新型天蚕素A-马盖宁杂合肽对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌杀菌作用的机制研究

目的研究天蚕素A-马盖宁杂合肽对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)杀菌作用的作用机制。方法采用微量稀释法测定杂合肽对MRSA的最低抑菌浓度(MIC)。通过透射电子显微镜观察该杂合肽作用于MRSA后细菌细胞膜的变化,采用原子吸收光谱仪检测待测菌液与杂合肽相互作用后细菌细胞外K+的浓度变化,用流式细胞仪分析杂合肽作用于MRSA后细菌细胞膜完整性的变化。结果杂合肽对MRSA的MIC是64μg/mL。通过超微结构图像观察到细菌细胞膜破坏,杂合肽作用后细胞外钾离子浓度的升高,杂合肽引起碘化丙啶(PI)流入细胞质内,PI着染阳性细胞的比率增高。结论天蚕素A-马盖宁杂合肽可能是通过破坏MRSA细胞膜,使细胞外钾离子浓度的升高同时导致PI进入胞质,细胞内部成分被破坏,从而起到杀菌作用。     

抗菌肽SMAP-29衍生物的原核表达及纯化

目的利用大肠杆菌表达系统表达具有抗菌活性的SMAP-29衍生物，一步亲和层析法进行纯化。方法化学合成经改造的抗菌肽SMAP-29衍生物，纸片扩散法检测抗菌活性后，人工并用合成抗菌肽SMAP-29衍生物基因序列，克隆到表达载体pTYB11上，转化大肠埃希菌BL-21（DE3），酶切和测序鉴定后，用异硫代β—D-半乳糖昔（isopropyl β—D—thiogalactoside IPTG）诱导表达融合蛋白。经几丁质亲和层析柱纯化。结朵化学合成的抗菌肽SMAP-29衍生物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和绿脓杆菌具有一定的抑菌作用，SMAP-29衍生物的编码基因按正确方向和序列插入表达载体，融合蛋白的表达量达到大肠杆菌蛋白总量的40％，几丁质亲和层析后获得了可溶性SMAP-29衍生物。结论成功构建了以融合蛋白形式表达的抗菌肽SMAP-29衍生物大肠杆菌基因工程菌，克服了抗菌肽对宿主菌的毒性，实现了用大肠杆菌高效表达和一步亲和层析纯化，为进一步检测活性及临床应用奠定了基础。     

自组装短肽RADA16-I的抑菌活性探索

目的初步研究自组装短肽(RADA16-I)在不同浓度下对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抑菌活性;并进行在1%浓度的RADA16-I水溶液对金黄葡萄球菌、大肠杆菌和白色念珠菌的抑菌曲线研究。方法用不同浓度RADA16-I水溶液,分别对金黄葡萄球菌、大肠杆菌作用8h后,以计数菌落数探索该短肽的抑菌活性,找到最低抑菌浓度;研究RADA16-I浓度在1%时观察大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌在5min、10min、20min、1h、2h各时间点菌落数,描绘抑菌曲线。结果对于金黄色葡萄球菌,浓度大于0.25%时均有较好的抑菌活性。对于大肠杆菌,浓度大于0.5%时有较好的抑菌活性;该自组装短肽对金黄色葡萄球菌抑菌活性更好。在1%浓度时,该自组装短肽在5min时就有很好的抑菌活性,且对金黄色葡萄球菌抑菌活性更好。结论该短肽具备抑菌肽特性,具有较好的抑菌活性,最低抑菌浓度在0.25%,与白色念珠菌、大肠杆菌相比,对金黄色葡萄球菌抑菌活性更强。     

人精液抗菌多肽29肽的分离纯化及活性研究分析

目的研究分析人精液抗菌多肽29肽的分离纯化及活性。方法对人精液先进行粗品提制,并进行冷冻保存,然后将冷冻的精液干粉进行溶解,分别进行阳离子交换柱进行层析、凝胶过滤等,将溶解的精液干粉进行洗脱,并用收集器收集洗脱峰,低温干燥冷冻保存,然后稀释进行抑菌试验,具有抑菌性的洗脱峰即为含抗菌肽的峰。之后,对含抗菌肽的提取物进行最低抑菌浓度、抗菌谱检测,采用琼脂糖弥散法对不同浓度29肽的抗菌活性的检测分析,并对其溶血活性予以检测。结果最低抑菌浓度、抗菌谱检测：杀菌活性整体要优于抗生素,对杀菌活性从低到高进行排序,结果为：大肠杆菌（10.5ug/mL）、绿脓杆菌（18.8ug/mL）、金黄色葡萄菌（20.9ug/mL）、酵母菌（37.1ug/mL）,以及白色念珠菌（41.8ug/mL）。琼脂糖弥散法对不同浓度29肽抗菌活性的检测分析：29肽对真菌均的抑制作用很强;对G＋的抑菌活性要大于对G-的抑菌活性,对绿脓杆菌的抑制活性相对最强,对酵母菌和白色念珠菌的抑制活性相对较弱。菌肽的溶血活性的检测：抗菌肽溶血活性均呈现阴性,说明29肽不具有溶血活性。结论抗菌肽的抗菌能力较之抗生素明显要强,29肽初步确定为一种新型的生物活性多肽,是具有很强的抗菌活性,且对真菌的抑制力很强,在条件允许的情况下,值得临床推广应用。     

大肠杆菌中融合表达人β防御素-3基因的研究

目的为了在大肠杆菌中融合表达人β防御素-3基因。方法根据大肠杆菌对精氨酸密码子使用的偏爱性,设计搭桥引物,并通过PCR扩增法合成了人β防御素的全基因序列,克隆进pGEX-4T-2中构建pGEX-4T-2-hBD-3融合表达载体。将表达载体转化E.coli宿主菌DH5α,进行IPTG诱导表达。将菌体反复冻溶使细胞膜穿孔,释放可溶性蛋白。融合蛋白GST-hBD-3经凝血酶切割。结果研究得到了重组人防御素蛋白,琼脂孔穴扩散抑菌法检测表明,重组人β防御素3对金黄色葡萄球菌有抗菌活性,抑菌效价为0.843 U。结论人β防御素-3基因在大肠杆菌中得到了融合表达。     

配合物[Co（C13H16N2O7S2）（H2O）3]2·H2O的体外抗菌活性研究

目的：对标题化合物Co（Ⅱ）-牛磺酸缩-5-甲基-2-羟基-1,3-苯二甲醛席夫碱配合物[Co（C13H16N2O7S2）（H2O）3]2·H2O进行体外抗菌活性研究。方法：采用连续稀释法测定该化合物对金黄色葡萄球菌、乙型溶血性链球菌、肺炎链球菌和大肠杆菌的最低抑菌浓度。结果：该化合物在浓度为0．5325mg／ml时,对肺炎链球菌无菌落生长,而对金黄色葡萄菌、乙型溶血性链球菌和大肠杆菌都有菌落生长。结论：该化合物对肺炎链球菌有体外抗菌活性,其MIC值为0．5325mg／ml,而对金黄色葡萄球菌、乙型溶血性链球菌和大肠杆菌都无体外抗菌活性。     

融合防御素基因BH的真核表达产物体外抗菌活性研究

目的:为了探索新型融合防御素基因BH抗菌活性。方法:将壳聚糖包裹好的VR-BH转染HEK293细胞,转染24小时,48小时和72小时提取转染后总RNA,同时收集细胞上清,然后采用体外96孔板抑菌法,将融合防御素基因BH的真核表达产物加入到大肠杆菌和金黄色葡萄球菌菌液中,然后通过酶标仪检测菌液OD595。结果:表明大肠杆菌和金黄色葡萄球菌菌液加入融合防御素基因BH的24小时、48小时和72小时三个时间段的真核表达产物后,其菌液中的细菌含量较对照组均显著降低。结论:本实验结果表明融合防御素基因BH的真核表达产物对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌有较显著的抑菌作用,为探索防御素基因BH作为抗菌生物制剂替代传统抗生素奠定一定的基础。     

抗耐药金黄色葡萄球菌工程多肽--一种人工构建的抗菌蛋白质分子机器

目的 将两个不同种来源,不同生物活性的蛋白质结构域构建成为一种具有靶向抗菌活性的工程多肽．方法 利用质粒重组,将金黄色葡萄球菌AgrD信息素(8肽)基因连接在大肠菌素Ia水性孔道结构域(K544-1626)羧基端基因上,将重组的质粒转化入工程菌生产构建的工程多肽,离子交换柱纯化后经体外抗菌试验检测其抗菌活性．结果 构建的工程多肽具有强于青霉素类抗生素上百倍的抗耐药金黄色葡萄球菌的活性。结论 构建的工程多肽表现出了两个结构域前体都不具备的靶向抗金黄色葡萄球菌活性,从而构建成功了一种具有特异抗菌功能的人造多结构域蛋白质分子机器。     

方格星虫多糖抗菌活性的初步研究

目的研究方格星虫多糖的抗菌活性。方法以方格星虫体壁作为试验材料，经沸水抽提、乙醇沉淀和sevage法去蛋白后得到粗多糖，再经G-50葡聚糖凝胶柱层析纯化。采用硫酸-苯酚法测定多糖的含量，以含不同浓度的方格星虫多糖（50，37．5，25，12。5mg／ml）培养基，分别接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和枯草杆菌培养12、24、36、48h，观察并记录其生长情况。结果不同方格星虫多糖浓度（25—50rag／ml）对三种试验菌的生长均有抑制作用，浓度越高抗菌活性越强。结论方格星虫多糖对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌埃希菌、枯草杆菌有明显的抗菌活性。     

含凝血因子FXa识别位点的融合表达体系的构建

目的 :研究含凝血因子FXa识别位点的基因与表达载体pGEX KG连接后在大肠杆菌中的表达。方法 :用PCR对人工合成的抗菌肽X基因的 5′端进行改造 ,引入FXa的酶切位点 ,用限制性内切酶作用后 ,连接到含Ptac启动子的表达载体pGEX KG中 ,转化大肠杆菌DH5α,用原位杂交法筛选到阳性克隆。转化大肠杆菌BL2 1,用异丙基硫代 β D半乳糖(IPTG)诱导。结果和结论 :抗菌肽X基因在大肠杆菌中获高效表达 ,表达量约占细胞总蛋白的 2 0 %。重组蛋白以可溶形式存在。融合蛋白经FXa切割后 ,产物有抗菌活性     

抗菌肽Cecropin-His-6基因的真核表达及其生物活性研究

目的 研究家蝇幼虫Cecropin-His-6抗菌肽基因生物学功能。方法从家蝇幼虫体内扩增Cecropin-His-6抗菌肽基因，构建pcDNA3．1／Cecropin-His-6重组表达质粒并用脂质体转染CHO细胞中，G418筛选，HisTrap HP亲和层析柱纯化目的蛋白，琼脂糖平板抑菌试验检测目的蛋白的抗菌活性。结果pcDNA3．1／Cecropin-His-6重组质粒成功转染入CHO细胞中，并获得具有抗菌活性的Cecropin-His-6目的蛋白。结论家蝇幼虫抗菌肽哺乳动物型工程细胞表达系统的建立，为进一步制备抗耐药菌的肽类抗生素奠定了基础。     

大肠杆菌诱导家蝇抗菌物质的研究

目的　对家蝇体内的抗菌物质进行研究。方法　用大肠杆菌诱导家蝇三龄幼虫 ,采用抑菌圈法 ,对家蝇体内抗菌物质的诱导效果及其活性进行研究。以SDS PAGE法分离家蝇的抗菌蛋白。结果　诱导产生的家蝇抗菌物质其活力高峰出现于第 48h。诱导后第 48h血淋巴稀释 10 0倍 ,对大肠杆菌的致死率仍达 12 % ;其抗菌物质对动、植物病原菌有广谱的抗菌活性 ,同时 ,未经诱导的家蝇幼虫也具有抗菌活性。SDS PAGE电泳分析表明 ,外源诱导能增强原有抗菌物质的表达量 ,并能激活新的蛋白产生。结论　为进一步纯化和生化分析家蝇体内的抗菌蛋白提供了新的依据。     

人工合成人恶性疟原虫58肽抗原基因在大肠杆菌中的表达

使用DNA合成仪合成的人恶性疟原虫58肽抗原基因,与大肠杆菌表达性载体质粒PWR450—Ⅰ重组,转化到大肠杆菌JM83中。用斑点杂交技术和电泳分析DNA方法筛选出阳性重组转化菌株,经SDS-聚丙烯酰胺凝胶蛋白电泳分析,证明合成基因在大肠杆菌中表达,产生与β—半乳糖苷酶融合的多肽。     

子宫内膜黏液抗菌肽的分离纯化及鉴定

目的从人子宫内膜黏液酸溶性提取物纯化及鉴定抗菌多肽,探讨子宫内膜的抗菌机制。方法采用酸性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳琼脂糖弥散法分析人子宫内膜黏液酸溶性提取物的抗菌活性,切下相应的抗菌条带进行洗脱电泳,并用反相高效液相色谱进一步分离纯化。用琼脂糖弥散法检测纯化分子抗菌活性;Trieine-SDS-PAGE电泳检测其相对分子质量。根据N端氨基酸序列和质谱分析的测序结果推导纯化分子的氨基酸序列,并进行生物信息学分析。结果从人子宫内膜酸溶性提取物中纯化出一种相对分子质量为6777的抗菌肽HUP-39,经鉴定为人血红蛋白α链N端第33-95的氨基酸残基片段。该片段富含碱性氨基酸,包含3个完整的α螺旋跨膜结构域,对大肠埃希菌氨苄西林耐药株ML-35p、标准株ATCC25922和临床分离株54080有较强的抑菌活性。结论本研究从人子宫内膜黏液酸溶性提取物中分离纯化出的抗革兰阴性菌多肽,为人血红蛋白α链片段。子宫内膜黏液中的抗菌分子不仅来源于上皮细胞和白细胞,也可来源于红细胞。     

利用电压钳技术初步研究抗菌肽抗菌机制

目的为了证实电压钳技术测得的电流变化能说明诱导的昆虫离体细胞Tn-5B1产生的抗菌活性肽类物质的抗菌机制。方法将制备的抗菌肽作用于去掉滤泡膜的爪蟾卵母细胞,利用电压钳技术记录的电流研究抗菌肽抗菌机制。结果去掉滤泡膜的非洲爪蟾卵母细胞可作为模式细胞研究离子通道,抗菌肽作用于爪蟾卵母细胞14 min后,检测到了电流的变化,而且表现为外向电流持续升高。结论细胞经抗菌肽作用后产生了离子通道,此离子通道使得阳离子外流,初步证实该抗菌肽通过破坏坏细菌细胞来达到杀菌目的 。     

艰难梭菌毒素A羧基端基因的克隆与表达

目的:克隆并表达艰难梭菌毒素A羧基末端受体结合区 (CDTAR)基因.方法:PCR扩增CDTAR基因并将其克隆到表达载体pET-22b( ),重组质粒转化到E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达,聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对表达产物进行分析.结果:构建了含CDTAR基因的重组质粒pET-CDTAR,IPTG诱导后SDS-PAGE显示表达出Mr约为35.7 ku的重组蛋白,占菌体总蛋白的36.1%,可溶性表达占上清的22.2%,包涵体中约占24.9%.结论:成功克隆了CDTAR基因,并构建表达了CDTAR重组蛋白,为进一步研究CDTAR功能及研制艰难梭菌疫苗奠定了基础.     

甲状腺球蛋白抗原决定簇基因的克隆及原核表达载体的构建

目的：扩增甲状腺球蛋白抗原决定簇基因，构建可转化人大肠杆菌的重组表达载体。方法：用TRIzol一步法从甲状腺组织中提取总RNA，RT—PCR逆转录出cDNA，PCR扩增出目的基因，与pET102／D—TOPO载体进行拓扑克隆．对重组质粒进行PCR、酶切及测序鉴定。结果：甲状腺球蛋白抗原决定簇基因及其重组表达载体经鉴定准确无误。结论：成功构建了带有目的基因的原核表达载体。     

E.coli DH10B碱性磷酸酶基因的克隆、表达及活性研究

目的：克隆并表达E.coli DH10B碱性磷酸酶（AKP）成熟肽基因（phoAm）,为AKP的定向改构及应用奠定基础。方法：采用PCR法从E.coli DH10B基因组扩增phoAm;将phoAm克隆入表达载体pET28a,再转入E.coli BL21（DE3）进行表达;用免疫金层析法和SDS-PAGE法检测表达的重组rAKP;采用对硝基酚磷酸（pNPP）法测定rAKP的活性。结果：rAKP单体分子量约47 K,活性分析比对照菌提高21.5倍。结论：获得AKP成熟肽基因并得了到具有较高活性的重组rAKP。