CⅢA基因的腺病毒(Ad-CⅡTA)分别感染人胰腺癌CaPanC-2细胞和小鼠胰腺癌PanC-02细胞,培养24、48、72 h.实时PCR法检测感染细胞CⅡTA mRNA的表达,蛋白质印迹法检测CⅡTA蛋白表达,流式细胞仪检测 MHCⅡ类分子阳性表达细胞百分比.结果 CaPanC-2细胞感染后24、48、72 h的CⅡTA mRNA表达量分别为对照组的(16769±6455)、(261568±348850)和(834816 ±97783)倍(P<0.05);PanC-02细胞为对照组的(548546±87755)、(1242684±624888)和(1401647±726145)倍(P<0.05).CaPanC-2和PanC-02细胞均不表达CⅡTA蛋白,感染后48 h,CaPanC-2、PanC-02细胞CⅢTA蛋白表达量为0.746±0.499和0.631±0.244.感染24、48、72 h组CaPanC-2细胞表达MHCⅡ类分子的细胞百分比分别为(8.1±0.3)%、(18.9±0.3)%、(78.5±0.9)%,显著高于对照组的(7.0±0.1)%(P<0.01);PanC-02细胞表达MHCⅡ类分子的细胞百分比分别为(5.1±0.2)%、(37.3 ±2.0)%、(68.8±2.2)%,显著高于对照组的(2.2±0.2)%(P<0.01).结论 Ad-CⅡTA体外感染胰腺肿瘤细胞可促进CⅡTA基因的表达,从而促进细胞表面MHC Ⅱ类分子的表达.     

CⅡTA与自身免疫性甲状腺疾病

主要组织相容性复合体(MHC)Ⅱ类分子反式激活因子(CⅡTA)是近年来发现的反式转录激活因子,对MHCⅡ类分子的表达起着严格且专一的调控作用,CⅡTA通过作用于多种MHCⅡ类转录激活因子、基础转录复合物及其他转录共激活因子,形成一个更加复杂的复合体来调控MHCⅡ类基因的表达。甲状腺细胞MHCⅡ类分子的异常表达与自身免疫性甲状腺疾病(AITD)密切相关。CⅡTA可诱导甲状腺细胞MHCⅡ类分子的异常表达。对CⅡTA基因结构和功能的研究将促进对MHCⅡ类分子表达调控机制及AITD发病机理的认识。     

CⅡTA与自身免疫性甲状腺疾病

主要组织相容性复合体（MHC）Ⅱ类分子反式激活因子（CⅡTA）是近年来发现的反式转录激活因子，对MHCⅡ类分子的表达起着严格且专一的调控作用。CⅡTA通过作用于多种MHCⅡ类转录激活因子，基础转录复合物及其他转录共激活因子，形成一个更加复杂的复合体来调控MHCⅡ类基因的表达，甲状腺细胞MHCⅡ类分子的异常表达与自身免疫性甲状腺疾病（AITD）密切相关。CⅡTA可诱导甲状腺细胞MHCⅡ类分子的异常表达，对CⅡTA基因结构和功能的研究将促进对MHCⅡ类分子表达调控机制及AITD发病机理的认识。     

HLA-DM基因多态性对系统性红斑狼疮自身抗体产生的影响

系统性红斑狼疮 (systemiclupuserythematosus,SLE)是一种与遗传、环境、内分泌和免疫系统紊乱等多种因素有关的自身免疫性疾病 ,但到目前为止其确切病因和发病机制仍不清楚[1 ] 。HLA DM基因是 2 0世纪 90年代初新发现的位于HLA D区的一种非典型HLA Ⅱ类基因 ,其编码的DM分子对HLA DR、DQ、DP等经典Ⅱ类分子的抗原肽的摄取和装配有决定性影响 ,故在涉及MHC Ⅱ类分子的抗原递呈途径中起关键作用[2 ,3 ] 。有研究者据此推测HLA DM多态性可能在HLA Ⅱ类分子相关疾病中扮演一定角色[3 ] 。我们用聚合酶链反应 限制性片段长度多…     

人CⅡTA基因不同单倍型cDNA真核表达载体的构建

目的 构建人MHCⅡ类反式激活因子（CⅡTA）基因3种不同单倍型cDNA的真核表达载体。方法 以野生型重组质粒EBS-NPL-CⅡTA cDNA为模板,用重叠延伸PCR定点突变技术对CⅡTA基因编码区的两个非同义单个核苷酸多态性（SNP）位点进行突变,制备CⅡTA基因另外3种单倍型CDNA的部分片段。将其分别克隆至EBS-NPL-CⅡTA酶切后的线性化载体上,通过菌落PCR及酶切鉴定获得阳性克隆,并对其进行测序鉴定。然后将4种单倍型的真核表达载体和空载体EBS-NPL分别转染至HepG2细胞,用间接细胞免疫荧光技术检测其HLA-DR分子的表达。结果 成功制备人CⅡTA基因3种单倍型CDNA的部分片段,并获得含有CⅡTA基因3种不同单倍型cDNA完整序列的真核表达载体。证实未经转染和转染空载体的HepG2细胞无HLA-DR分子的表达,转染4种真核表达载体的HepG2细胞均可表达HLA-DR分子。结论 成功构建人CⅡTA基因不同单倍型的真核表达载体,为研究CⅡTA基因不同单倍型功能之间的差异奠定基础。     

丙型肝炎病毒特异性锤头样核酶体外转录及切割活性的初步研究

目的　研究针对丙型肝炎病毒 (HCV)特异性锤头样核酶 (Rz)的体外转录及切割活性。方法　设计 3种锤头样核酶 :Rz1、Rz2 分别作用于HCVRNA 5′ 非编码区 (5′ NCR)上核酸序列 136～16 0、313～ 337,Rz3 作用于核心 (C)区上核酸序列 373～ 388。为区别于反义核酸的封闭作用 ,设计在Rz3 的催化环上存在点变异 (G取代A)的变异核酶Rzm用作对照。体外转录出靶HCVRNA和核酶RNA ,在一定条件下 ,将3 2 P标记的靶HCVRNA与核酶RNA按不同浓度比例进行切割反应 ,电泳后放射自显影 ,通过同位素扫描成像分析仪分析来评价核酶切割效率。结果　除Rzm外 ,在生理温度下 ,3种核酶均有活性 ,并随核酶浓度增加而提高 ;核酶切割靶位点距HCV起始密码子近切割效率高。结论　设计并观察到体外具有HCV特异性切割活性的锤头样核酶 ,为进行核酶的细胞内应用研究奠定基础     

HLA-DQB1-HLA-DRB1单倍型与中国南方汉族肺结核的相关性分析

目的　探讨HLA DQB1 HLA DRB1单倍型在中国南方汉族肺结核发病机制中的可能作用。方法 采用病例 对照的研究方法 ,应用PCR SSP技术对110例中国南方汉族肺结核患者和 10 1例中国南方汉族健康对照者的 2 0个HLA DRB1和 8个HLA DQB1等位基因进行分型 ,比较两组间DQ2,3(8) DRB1、DQ3(7) DRB1、DQ3(8,9) DRB1、DQ2 ,3(7,9) DRB1、DQ2 DRB1、DQ4 DRB1、DQ5DRB1和DQ6 DRB1单倍型频率 (HF)并计算其相对危险性 (RR)。结果 DQ2 ,3(8) DR14 .1、DQ3(7)DR16单倍型的频率肺结核病例组显著高于对照组 (6 .10vs .0 .5 0、4 .18vs .0 .99) ,其RR分别为 13.4 0和 4 .41;DQ2 DR1、DQ2 DR12、DQ2 DR13.3、DQ3(7) DR1、DQ3(7) DR13.3、DQ3(8,9) DR13.3、DQ2,3(7,9) DR1、DQ2 ,3(7,9) DR13.3、DQ2 ,3(7,9) DR13.4、DQ4 DR4单倍型的频率肺结核病例组显著低于对照组(分别为 1.84vs .5 .6 0、1.37vs .5 .6 0、4 .18vs .11.0 0、2 .30vs .9.89、12 .6 2vs .2 2.2 8、5 .6 1vs .11.5 6、3.70vs .14 .4 0、16 .88vs .2 8.94、5 .13vs .12 .12、2 .30vs.6 .13) ,其RR分别为 0 .31、0 .2 3、0 .34、0 .2 1、0 .4 7、0 .4 4、0 .4 6、0 .38和 0.35。结论 DQ2 ,3(8) DR14 .1、DQ2 DR12、DQ2 ,3(7,9 )-DR13.4、DQ4-DR4单倍型的存在可能与中国南方汉族肺结核的发病有着关联,而其他单倍型差异的显著性则可能是因其组成基因的基因频率差异所致。     

粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和α干扰素联合治疗慢性丙型肝炎

目的:干扰素促进细胞分化,增加细胞表面Ⅰ类组织相容性复合物(MHC)表达,激活自然杀伤细胞活性,阻断病毒侵入和直接抑制感染细胞内病毒复制。粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-GSF)则增强HLAⅡ类MHC表达和刺激单核细胞、巨噬细胞的细胞因子释放。研究的目的是观察单用GM-CSF     

抗丙型肝炎病毒锤头结构核酶的计算机设计和载体的构建

目的选择针对丙型肝炎病毒（HCV）5'非编码区（NCR）和核心区（C）的核酶（ribozyme,Rz）切割位点,构建带自剪切的Rz真核表达载体。方法应用计算机辅助设计,根据能量最低化原理,以HCV－H（1a）株SNCR和C靶序列,预测其二级结构,选择理想的Rz切割位点,设计锤头结构核酶;体外合成针对HCV5'NCR的Rz213和Rz260的cDNA,通过亚克隆技术连接于真核表达载体（pcDNA3）。结果在124个自然切割位点（CUX和GUX）中选出213（CUC）、260（GUA）、407（GUC）和498（CUU）4个切点;Rz213和Rz260的DNA序列分析,结果与合成序列完全一致,酶切鉴定两Rz连接正确。结论计算机可作为抗病毒Rz设计的重要辅助工具;通过亚克隆技术可使目的Rz两端带自剪切Rz,并成功地插入真核表达载体。     

支气管哮喘与HLA-DRB_1等位基因关联的研究(摘要)

人类第6号染色体上HLA区域的DP、DQ和DR位点在抗原呈递过程中起关键作用，因此影响免疫反应的特异性。已经证实，多种疾病，尤其是自身免疫疾病和过敏性疾病与HLA-Ⅱ类分子有关联。DR基因包括DRB1、DRB2、DRB3、DRB4、DRB5、DRB6、DRB7、DRA等。其中，DRB1座位有多达124个等位基因，多态性最为复杂。本研究旨在探讨HLA—DRB1等位基因与支气管哮喘的关系。材料与方法外源性哮喘患者46例，内源性哮喘患者52例，71例非过敏体质的本地区正常人作为正常对照。各取3～5ml外周血，EDTA抗凝，抽提基因组DNA；根据1992年发表的…     

MHCⅡ类转激活因子基因的重组腺病毒载体的构建

目的构建含有主要组织相容性复合物（major histocompatibility complex,MHC）Ⅱ类分子激活物（CⅡTA）基因的重组腺病毒载体。方法回收CⅡTA的PCR产物插入pUC57中,用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切,U—Gene凝胶回收纯化3300bp目的基因片段。用EcoRⅠ和SalⅠ双酶切质粒载体pShuttle—GFP—CMV,用T4DNA连接酶将上述目的基因片段与pShunle—GFP—CMV片段连接,得到穿梭质粒pShuttle—GFP—CMV—CⅡTA,并经KpnⅠ单酶切及测序鉴定。Ⅰ—CeuⅠ／Ⅰ—SceⅠ双酶切处理,回收目的片段,将pAdxsi载体片段和插入片段进行酶连接,得到腺病毒质粒pAdxsi—GFP—CⅡTA,经XhoⅠ酶切鉴定后转染HEK293细胞并培养出毒。扩增、纯化重组腺病毒AdCⅡTA,并测定病毒滴度。结果重组穿梭质粒pShuttle—GFP—CMV—CⅡTA经KpnⅠ单酶切及测序分析,证实与GeneBank中公布的小鼠CⅡTA（NM_007575）序列完全相符。重组腺病毒pAdxsi—GFP—CⅡTA构建成功后在HEK293细胞中包装产生的重组腺病毒AdCⅡTA对HEK293细胞有致病作用。经多次重复感染并纯化后,病毒滴度达2．0×10^11PFU／ml。结论含小鼠CⅡTA基因的重组腺病毒已成功构建。     

MHC Ⅱ类转激活因子基因的重组腺病毒载体的构建

目的 构建含有主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex,MHC)Ⅱ类分子激活物(CⅡTA)基因的重组腺病毒载体.方法 回收CⅡTA的PCR产物插人pUC57中,用EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切,U-Gene凝胶回收纯化3300bp目的基因片段.用EcoR Ⅰ和sal Ⅰ双酶切质粒载体pShuttle-GFP-CMV,用T4DNA连接酶将上述目的基因片段与pShuttle-GFP-CMV片段连接,得到穿梭质粒pShuttle-GFP-CMV-C Ⅱ TA,并经Kpn Ⅰ单酶切及测序鉴定.Ⅰ-Ceu Ⅰ/Ⅰ-See Ⅰ双酶切处理,回收目的片段,将pAdxsi载体片段和插入片段进行酶连接,得到腺病毒质粒pAdxsi-GFP-C Ⅱ TA,经Xho Ⅰ酶切鉴定后转染HEK293细胞并培养出毒.扩增、纯化重组腺病毒AdCⅡTA,并测定病毒滴度.结果 重组穿梭质粒pShuttle-GFP-CMV-C ⅡTA经Kpn Ⅰ单酶切及测序分析,证实与GeneBank中公布的小鼠CⅡTA(NM_007575)序列完全相符.重组腺病毒pAdxsi-GFP-C Ⅱ TA构建成功后在HEK293细胞中包装产生的重组腺病毒AdC Ⅱ TA对HEK293细胞有致病作用.经多次重复感染并纯化后,病毒滴度达2.0×10~(11)PFU/ml.结论 含小鼠CⅡTA基因的重组腺病毒已成功构建.     

主要组织相容性复合物区基因对人类长寿的影响

仅有少数人活到100岁以上。环境因素如生活方式,饮食和气候条件对寿命有明显的影响。由于长寿有家族性,故遗传因子可能有助于长寿。长寿小鼠与H,系统之间明确相关,提示主要的组织相容性复合物(MHC)是影响衰老的基因之一。人的HLA抗原,尤其HLA-D区与自身免疫性疾病、癌和其它恶性肿瘤以及免疫应答性疾病密切相关。从1979年以来,对居住在日本冲绳岛82例100岁以上与20例90～99岁老人,与同一地区正常人的HLA-A.B、C、DR和DQ抗原表现型的平均值进行比较性研究。作者在本报告中提出某些主要的遗     

内皮细胞主要组织相容性复合体Ⅱ类分子表达与自身免疫病

主要组织相容性复合体（MHC）Ⅱ类分子调节T细胞依赖性免疫应答,其表达异常会导致机体自身免疫状态。细胞因子诱导性MHCⅡ类分子上调可被抗氧化剂、环孢素和他汀类药物阻断。本文对内皮细胞MHCⅡ类分子表达与自身免疫病关系作一综述。     

腺病毒介导核酶对细胞内HBV基因表达的抑制作用

目的观察针对HBV(乙型肝炎病毒)C区双位点核酶在细胞内阻断C区基因表达的作用。方法采用亚克隆技术,从pGEM—Rz123(含针对HBV C区双位点核酶)上切下双位点核酶的片段,定向克隆于腺病毒表达载体pAd-CMV中。利用Lipofectamine2000介导,将重组病毒pAdCMV—Rz及pAdCMV—laz感染2.2.15细胞中,采用打点杂交技术观察核酶的表达,采用ELISA(酶联免疫)、免疫荧光、共聚焦定量、图象分析法、Western blot分析Hbe/HBcAg的表达。结果感染的2.2.15细胞2周后,打点杂交证实可表达针对HBV C区双位点核酶。ELISA方法检测发现核酶抑制HBeAg表达68.6％,用免疫荧光、免疫组化、图象分析法、Western blot分析证实核酶可抑制HBV细胞内表达。结论该双位点核酶通过针对HBV C区基因的剪切作用,阻断C区基因表达,抑制了HBe/HBcAg的表达。     

HLA-DQB1-HLA-DRB1单倍型与中国南方汉族肺结核的相关性分析

目的探讨HLA—DQB1．HLA．DRBl单倍型在中国南方汉族肺结核发病机制中的可能作用。方法采用病例．对照的研究方法，应用PCR．SSP技术对110例中国南方汉族肺结核患者和101例中国南方汉族健康对照者的20个HLA．DRBl和8个HLA．DQB1等位基因进行分型，比较两组间DQ2，3(8)-DRB1、DQ3(7)-DRB1、DQ3(8，9)．DRB1、DQ2，3(7，9)．DRB1、DQ2-DRB1、DQ4．DRB1、DQ5-DRB1和DQ6．DRB1单倍型频率(HF)并计算其相对危险性(RR)。结果DQ2，3(8)．DR14．1、DQ3(7)．DR16单倍型的频率肺结核病例组显著高于对照组(6．10vs．0．50、4．18vs．0．99)，其RR分别为13．40和4．41；DQ2-DR1、DQ2-DR12、DQ2．DR13．3、DQ3(7)．DR1、DQ3(7)．DR13．3、DQ3(8．9)-DR13．3、DQ2，3(7，9)-DR1、DQ2，3(7，9)-DR13．3、DQ2，3(7，9)．DR13．4、DQ4-DR4单倍型的频率肺结核病例组显著低于对照组(分别为1．84V8．5．60、1．37V8．5．60、4．18VS．11．00、2．30VS．9．89、12．62V8．22．28、5．61V8．11．56、3．70V8．14．40、16．88V8．28．94、5．13V8．12．12、2．30vs．6．13)，其RR分别为0．31、0．23、0．34、0．21、0．47、0．44、0．46、0．38和0．35。结论DQ2，3(8)．DR14．1、DQ2．DR12、DQ2，3(7，9)-DR13．4、DQ4-DR4单倍型的存在可能与中国南方汉族肺结核的发病有着关联，而其他单倍型差异的显著性则可能是因其组成基因的基因频率差异所致。