大鼠脂肪干细胞冷冻复苏后的生物学特性及成骨细胞分化潜能的研究

目的 研究冻存复苏后大鼠脂肪干细胞（ADSCs）的生物学特性及其体外诱导成骨细胞分化的潜能。方法 冷冻保存6 个月的大鼠ADSCs 复苏后传代培养,显微镜下观察细胞形态;CCK8 检测细胞增殖,流式细胞仪检测CD44,CD105。第3 代细胞诱导成骨培养2 ～ 3 周后碱性磷酸酶（ALP）和茜素红染色,观察成骨情况。结果 复苏后ADSCs 形态类似成纤维细胞,增殖迅速。成骨诱导培养后表现出成骨细胞特性,ALP 染色活性增加,茜素红染色出现矿化结节。结论 冷冻保存复苏后的ADSCs 细胞生物性能稳定,定向诱导后可分化为 成骨细胞,可作为骨组织工程的种子细胞。     

兔不同部位脂肪间充质干细胞成骨能力的差异

目的观察兔不同部位来源的脂肪间充质干细胞（ADSCs）分化成骨的能力。方法分别从一只新西兰兔的腹股沟、腹膜后、颈背部取出脂肪组织并提取脂肪间充质干细胞,体外培养传至第5代,加入诱导剂分别进行成骨诱导,不加入诱导剂的为对照组。观察通过钙钴染色、茜素红染色、碱性磷酸酶活性检测细胞成骨能力。结果经钙钴染色及茜素红染色后,诱导组大部分细胞呈阳性反应,以腹股沟部脂肪间充质干细胞的结节体积最大,对照组未见明显阳性细胞。细胞内碱性磷酸酶（ALP）活性检测表明诱导组比对照组ALP活性明显升高（P〈0.05）;腹股沟部脂肪间充质干细胞ALP活性较颈背部及腹膜后高,差异有统计学意义（P〈0.05）;颈背部与腹膜后相比较无明显差异（P〉0.05）。结论兔ADSCs经过体外诱导后,具有成骨能力;腹股沟部脂肪可作为骨组织工程种子细胞来源的较佳取材部位。     

大鼠脂肪基质干细胞的体外培养及其成骨细胞分化特性的研究

目的研究脂肪基质干细胞（ADSCs）分离培养的方法,探讨大鼠ADSCs在体外向成骨细胞分化的能力。方法从成年SD大鼠腹股沟处获取脂肪组织后进行体外培养,并通过骨诱导培养基使其分化成成骨细胞,通过碱性磷酸酶（ALP）v、on Kossa染色鉴定向成骨细胞分化能力。采取逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）技术检测成骨细胞的标志基因。结果大鼠脂肪组织能够分离培养出ADSCs;向成骨细胞诱导,ALP、von Kossa染色阳性,RT-PCR检测有ALP、osteocalcin及osteopontin表达。结论成功从大鼠脂肪组织分离培养出ADSCs,其生物学特性与骨髓基质干细胞（MSCs）相似,能够向成骨细胞分化,有希望成为组织工程理想的种子细胞来源。     

犬脂肪干细胞膜片的构建及其复合富血小板纤维蛋白后的成骨能力

目的 初步研究犬脂肪干细胞(adipose-derived stem cell,ADSCs)膜片的构建及其生物学特性对膜片复合富血小板纤维蛋白(platelet-rich fibrin,PRF)后成骨能力的影响.方法 取犬腹股沟处的脂肪进行消化,分离培养成脂肪干细胞进行相关检测.将P3代细胞加入含抗坏血酸的成膜培养液培养2周以上,构建脂肪干细胞膜片,采用HE染色及扫描电镜对膜片进行形态学检测.提取静脉血PRF,分为细胞膜片复合PRF的实验组和膜片对照组,2组分别成骨诱导后进行ALP染色和茜素红染色,并于诱导后第3、5天,采用RT-PCR检测成骨相关基因ALP、Runx2的表达.结果 体外分离培养脂肪干细胞,成功构建干细胞膜片.光镜下可见细胞极性排列紧密,细胞外基质分泌.扫描电镜可见膜片表面光滑,细胞紧密排列.HE染色可见蓝染细胞紧密相连,细胞外大量基质.成骨诱导后,ADSCs膜片复合PRF的实验组ALP表达及茜素红染色钙结节形成量明显优于ADSCs膜片对照组,实验组ALP、Runx2基因mRNA表达高于对照组.结论 成功构建犬脂肪干细胞膜片,膜片复合PRF后具有更强的成骨能力.     

成人骨髓基质干细胞体外培养及定向诱导分化为成骨细胞

目的：建立成人骨髓基质干细胞(MSCs)体外培养的方法,并探讨定向诱导分化为成骨细胞的途径．方法：抽取成人骨髓,Percoll密度梯度离心法进行体外培养,贴壁细胞传代,取第3代细胞在培养基中添加成骨诱导剂地塞米松、β-甘油磷酸、维生素C,培养15d后,在倒置显微镜观察细胞形态,钙-钴法染色检测碱性磷酸酶(ALP)表达,免疫组化(SABC法)检测Ⅰ型胶原、骨钙素表达,茜素红染色检测钙结节形成．结果：Percoll密度梯度离心法培养可获得均一的MSCs;诱导分化的MSCs呈典型的成骨细胞形态;ALP染色阳性率可达81％以上;Ⅰ型胶原、骨钙素表达阳性;茜素红染色见钙结节形成．结论：可以从成人骨髓中培养出MSCs,并可定向诱导分化为成骨细胞,可用作临床骨组织工程种子细胞。     

基因芯片筛选人牙周膜干细胞成骨分化生物学标记物的研究

目的：发现牙周膜干细胞（PDLSCs）骨向分化后显著高表达的环状RNA（circRNA）,探索circRNA在PDLSCs骨向分化中生物学标记物的作用。方法用酶消化法体外培养牙周膜细胞,通过免疫磁珠法分选出PDLSCs。用普通培养基和成骨诱导培养基分别培养PDLSCs 21 d,茜素红染色检测矿化结节的形成,RT－qPCR检测碱性磷酸酶（ALP）、骨钙素（OCN）和Runt相关转录因子2（Runx2）的表达。采用Arraystar公司的circRNA芯片检测PDLSCs骨向分化前后整体circRNAs的差异表达,将芯片中上调变化最显著的前10位circRNAs进行PCR引物设计,RT－qPCR检测circRNA的表达情况。结果 PDLSCs骨向诱导21 d后,茜素红染色阳性,有大量矿化结节形成,ALP、OCN和Runx2表达量明显升高。 Hsa＿circ＿0008433在PDLSCs骨向诱导21 d后显著高表达。结论Hsa＿circ＿0008433将来可能是PDLSCs骨向分化新的生物学标记物。     

人羊膜基质细胞作为骨组织工程种子细胞的应用

目的：初步探索人羊膜基质细胞（hAMC）作为骨组织工程种子细胞的潜力。 方法：分离培养hAMC,将第3代hAMC在含有地塞米松（0.1 μmol/L）、维生素C（50 mg/L）和β-磷酸甘油钠（10 mmol/L）的DMEM培养液中进行成骨诱导培养1周,行茜素红染色,计数钙化结节形成的数量,并进行免疫荧光细胞化学染色以检测Ⅰ型胶原和碱性磷酸酶的表达。利用免疫组织（细胞）化学染色检测羊膜及hAMC中FasL的表达。 结果：hAMC经过成骨诱导后,可见明显钙化结节形成,平均每孔18个,钙化结节处细胞Ⅰ型胶原和碱性磷酸酶表达阳性。人羊膜组织中细胞及体外培养的hAMC均可检测到FasL的阳性表达。 结论：hAMC有潜力成为一种比较理想的骨组织工程的种子细胞。     

低温冻存对兔脂肪间充质干细胞部分生物学特性的影响

目的 研究低温冻存对兔脂肪间充质干细胞部分生物学特性的影响。方法 采用组织块法分离培养兔脂肪间充质干细胞。用倒置显微镜观察原代细胞的细胞形态,流式细胞仪检测兔脂肪间充质干细胞的免疫表型。取第3代兔脂肪间充质干细胞置于-196℃液氮保存半年,37℃复苏并传至第7代。实验分为两组,实验组为冻存复苏后传至第7代的兔脂肪间充质干细胞,对照组为未冻存的第7代兔脂肪间充质干细胞,用MTT绘制其生长曲线;添加成脂、成骨诱导液进行诱导,油红O、茜素红染色和碱性磷酸酶活性检测分别进行鉴定。结果 体外培养的兔脂肪间充质干细胞呈梭形纤维样细胞形态,生长力旺盛。流式细胞仪检测显示,第3代兔脂肪间充质干细胞强表达CD44、CD90,阴性表达造血细胞相关的表面标志CD45。两组细胞生长曲线呈典型的“S”形,无统计学差异（P>0.05）;成脂诱导14 d后,油红O染色呈阳性;成骨诱导2周时茜素红染色阳性,ALP表达活性随成骨诱导时间延长不断增加且无统计学差异（P>0.05）。结论 冻存后的兔脂肪间充质干细胞体外生长及多向分化潜能未发生显著变化。     

胎盘来源间充质干细胞诱导分化为成骨细胞的实验研究

目的：掌握体外分离、培养扩增胎盘间充质干细胞的方法,探讨其成骨细胞定向诱导分化的能力。方法：用IV型胶原酶消化人胎盘组织,获得单个核细胞,接种于10%新生牛血清（FBS）低糖培养基中（DMEM）,贴壁后常规换液、传代,流式细胞仪检测其表面标志,用β 甘油磷酸钠,维生素C,地塞米松联合诱导,使胎盘贴壁细胞分化为成骨细胞,诱导后10?d检测碱性磷酸酶（ALP）活性,并行茜素红染色。结果：培养7～14?d后有少量贴壁细胞生长,逐渐呈成纤维细胞状,表达CD29、CD44和CD105,不表达CD34、CD45、CD19;在成骨诱导10?d后细胞ALP活性明显增强,茜素红染色可见钙盐沉积。结论：胎盘组织可能是新的间充质干细胞来源。     

小鼠、大鼠、食蟹猴与人的脂肪干细胞分离培养方法和生物学特性的比较分析

目的比较分析实验动物脂肪间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells,ADSCs)与人脂肪间充质干细胞的分离培养方法和生物学特性的差异,为自体脂肪干细胞移植治疗人类疾病的临床前研究提供临床前的实验数据和方法。方法将临床患者、食蟹猴、C57小鼠和SD大鼠的皮下脂肪组织进行分离培养后得到人脂肪间充质干细胞(h ADSCs)、食蟹猴脂肪间充质干细胞(cynomolgus monkey adipose-derived mesenchymal stem cells,c ADSCs)、小鼠脂肪间充质干细胞(mouse adipose-derived mesenchymal stem cells,m ADSCs)和大鼠脂肪间充质干细胞(rat adipose-derived mesenchymal stem cells,r ADSCs);采用流式细胞术鉴定ADSCs表面标记物;细胞成脂、成骨诱导分化,于诱导后21 d和28 d固定染色,鉴定ADSCs的成脂成骨分化能力。结果 h ADSCs、c ADSCs、m ADSCs和r ADSCs的分离培养方法类似,贴壁培养后均呈成纤维细胞样生长;流式检测显示,不同物种ADSCs间充质干细胞表面标记物CD90、CD29为阳性,少量表达造血干细胞标记物CD34,血管内皮细胞标记物CD31为阴性。成脂和成骨分化能力检测显示,h ADSCs、c ADSCs、m ADSCs和r ADSCs和均具有成脂成骨分化能力,但其成脂成骨分化的时间略有差异。结论实验动物ADSCs与h ADSCs采用相同的分离培养方法,有类似的表面标记物表达及成脂成骨分化潜能,生物学特性具有一致性,是自体脂肪干细胞移植临床前研究的良好模型。     

小鼠脂肪源性干细胞的成骨分化研究

目的 体外分离培养和鉴定小鼠脂肪源性干细胞,向成骨方向分化,为后续的实验选取合适的种子细胞奠定基础.方法 从白色脂肪组织中分离培养脂肪源性干细胞,应用流式细胞仪分析其表面的标记.分别通过碱性磷酸酶、茜素红和油红-O染色方法染色方法鉴定向成骨和成脂方向分化.结果 脂肪源性干细胞高表达表面标记CD29、CD44,并且能够向成骨和成脂方向分化.结论 利用胶原酶消化法,在小鼠脂肪组织中成功分离、培养出脂肪源性干细胞,获得的细胞具有多向分化潜能,为后期组织工程技术修复骨组织,提供了坚实的实验基础.     

利福平对兔脂肪干细胞增殖、成骨及黏附支架的影响

目的探讨利福平（rifampicin,RFP）对兔脂肪干细胞（rabbitadipose-derivedstemcells,rADSCs）增殖、成骨及黏附支架的影响,为后期RFP缓释系统与rADSCs的复合奠定实验基础。方法分离培养rADSCs,检测细胞周期及表面抗原CD44,成骨、成脂诱导后分别行茜素红及油红O染色。用利福平生长液干预rADSCs,按浓度分为0、10、20及30μg／ml4组,分别绘制细胞生长曲线、检测细胞凋亡率及碱性磷酸酶（alkalinephosphatase,ALP）含量。制备同种异体脱钙骨支架,并复合各组rADSCs,计算细胞黏附率,扫描电子显微镜观察复合情况。结果rADSCs呈长梭形生长,G0／G1期占78．3％±4．2％,表面抗原CD44阳性表达。成骨诱导后茜素红染色及成脂诱导后油红O染色均为阳性。生长曲线示30μg／ml组第4-11天增殖能力较其他3组弱（P〈0．01）,细胞凋亡示30μg／ml组凋亡率高于其他3组（P〈0．01）,ALP检测示成骨诱导后第14天30μg／ml组ALP含量较其他3组少（P〈0．01）,细胞黏附率示30μg／ml组较其他3组低（P〈0．01）。扫描电镜观察30μg／ml组黏附的细胞数量少,形态松散。结论不影响rADSCs增殖、成骨及黏附支架的RFP临界浓度约为20μg／ml。     

原代人脂肪基质细胞体内成骨能力的检测

目的:检测原代人脂肪基质细胞(human adipose-derived stromal sells,hASCs)的体内成骨能力,为应用其构建组织工程化骨奠定基础。方法:酶消化法分离原代hASCs,细胞经成骨向和成脂肪向诱导后,碱性磷酸酶(al-kaline phosphatase,ALP)染色和茜素红矿化染色检测其成骨向分化的能力,油红O染色检测其成脂肪向分化的能力。体内实验使用12只裸鼠,于其背部一侧皮下植入原代hASCs+支架材料作为实验组,同一裸鼠的另一侧植入单纯支架材料作为对照组。植入4周和8周后取材,制成组织切片,进行HE染色和免疫组织化学染色观察。结果:300 mL脂肪组织中可以获得约6×107个原代hASCs。体外实验证实原代hASCs具有成骨向和成脂肪向分化的潜能。HE染色可见,植入4周和8周后植入物中有类骨组织形成,免疫组织化学染色显示骨钙素、ALP和抗人核抗体呈阳性表达。结论:原代人脂肪基质细胞与支架材料构建的复合物可以在裸鼠体内成骨。     

碱性成纤维细胞生长因子和地塞米松联合诱导骨髓间充质干细胞的增殖和成骨分化

目的:研究碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和地塞米松联合对骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖和成骨分化的影响。方法:以第三代BMSCs为实验材料,分别给予10%FBS的DMEM培养基,含80μg/LbFGF的10%FBS的DMEM培养基,含bFGF80μg/L+地塞米松10-8mol/L+β-甘油磷酸钠10mmol/L+维生素C50mg/L的10%FBS的DMEM培养基处理,通过计数BMSCs细胞数评价其增殖能力,同时行碱性磷酸酶(ALP)活性检测及茜红素染色评价其成骨分化的能力。结果:与对照组相比较,bFGF可以显著提高骨髓间充质干细胞的增殖能力,bF-GF和地塞米松联合不仅促进了骨髓间质干细胞的增殖,而且促进碱性磷酸酶的表达和钙结节的形成。结论:bFGF和地塞米松联合促进了骨髓间充质干细胞的增殖和成骨分化。     

脂肪干细胞的分离提取、鉴定及与脂肪颗粒的混合移植研究

目的分离提取脂肪干细胞(ADSCs),对其进行成脂、成骨的鉴定,并与脂肪颗粒混合移植,观察移植后的脂肪组织的存活情况。方法取大鼠腹股沟脂肪,磷酸盐缓冲液清洗,0.1%Ⅰ型胶原酶37℃消化1 h,离心,取沉淀,用含10%血清的DMEM培养基进行培养、传代,取第3代ADSCs用于成脂、成骨鉴定;另取第3代ADSCs用于移植,分为两组:ADSCs(密度为5×107/mL)0.9 mL+脂肪颗粒0.6 mL组、脂肪颗粒1.5 mL组,分别移植于大鼠背部两侧,共移植24只大鼠,分别于2周、1、3个月时脱颈椎处死8只大鼠,再取出背部脂肪组织。结果大鼠ADSCs成脂、成骨诱导后,经油红O、茜素红染色呈阳性,移植2周、1个月时,两组取出的脂肪组织的体积变化不大;但移植3个月后,取背部脂肪组织,称重:脂肪颗粒1.5 mL组平均重量为(0.4551±0.0024)g,而ADSCs(密度为5×107/mL)0.9 mL+脂肪颗粒0.6 mL组的平均重量为(0.7798±0.0033)g,两组脂肪组织的重量差异有统计学意义(P<0.05)。结论原代分离、培养的ADSCs生长状况良好,具有向成脂、成骨分化的能力,与脂肪颗粒混合移植后组织的存活率高,并能够改善脂肪颗粒单独移植时的液化吸收情况。     

优化酶消化法分离培养及鉴定小鼠前体成骨细胞

目的优化小鼠前体成骨细胞体外分离培养方法,提高分离效率。方法用胶原酶A和分散酶消化出生72h以内的小鼠颅盖骨,分离获得的细胞通过光镜观察、碱性磷酸酶活性测定、Von Kossa染色和茜素红染色方法鉴定。结果获得的细胞活力高且具有典型的成骨特性。结论优化酶消化法是一种方便、高效分离小鼠前体成骨细胞的方法。     

TGF-β2和geneX对BrdU标记骨髓间充质干细胞增殖与成骨分化的作用

［摘要］ 目的　研究TGF-β2和geneX对BrdU标记的骨髓间充质干细胞增殖与成骨分化作用的影响．方法　采用全骨髓贴壁培养法分离骨髓间充质干细胞,传代并鉴定,设实验组和空白对照组,实验组分4组:A组:BrdU标记后的BMSCs组;B组:BrdU标记后的BMSCs+TGF-β2组;C组:BrdU标记后的BMSCs+geneX组;D组:BrdU标记后的BMSCs+geneX+TGF-β2组．空白对照组为BrdU标记后的单纯BMSCs加入基础培养基避光培养．诱导培养后观察骨髓间充质干细胞生长形态、检测生长动力学（methyl thiazolyl tetrazolium,MTT）、碱性磷酸酶（ALP）和钙定量、进行细胞Von-Kossa法染色,观察成骨分化作用．结果　（1）4组BMSCs吸光度值（OD）分析比较显示:细胞组间差异有统计学意义（P＜0.05）;（2）各组BMSCs成骨诱导后碱性磷酸酶（ALP）和钙定量检测结果显示:细胞组间差异有统计学意义（P＜0.05）;（3）进行细胞Von-Kossa法染色,D组可见大量钙结节;C组可见较多钙结节;B组可见部分钙结节;A组可见少量钙结节;空白对照组未见钙结节．结论　（1）TGF-β2可促进骨髓间充质干细胞的增殖和诱导其向成骨细胞分化;（2）geneX可促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化,且在细胞因子TGF-β2联合作用下成骨分化作用更明显．