B7基因转染对小鼠肝癌细胞致瘤性的影响

目的：研究小鼠Ｂ７基因转染对小鼠肝癌细胞Ｈｅｐａｌ６细胞株细胞形态、生长速度及致瘤性的影响。方法：用逆转录病毒载体，将小鼠Ｂ７基因导入小鼠肝癌细胞Ｈｅｐａｌ６细胞株中，经Ｇ４１８筛选，获得高表达Ｂ７分子的阳性细胞克隆，采用ＣＴＬＡ４Ｉｇ的间接免疫荧光法检测Ｂ７分子的表达情况，并观察了Ｂ７基因转染对细胞形态、生长速度及致瘤性的影响。结果：①亲本小鼠肝癌细胞株Ｈｅｐａｌ６不表达Ｂ７分子，转染Ｂ７基因的Ｈｅｐａｌ６细胞高表达Ｂ７分子；②转染Ｂ７基因的Ｈｅｐａｌ６细胞与亲本Ｈｅｐａｌ６细胞相比，体外生长速度和细胞形态无明显改变，但免疫原性大大增强，致瘤性消失。结论：Ｂ７基因转染使得小鼠肝癌细胞株Ｈｅｐａｌ６免疫原性大大增强，致瘤性消失     

B7修饰的肿瘤细胞疫苗体内外抗肿瘤作用

目的：研究小鼠Ｂ７修饰的肿瘤细胞疫苗的体内外抗肿瘤作用，方法：应用逆转录病毒载体，将小鼠Ｂ７－１和Ｂ７－２导入小鼠肝癌细胞Ｈｅｐａｌ－６细胞株中，Ｇ４１８筛选后获高表达Ｂ７分子的阳性细胞克隆，经丝裂霉素处理制备成肿瘤细胞疫苗（ＴＣＶ），观察ＴＣＶＢ７体外刺激的脾细胞对不同肿瘤细胞系的抗瘤活性及对不同动物模型的体内免疫保护作用和免疫治疗作用。结果：（１）ＴＣＶＢ７体外刺激的脾细胞对亲本肝癌细胞和小鼠     

转B7—1基因的人多发性骨髓细胞XG—7在激发杀肿瘤细胞CTL？…

为调查Ｂ７－１分子在人多发性骨髓瘤细胞的表达是否可诱导出具有抗肿瘤作用的ＣＤ＾＋８的ＣＴＬ，我们用含Ｂ７－１基因逆转录病毒载体ＰＴＧ５１９２的包装细胞２９３Ｅ培养上清，感染人多发性骨髓瘤细胞系ＸＧ－７（不表达Ｂ７－１分子）用新霉素Ｇ４１８选择并经流式细胞仪筛选，获得了稳定高表达式Ｂ７－１分子的ＸＧ－７细胞（命名为ＸＧ－７－Ｂ７细胞）在体外增殖实验中，ＸＧ－７－Ｂ７细胞显示出比母系细胞ＸＧ－７对外周     

B7修饰的肿瘤细胞疫苗体内外抗肿瘤作用

目的：研究小鼠Ｂ７修饰的肿瘤细胞疫苗的体内外抗肿瘤作用。方法：应用逆转录病毒载体，将小鼠Ｂ７１和Ｂ７２导入小鼠肝癌细胞Ｈｅｐａｌ６细胞株中，Ｇ４１８筛选后获高表达Ｂ７分子的阳性细胞克隆，经丝裂霉素处理制备成肿瘤细胞疫苗（ＴＣＶ），观察ＴＣＶＢ７体外刺激的脾细胞对不同肿瘤细胞系的抗瘤活性及对不同动物模型的体内免疫保护作用和免疫治疗作用。结果：①ＴＣＶＢ７体外刺激的脾细胞对亲本肝癌细胞和小鼠ＮＫ敏感的Ｙａｃ１细胞的体外细胞毒作用明显增强；②在免疫模型中，经ＴＣＶＢ７免疫的小鼠，能对同系肝癌细胞产生完全的免疫保护作用，并能保持无瘤状态长期存活；③在早期模型中，经ＴＣＶＢ７治疗的小鼠，能部分产生对同系肝癌细胞的免疫治疗作用，肿瘤的生长速度减缓，荷瘤小鼠的生存期延长。肿瘤组织（尤其是肿块包膜下）中淋巴细胞浸润增加；④在晚期模型中，经ＴＣＶＢ７治疗的小鼠，未能产生对同系肝癌细胞的免疫治疗作用。结论：Ｂ７修饰的肿瘤细胞疫苗能明显刺激增强体内外抗肿瘤作用。     

人B7—1,IFN—γ双顺反子逆转录病毒载体的构建和表达

目的：制备免疫基因修饰的卵巢癌肿瘤疫苗。方法：利用口蹄疫病毒的内在性核糖体插入位点（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅｓ,ＩＲＥＳ）,通过基因克隆技术构建人Ｂ７－１、ＩＦＮ－γ双顺反子逆转录病毒载体ＰＬＸＳＮ／Ｂ７－１ ＩＦＮ－γ。结果：将ＰＬＸＳＮ／Ｂ７－１ ＩＦＮ－γ转染逆转录病毒包装细胞,包装成病毒,经滴度测定后,转导卵巢上皮癌细胞系３Ａ０,筛选稳定表达克隆,ＲＴ－ＰＣＲ和免疫流式细胞测定均可证实Ｂ７－１、ＩＦＮ－γ在同一转导细胞的共表达。结论：口蹄疫病的ＩＲＥＳ可提供Ｂ７－１、ＩＦＮ－γ的共表达。     

B细胞活化因子B7—1cDNA的克隆及其在白血病细胞的表达

利用ＲＴ－ＰＣＲ方法从ＥＢＶ转化Ｂ淋巴细胞中扩增出Ｂ７－１ｃＤＮＡ、酶切Ｂ７－１基因和逆转录病毒载体ＰＬＸＳＮ，连结、克隆ＰＬＢ７－１ＳＮ到大肠杆菌Ｍｃ１０６１。扩增纯化质粒ＰＬＢ７－１ＳＮ。用ＰＡ３１７细胞包装病毒，ＮＩＨ３Ｔ３细胞筛查病毒滴度，获得高效价的Ｂ７－１病毒上清，病毒感染人白血病细胞株Ｋ５６２和ＨＬ６０，获得稳定表达Ｂ７－１分子的肿瘤细胞。     

IL—6和B7双基因转染的小鼠EL—4肿瘤细胞诱导抗肿瘤免疫作用

目的：探讨ＩＬ－６和Ｂ７双基因转染的小鼠疫苗是否具有协同的抗肿瘤效应。方法：利用含小鼠Ｂ７分子和人ＩＬ－６分子ｃＤＮＡ的逆转录病毒载体ｐＬｍＢ７ＳＮ和ｐＬｈＩＬ－６ＳＮ分别转染包装细胞株ＣＲＩＰ,经Ｇ１８抗 筛选后以吸Ｂ７或ＩＬ－６外源基因的病毒颗粒感染小鼠ＥＬ－４胸腺癌细胞,观察ＥＬ－４－ＩＬ－６、ＥＬ－４－Ｂ７、ＥＬ－４－ＩＬ６＋Ｂ７细胞在同基因宿主体内的致瘤性及作为抗肿瘤疫苗的能力。结果：相     

B7—1基因转当小鼠EL—4淋巴瘤细胞体外诱导免疫小鼠脾细胞产生的白细胞介素

目的 研究Ｂ７－１基因转染小鼠ＥＬ－４淋巴瘤体外诱导免疫小鼠脾细胞产生的白细胞介素－２。方法 以ＣＴＩＬ－２细胞检测ＥＬ－４Ｂ７－１＾＋免疫小鼠的脾细胞与癌细胞共育的ＭＬＴＣ培养上清中的ＩＬ－２活性。结果 ＥＬ－４Ｂ７－１＾＋免疫小鼠的ＳＰＬ经瘤细胞在体外刺激可诱生出明显的ＩＬ－２活性,而ＥＬ－４免疫小鼠的ＳＰＬ则无此作用,两者具有较明显的差异（Ｐ〈０．０１）。结论 Ｂ７－１基因转染小鼠ＥＬ－４淋巴瘤可在体外诱导免疫小鼠脾细胞产生较高水平的白细胞介素－２。     

B7联合HSV-TK基因对大鼠乳腺癌的治疗作用

目的：探讨逆转录病毒介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶基因（ＨＳＶ－ＴＫ）和共同刺激因子Ｂ７基因联合作用对乳腺癌动物模型的体内治疗作用。方法：应用重组技术,构建分别携带ＨＳＶ－ＴＫ,Ｂ７及ＨＳＶ－ＴＫ／Ｂ７双基因的逆转录现毒载体。以ＳＨＺ－８８细胞细胞株建立乳腺癌动物模型,随机分为组、ＴＫ组、Ｂ７组及ＴＫ／Ｂ７组,每组２０只。２周后于瘤体内分别注射转染有空载及不同的重组载体的乳腺癌细胞,３天后于腹腔内连续     

重组人骨形态发生蛋白-2/7融合基因的构建及其在大肠杆菌中的表达和初步活性测定

构建重组人骨形态发生蛋白－２／７融合体, 研究其在大肠杆菌中的表达及生物学活性。利用ＤＮＡ 重组技术,将编码人骨形态发生蛋白－２ （ＢＭＰ－２） 成熟肽的０．３６ ｋｂ 基因片段与编码人骨形态发生蛋白－７ （ＢＭＰ－７） 成熟肽的０．４４ｋｂ 基因片段连接,得到重组人骨形态发生蛋白－２／７ 融合基因; 经测序鉴定后,将其克隆到表达载体ｐＢＶ２２２中,转化大肠杆菌ＤＨ５α, 温度诱导表达。表达蛋白经初步纯化后测定其对培养小鼠成骨样细胞增殖、分化及碱性磷酸酶活性的影响。克隆质粒转化的工程菌,经４２℃诱导４～６ ｈ 后,高效表达重组人骨形态发生蛋白－２／７, 在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上出现一新的蛋白带, 分子量约２９ ｋｕ,约占菌体总蛋白的２０％ ,表达蛋白以包涵体的形式存在,经初步纯化、裂解、复性后的ＢＭＰ－２／７ 蛋白具有促进成骨样细胞分化、增殖及增加碱性磷酸酶活性的作用。ＢＭＰ－２／７ 融合基因的构建和表达,可能提供一种全新的具有诱导成骨作用的蛋白     

小鼠B7-1和B7-2基因转染EL4细胞瘤苗抗肿瘤免疫作用的比较研究

目的：研究冠状动脉分流（CABG）术后冠状动脉竞争血流对左乳房内动脉（LIMA）桥血流中内皮素（ET）、一氧化氮（NO）含量的影响，探讨动脉桥血管早期衰坏的分子机制。方法：建立猪CABG术后桥血管竞争血流动物模型，利用血流闭塞器造成冠状动脉不同程度狭窄，测量桥血管血流量及方向变化，并采用放射免疫分析法及硝酸还原酶法分别检测LIMA桥血流中ET、NO含量并进行对比分析。结果：冠状动脉左前降支（LAD）近端狭窄程度越轻，LIMA桥血流量越少；LAD近端未完全闭塞时，LIMA桥均出现双向血流。CABG术后LIMA桥血流ET含量明显高于移植前(P＜0.05)，NO含量明显低于移植前(P＜0.05)。LAD近端冠脉竞争血流越大，LIMA桥血流NO含量越低。LIMA桥血流NO含量与LIMA桥血流量呈正相关（r=0.957,P＜0.05）。LAD近端30％狭窄时，NO含量明显低于LAD近端90％狭窄及全部闭塞时(P＜0.05)，LAD近端50％狭窄时，NO含量明显低于LAD近端全部闭塞时(P＜0.05)。LIMA桥血流ET含量有随LAD近端冠脉竞争血流增加而升高的趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05）。结论：来自未完全闭塞冠状动脉的竞争血流可引起LIMA桥血流量下降，产生双向血流，并导致桥血流中NO含量显著下降。     

共刺激分子配体B7-DC转基因小鼠模型的建立

目的建立共刺激分子配体B7-DC转基因小鼠模型。方法利用RT-PCR方法从来自小鼠胸腺的mRNA中扩增出B7-DC cDNA,继而将B7-DC基因插入到真核表达载体PEF6/V5-His中得到含B7-DC和V5-His融合蛋白的PEF6-B7-DC/V5-His。注射外源基因PEF6-B7-DC/V5-His至FVB小鼠原核,注射胚胎移植到同期发情的假孕受体,所生仔鼠经PCR和Southem-blot检测获得阳性转基因小鼠。结果共注射移植胚胎87枚,出生小鼠39只,检测出阳性小鼠3只,并稳定遗传至F2代。结论成功建立了B7-DC转基因小鼠模型。     

B7特异性siRNA对树突状细胞功能的影响

目的探讨体外合成的B7特异性小干扰RNA（siRNA）对树突状细胞（DC）功能的影响。方法设计并合成B7特异性siRNA,在脂质体的介导下转染树突状细胞,转染后72h收集细胞,用蛋白印迹法检测B7-1、B7-2蛋白的表达,用ELISPOT检测DC与淋巴细胞共培养后T细胞分泌IFN-γ,用MTT法检测混合淋巴细胞增殖反应和CTL特异性杀伤率。结果Western Blot结果显示转染72h后,siRNA1对B7-1蛋白表达的抑制率为（80．9±5．23）％;siRNA2对B7-2蛋白表达的抑制率为（74．7±4．63）％。经转染B7-1、B7-2分子特异性siRNA的DC激活后,T淋巴细胞分泌IFN-γ分别为（84．6±23．1）10^3／L和（76．7±19．7）10．3U／L明显低于对照组（204．5±46．2）10^3U／L;各组DC刺激淋巴细胞增殖指数（PI）分别为1．73±0．32和1．53士0．25,也低于对照组4．23±0．74。CTL杀伤实验结果表明：对照组的特异性杀伤率为（76．4±7．6）％,siRNA1和siRNA2组的特异性杀伤率分别为（14．4±3。6）％和（18．6士4．7）％,低于对照组。结论B7特异性siRNA可明显抑制树突细胞B7基因的表达,并可降低DC激活T淋巴细胞增殖和CTL的细胞毒性,为进一步研究siRNA诱导免疫耐受和治疗自身免疫性疾病提供了新思路和方法。     

X射线对小鼠腹腔巨噬细胞表达B7-1和B7-2的影响

目的 :观察 X射线全身照射对小鼠腹腔巨噬细胞表达 B7- 1和 B7- 2的影响。方法 :采用免疫组织化学法 ( ABC法 )。结果 :小鼠腹腔巨噬细胞表达 B7- 2达到高峰的时间早于 B7- 1,而且 B7- 2表达幅度也高于 B7- 1。剂量 -效应关系的研究表明 ,B7- 1和 B7- 2的表达均在 0 .0 75Gy剂量点出现峰值 ,而在较大剂量照射时也出现一个峰值。但在不同分度分析结果中发现 ,低剂量 X射线照射组的高密度细胞百分数比较大剂量组多。结论 :B7分子的表达上调可能是参与低剂量电离辐射免疫增强效应的重要因素。     

人结直肠癌组织中B7和ICOS分子mRNA的表达

目的:通过原位检测B7-1,B7H1,B7H2和ICOS等分子mRNA在结直肠癌细胞及肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)中的表达,以期探讨肿瘤微环境中Th2型细胞因子表达上调的可能机制.方法:采用原位杂交技术,用地高辛标记的寡核苷酸探针检测了22例人结直肠癌组织B7-1,B7H1,B7H2和ICOS分子mRNA表达状况,并结合临床特点加以综合分析.结果:肿瘤组织和肿瘤浸润淋巴细胞除表达B7-1外,均可见B7H1,B7H2 和ICOS mRNA表达,但肿瘤细胞的表达水平显著高于TIL的表达水平,具有显著性差异(P<0.05);B7家族分子在癌细胞和TIL中的表达均与患者性别、年龄、肿瘤分化程度、有无区域淋巴结转移无关,在TIL中B7H1表达与肿瘤浸润深度有关(P<0.05);在癌细胞中则与之无关(P=0.155);在癌细胞和TIL中B7H1和ICOS分子表达与远处转移之间具有显著性差异(P均<0.01).结论:肿瘤细胞和TIL表达B7H1,B7H2和ICOS分子可能与肿瘤微环境中Th2型细胞因子占优势有关.     

B7-H1在慢性乙型肝炎肝组织中的表达及临床意义

目的 研究共刺激分子B7-H1在慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)肝组织中的表达及临床意义.方法 采用免疫组织化学和半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测30例CHB肝组织中B7-H1蛋白和mRNA的表达.结果 30例CHB肝组织中18例(60%)肝组织中B7-H1表达阳性,11例正常人肝组织无表达.B7-H1分子的表达与肝组织炎症活动程度及纤维化进程密切相关.RT-PCR结果与其一致.结论 B7-H1在慢性乙型肝炎感染者中明显增高,并与肝组织炎症活动程度相关,提示B7-H1在慢性乙型肝炎中担负着重要的免疫调节作用,可成为判断乙肝活动强弱的一个指标.     

8B7血影蛋白-血影蛋白家族的一个新成员

目的分析8B7cDNA编码的蛋白质的性质及其在细胞中的定位。方法用Blastn、Blastp及TMpred分析8B7cDNA编码的蛋白质的性质。采用Northern印迹分析8B7mRNA在细胞和组织中的表达。构建重组定位表达载体,转染COS-7细胞,激光扫描共聚焦显微镜观察细胞中EGFP-8B7融合蛋白的表达。结果8B7cDNA编码的蛋白质长363个氨基酸,分子中有血影蛋白重复序列,它与Enaptin蛋白、Nasprin-1蛋白、Myne1蛋白及Syne-1蛋白的C末端363个氨基酸序列100%同源,是血影蛋白家族的一个新成员,故称8B7血影蛋白。Northern印迹分析,可见人脾脏和小肠组织有1.8kb的8B7mRNA表达。定位实验见COS-7细胞的核膜有荧光,胞浆中也见网状的荧光。转染pEGFP-△SR8B7的COS-7细胞中发射荧光的部位与转染pEGFP-8B7cDNA的细胞相似。结论8B7cDNA编码的蛋白质是血影蛋白家族的一个新成员,用COS-7细胞所做的定位实验证实其定位于细胞的核膜和胞浆中的网状结构,是8B7血影蛋白C端的KASH结构域决定了其在COS-7细胞中的定位。     

B7-H4与肾癌的研究进展

肾癌又称肾细胞癌,起源于肾小管上皮细胞,占成人癌的3%,是泌尿系统发病率仅次于膀胱癌的第二常见的恶性肿瘤.早期肾癌无明显症状,需依靠影像学检查来与肾良性病变相鉴别.B7-H4是新近发现的B7-CD28家族成员,在T细胞免疫应答中起到负调节作用,研究表明其与肾癌的发生、发展及预后均有着联系,通过对B7-H4的研究将有助于对肾癌的早期诊断及免疫治疗提供新的方法.文中就国内外关于B7-H4与肾癌的有关研究进展进行综述.     

双表达B7-1、B7-2基因肿瘤疫苗治疗小鼠肝癌优于单表达疫苗的研究

目的:研究B7-1、B7-2基因对肿瘤的免疫治疗作用。方法:应用转染有B7-1、B7-2基因的肝癌细胞株H22/B7-1、H22/B7-2,建立小鼠肝癌模型,观察小鼠成瘤期、荷瘤小鼠存活期及肿瘤结节大小。结果:各实验组动物都发生肿瘤,接种H22/B7-1 H22/B7-2组成瘤率低,对照组动物肿瘤呈进行性生长;组间成瘤潜伏期不同,与对照组相比,凡接种有H22/B7-2的小鼠肿瘤形成有迟发性;接种转B7基因细胞的小鼠肿瘤生长都较对照组慢;同时接种H22/B7-1和H22/B7-的小鼠能负载大于107的肿瘤细胞。转基因细胞在体外刺激淋巴细胞增殖和诱导CTLs的能力明显增强。结论:B7-1、B7-2都能增强肝癌细胞的免疫原性。B7-2在抗肿瘤早期发挥作用,B7-1随后起放大和调节作用。B7-1与B7-2联用效果优于单一应用。     

RNA干扰抑制树突状细胞CD80和CD86基因表达研究

目的探讨体外合成的小干扰RNA（siRNA）对人树突状细胞（DC）共刺激分子CD80和CD86基因表达的影响。方法设计并合成了3条siRNA（siRNA1、siRNA2和siRNAc）,在脂质体的介导下转染树突状细胞,于转染后24、48、72h收集细胞,用半定量RT-PCR检测CD80和CD86 mRNA的变化,用蛋白印迹检测CD80、CD86蛋白的表达。结果转染24、48、72h后,DC CD80 mRNA均有明显减少（P〈0.01）,抑制率分别为（50.0±3.63）%、（66.8±4.12）%和（76.6±4.87）%;CD86 mRNA均有显著降低（P〈0.01）,抑制率分别为（53.0±3.70）%（、60.5±3.92）%和（73.4±4.46）%,而单纯脂质转染和siRNAc转染对CD80、CD86 mRNA表达均无影响（P〉0.05）。Western Blot结果显示转染48、72h后,siRNA1对CD80蛋白表达的抑制率为（67.3±4.80）%和（80.9±5.23）%;siRNA2后对CD86蛋白表达的抑制率为（60.7±4.15）%和（74.7±4.63）%。结论 siRNA可特异抑制树突细胞B7基因的转录和表达,为进一步研究siRNA诱导移植免疫耐受提供了理论和实验基础,为诱导器官移植免疫耐受提供了新思路和途径。