大鼠成体心肌细胞的分离和培养

目的: 探索稳定的大鼠成体心肌细胞的分离和培养方法. 方法: 应用主动脉逆行生物酶(5 g/L胰蛋白酶及1 g/L胶原酶)灌流法分离大鼠成体心肌细胞,免疫荧光染色法鉴定分离的心肌细胞,比较有无血清培养对心肌细胞的影响. 结果: 心肌细胞的存活率为95%以上;存活细胞呈杆状,形态完整,长宽比约为4～6∶ 1;无血清培养心肌细胞只能存活1 wk,形态不发生改变;而加血清培养心肌细胞可存活2 wk以上,但超微结构发生了改变,且不同血清浓度对成纤维细胞生长具有不同的作用. 结论: 主动脉逆行生物酶(胶原酶和蛋白酶)灌流法是比较理想的心肌细胞分离方法;血清对成体心肌细胞的培养起着重要作用.     

成年大鼠心肌细胞的分离和培养技术

目的建立稳定的成年大鼠心肌细胞分离和培养方法,以便进行成年大鼠心肌细胞收缩功能的研究。方法将成年大鼠心脏挂于Langendorff装置上灌流,胶原酶消化分离成年大鼠心肌,无血清悬浮培养心肌细胞。光镜观察,结合形态学和收缩功能评价心肌细胞。结果新分离的心肌细胞的收获量为(4~6)×106个,杆状和圆形,其中长杆状细胞大于75%,横纹清晰,收缩幅度(12.00±2.68)%。无血清培养24 h后,细胞保持完整的形态结构,长杆状心肌细胞占总数的70%以上,收缩幅度(11.78±1.59)%,与刚培养时的细胞相比,无显著差别(P>0.05)。结论通过本方法可以对成年大鼠心肌细胞进行良好的分离培养。     

改良Langendorff主动脉逆行灌流法分离不同大鼠心肌细胞的效率探讨

目的 比较分析Langendorff主动脉逆行灌流联合酶消化传统4步法和改良2步法急性分离普通远交群大鼠(SD)心肌细胞的优缺点。同时探讨改良2步法分离普通SD大鼠、自发性高血压大鼠(SHR)及wistar-京都大鼠(WKY)心肌细胞数量和质量的差异。方法 同时运用传统4步法和改良2步法急性分离SD大鼠心肌细胞，在倒置显微镜下观察心肌细胞形态及存活细胞比率。随后用改良2步法分离SD、WKY和SHR的心肌细胞，比较三种大鼠心肌细胞数量和质量差异，探讨改良2步法在不同大鼠心肌细胞急性分离的价值。结果 两种方法分离SD大鼠心肌所得杆状细胞横纹清晰、棱角分明，均为可供膜片钳实验顺利进行的存活细胞，改良2步法分离所得杆状细胞数、总细胞数较传统4步法显著增加，差异有统计学意义(P<0.05);改良2步法分离3组大鼠杆状细胞数、总细胞数差异有统计学意义(P<0.05),3组大鼠杆状细胞比率、覆钙后杆状细胞数和细胞总数均没有差异(P>0.05);3组大鼠心脏重量、消化时间比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论 心肌细胞急性分离的Langendorff主动脉逆行灌流联合酶消化...     

STZ糖尿病大鼠心肌细胞凋亡及葡萄糖、血管紧张素Ⅱ、瘦素对心肌细胞凋亡影响的观察

目的　观察链脲佐菌素(STZ)糖尿病大鼠心肌细胞凋亡情况及葡萄糖、血管紧张素Ⅱ、瘦素对正常SD大鼠心肌细胞凋亡的影响。方法　主动脉插管逆行灌流分离培养STZ糖尿病大鼠和正常SD大鼠心肌细胞,通过Annexin V FITC +PI双染法,采用流式细胞术,检测细胞凋亡情况,并运用细胞免疫荧光染色法检测心肌细胞膜瘦素受体的表达。结果　(1)STZ糖尿病大鼠心肌细胞凋亡较对照组明显增高(P <0 .0 1) ;(2 )在体外培养条件下,血管紧张素Ⅱ、瘦素使心肌细胞凋亡明显增加,且与浓度相关,差异均有显著性(P <0 .0 1) ,在葡萄糖5 .6、2 5mmol/L的培养环境中,心肌细胞凋亡变化不明显(P >0 .0 5 ) ;(3)细胞免疫荧光染色检测瘦素受体表达,在荧光显微镜下可见到心肌细胞膜呈现绿色荧光。结论　STZ糖尿病大鼠的心肌细胞凋亡增高;在体外培养条件下,血管紧张素Ⅱ、瘦素可促进SD大鼠心肌细胞凋亡,且与浓度相关,增加培养环境中的葡萄糖浓度,对SD大鼠心肌细胞的凋亡无明显影响,而瘦素可能通过与心肌细胞膜上瘦素受体结合而发挥作用。     

成年SD大鼠心肌细胞分离及其胞内钙离子动态变化测定

目的:建立稳定的成年SD大鼠心肌单细胞分离方法,并对心肌细胞内Ca2 动态变化进行测定。方法:用改进的Langendorff装置,行大鼠主动脉插管逆向灌流(温度、pH、水质恒定),用混合液(0.6 mg/mL胶原酶Ⅱ 0.06 mg/mL蛋白酶 1mg/mL牛血清白蛋白)消化心脏,经3次不同浓度含钙台式液复钙后得到钙稳态心肌细胞;室温静置1～2 h后于激光共聚焦显微镜下测定Ca2 的动态变化。结果:得到70%～90%长杆状活细胞,钙稳态心肌细胞可占40%～60%;fluo-4 AM负载染色后可记录到典型的诱发钙瞬变。结论:胶原酶和蛋白酶混合液主动脉逆向灌流方法可以得到具有正常生理功能的钙稳态心肌细胞,可用于心肌细胞内钙信号研究。     

急性分离大鼠心房肌细胞方法的改进及对钾、钠、钙电流的记录

目的:介绍1种改进的成年SD大鼠心房肌细胞分离方法.方法:SD大鼠麻醉后,快速取出心脏,将主动脉结扎在Langendorff灌流装置上,无钙台式液灌流5 min后换用酶液灌流10～12 min,剪取心耳组织于KB液中剪碎并吹打,200目细胞筛网过滤,将细胞滤液500 r离心2 min,梯度复钙后将细胞悬液置于4℃冰箱中...     

成年大鼠心肌细胞的分离与培养

目的研究成年大鼠心肌细胞的分离与培养方法。方法成年SD大鼠麻醉后,迅速开胸取心连接于Langendorff装置上进行逆行灌注,用0．06％-0．1％Ⅱ型胶原酶灌注消化分离心肌细胞,采用自然沉降法纯化心肌细胞,用改良M199培养基进行细胞培养。结果本方法可获得60％～85％具有活性的成年大鼠心室肌细胞,每只SD大鼠心脏的细胞产量可达1×10^7个。结论该方法简单、有效,同时具有一定的可控性。     

成年大鼠心肌细胞分离培养及兴奋-收缩耦联表征

目的比较两种细胞分离液分离成年大鼠心肌细胞,进一步表征成年大鼠心室肌细胞兴奋-收缩耦联。方法 Langendorff装置进行主动脉逆流灌流,分别用两种细胞分离液分离成年大鼠心肌细胞,无血清培养并进行腺病毒感染。显微镜下观察单个心肌细胞的形态学特点,荧光显微镜下检测病毒感染。采用IonOptix仪器检测心肌细胞肌节收缩-舒张指标以及心肌细胞钙离子摄入-排出指标。结果两种分离液均可获得70%横纹清晰的长杆状心肌细胞,培养可存活7 d以上。腺病毒感染48 h,绿色荧光蛋白持续表达7 d以上。分离液一获得的心肌细胞不能很好地随电场刺激产生收缩,分离液二获得的细胞可用于检测兴奋-收缩耦联特性,心肌细胞肌节缩短分数为11.61%±2.15%,舒张时间为(0.177±0.031)s,钙瞬变幅度为30.79%±9.74%,钙瞬变衰减时间为(0.300±0.074)s。结论两种分离液均可用于分离和培养成年大鼠心肌细胞,并用于腺病毒转染等长时程研究。分离液二更适用于检测成年大鼠心肌细胞的兴奋-收缩耦联特性。     

成年大鼠心室肌细胞的分离、培养与鉴定

目的探讨成年大鼠心肌细胞的分离、培养方法.方法麻醉后取成年Wistar大鼠心脏连接于Langendorff装置上进行0.1%胶原酶 0.1%透明质酸酶灌注肖化分离心肌细胞,纯化后培养于DMEM培养基.用免疫荧光染色方法鉴定心肌细胞,并在倒置显微镜、电镜下观察细胞的形态结构.结果本方法分离、培养的心肌细胞纯度为98%,细胞活性为92%,杆状细胞率为82%.结论该方法简单有效,为深入研究成年心肌细胞打下了基础.     

成年大鼠心室肌细胞的培养

目的：探讨成年大鼠心室肌细胞的分离培养方法,提高细胞存活时间。方法：采用LANGENDORFF灌流法,胶原酶P酶解分离心室肌细胞,并用M199培养基进行培养。显微镜下观察细胞形态结构,并予电刺激观察心室肌细胞的收缩情况。结果：心室肌细胞分离、存活率高,形态结构良好,存活可达7 d。电刺激下心室肌细胞出现同步收缩;若去除细胞外液中的钙离子,则不再收缩。表明心室肌细胞活性完好。结论：改进后的分离和培养方法,能使急性分离的成年大鼠心肌细胞的存活时间明显延长。     

成年大鼠心肌细胞培养方法的建立和形态学观察

为探索稳定的成年大鼠心肌细胞的分离和培养方法 ,应用生物酶 ( 5g/L胰蛋白酶及 1 g/L胶原酶 )灌注法分离成年大鼠心肌细胞 ,用形态学及台盼蓝染色法鉴定分离的心肌细胞 ,并在光镜和电镜下观察和摄像记录。结果 :心肌细胞的存活率为 91 .7% ;存活的心肌细胞静止地贴在培养板底上 ,细胞完整 ,呈杆状 ,长宽比约为 4～ 6∶1。结果提示 :该方法是比较理想的心肌细胞培养法。     

Ⅱ型胶原酶加压灌流提高成年大鼠心肌细胞分离效率

目的 探讨效率更高的成熟心肌细胞分离方法.方法 采用Ⅱ型胶原酶升主动脉逆行灌流法分离成年大鼠心肌细胞.对照组采用Langendorff装置灌流;实验组在Langendorff装置基础上加压匀速灌流.在倒置显微镜下观察细胞形态,并计算杆状细胞比率及产量;通过台盼蓝染色和局部场刺激评价心肌细胞活性.结果 分离即刻,实验组杆状细胞比率显著高于对照组[(90.3±4.4)%vs.(53.4±5.2)%,P<0.01];实验组活细胞产量也显著高于对照组[(3.6±0.7)x 10<''7>vs.(1.9±0.6)×10<''7>,P<0.01].复钙过程中,实验组发生自发性收缩的细胞比率及变圆细胞比率均明显低于对照组[(10.4±2.1)%vs(18.9±4.5)%,P<0.01;(5.3±1.3)%vs.(8.6±1.7)%,P<0.05].实验组台盼蓝染色阴性的杆状细胞比率和局部场刺激条件下收缩细胞比率明显高于对照组[(95.3±8.2)%vs.(90.6±9.8)%,P<0.05;(92.2±7.6)%vs.(85±6.4)%,P<0.01].结论 Ⅱ型胶原酶加压灌流可获得高产量、高活性的心肌细胞,提高了成熟心肌细胞的分离效率.     

大鼠乳鼠腹主动脉血管内皮细胞的培养与鉴定

目的：研究大鼠乳鼠腹主动脉血管内皮细胞的培养与鉴定方法。方法：取出生5~7d左右的大鼠乳鼠的腹主动脉血管,用组织块法在含20%胎牛血清及内皮细胞生长添加剂和肝素的DMEM培养基中培养,倒置相差显微镜观察内皮细胞形态和生长特征,免疫荧光方法进行血管内皮细胞Tie2相关抗原的鉴定。结果：来自于大鼠乳鼠腹主动脉的血管内皮细胞在改良的培养基中进行体外培养,能够保持增殖和传代的能力,且Tie2抗原鉴定呈阳性。结论：成功分离大鼠乳鼠腹主动脉组织并且获得体外原代培养大鼠乳鼠腹主动脉内皮细胞。用组织培养方法可以获得较满意的血管内皮细胞。     

心肌细胞对骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞的影响

目的：观察大鼠成体心肌细胞对骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）定向分化的诱导作用。方法：应用Percoll’s密度梯度离心法分离培养大鼠MSCs，传2代后用流式细胞术检测其表面CD34,CD71和CD90的表达，然后用Lipofectamine2000介导pEGFP-N3转染标记MSCs。将GFP标记的MSCs与新鲜分离的成体大鼠心肌细胞分别按接触、非接触（MILLICELLTM-HA半透膜分层培养）及心肌细胞条件培养液培养。1周后应用免疫荧光检测MSCs α-actin，desmin和cTnT的表达。结果：接触培养组中可见表达GFP的MSCs细胞同时表达α-actin,desmin和cTnT，而分层培养组及条件培养组中均未见α-actin，desmin和cTnT的表达。结论：大鼠成体心肌细胞与MSCs接触培养，可能诱导MSCs分化为心肌细胞。     

大鼠气道成纤维细胞的分离、培养及鉴定

目的:体外分离、培养、纯化大鼠气道成纤维细胞,并对其进行鉴定,为进一步气道成纤维细胞的相关研究提供物质基础。方法:处死SD大鼠,在无菌条件下切开胸腔,取出气道,刮去气管内膜上皮及气管外组织,将气道剪成小组织块行贴壁培养,用抗波形蛋白对其进行鉴定。结果:成功分离、培养出SD大鼠气道成纤维细胞,通过鉴定得出所培养的细胞为成纤维细胞。结论:成功分离、培养出大鼠气道成纤维细胞,为进一步深入研究气道成纤维细胞的功能奠定了基础。     

5-氮胞苷对大鼠脂肪间充质干细胞的诱导分化作用及相关蛋白的表达

目的 探讨5-氮胞苷(5-Aza)对大鼠脂肪间充质干细胞(ADMSCs)的诱导分化作用及相关蛋白的表达。 方法 采取酶消化法和贴壁法分离培养Sprague-Dawley(SD)大鼠腹部皮下脂肪组织，采用抗单核细胞人类白细胞抗原DR(HLA-DR)、兔抗CD13、CD44、CD105、血管性血友病因子(vWF)多克隆抗体对培养细胞进行鉴定，排除造血干细胞及成纤维细胞，取第3代ADMSCs细胞，以每孔1×104个细胞接种于24孔培养板中，并将其随机分为正常组和诱导组，正常组细胞于常规培养基中加入无菌生理盐水培养，诱导组细胞于常规培养基中加入浓度为10 μmol/L的5-Aza进行诱导培养。比较2组细胞的形态结构、心肌肌钙蛋白T(cTnT)、心肌肌钙蛋白I(cTnI)及缝隙连接蛋白43(Connexin43)基因表达量及cTnT、cTnI、Connexin43蛋白的表达情况。 结果 诱导组ADMSCs细胞增殖缓慢，体积增大并逐渐变为棒状或宽梭形，形态呈心肌细胞特征；RT-qPCR结果显示，诱导组细胞cTnT、cTnI及Connexin43基因表达量增强；免疫组化结果显示，诱导组细胞细胞质明显可见棕黄色或棕褐色颗粒物质，而正常组细胞细胞质中棕黄色或棕褐色颗粒物质较少，且诱导组细胞cTnT、cTnI及Connexin43蛋白阳性表达评分明显高于正常组(P<0.05)。 结论 大鼠脂肪组织中含有多向分化潜能的间充质干细胞(MSCs)，5-Aza可以诱导大鼠ADMSCs向心肌细胞分化，ADMSCs有望成为治疗心肌梗死的种子细胞。      

急性分离的成年大鼠心肌细胞在免疫荧光染色中的应用

目的介绍用急性分离的心肌细胞进行免疫荧光染色的方法。方法采用急性分离的成年大鼠心肌细胞和培养的乳鼠心肌细胞为标本,分别用免疫荧光染色直接法和间接法对细胞的肌动蛋白和肌钙蛋白进行染色。结果无论是用肌动蛋白或肌钙蛋白抗体,两种心肌细胞染色效果无明显差别。结论可以尝试用急性分离的成年大鼠心肌细胞为标本进行免疫荧光实验。     

Urocortin Ⅰ对缺氧/复氧损伤心肌细胞钙离子的影响

目的 观察UcnⅠ对成年大鼠缺氧/复氧损伤心肌细胞钙离子的影响.方法 通过Langendorff离体心脏灌注系统,用Ⅱ型胶原酶逆行灌注法分离成年大鼠心肌细胞,培养20 h后随机分为正常组(N组)、缺氧/复氧组(L/R组)、UrocortinⅠ组(UcnⅠ组)、5-羟葵酸+UrocortinⅠ组(5- HD+UcnⅠ组).各处理组心肌细胞加入Fluo - 3/AM荧光探针,用激光共聚焦显微镜检测细胞内钙的荧光强度.结果 I/R组心肌细胞内钙离子浓度较N组高(P＜0.05),UcnⅠ组较N组荧光强度明显增强(P＜0.01),而5- HD+UcnⅠ组心肌细胞内钙离子荧光强度与UcnⅠ组比较明显降低(P＜0.05).结论UcnⅠ可使成年大鼠缺氧/复氧损伤心肌细胞内钙离子浓度升高,5- HD则可阻断UcnⅠ的作用,提示UcnⅠ导致缺氧/复氧后心肌细胞钙离子浓度的升高可能跟ATP敏感性钾通道开放有关.