人心钠素的蛋白质工程研究——Ⅰ.一种人心钠素衍生物RH-1的基因合成及克隆表达

在心钠素结构改造的蛋白质工程研究中,本工作首次提出以“分子嵌合法”构建心钠素衍生物的设计思想,并设计了系列心钠素衍生物RH-1、RH-2和RH-3。为阻止羧肽酶对心钠素的降解,羧肽酶抑制剂SQ20881被串联于α-bANP的N端,二个脯氨酸被串联于C端,从而形成杂合的心钠素衍生物分子RH-1,衍生物RH-2仅在α-hANP的N端嵌合SQ20881,衍生物RH-3则只在α-hANP的C端嵌合二个脯氨酸。用DNA合成仪合成RH-1基因的全部10个片段,经纯化拼接成全基因,并经核苷酸序列分析得以确认。克隆RH-1基因于表达性载体pLSD-13,构成pRHL-1重组体,并经限制性内切酶分析和Southern杂交证明了RH-1基因的正确插入。用大肠杆菌N6405菌株表达该基因,SDS/PAGE分析证实了衍生物RH-1基因的表达。凝胶扫描表明,表达蛋白量约占细胞可溶性蛋白的11％。     

降钙素基因的化学合成与克隆

本文报道用化学法全合成降钙素的基因。基因全长113碱基对。采用大肠杆菌偏爱密码子。整个基因分为6个片段合成。用T~4DNA连接酶一次连接成功,序列分析证明合成的基因序列与设计的一致。     

Sequential check and computer analysis of a cloned DNA fragment specific for Plasmodium vivax

A cloned DNA fragment specific for Plasmodium vivax was cleaved from theplasmid pVA1 and ligated into phage M13mp18.The nucleotides of the insert were se-quenced by the dideoxy-chain termination procedure.The fragment was composed of 261base pairs and 3 Hinf Ⅰ sites but no tandem repeat sequences.Computer retrieval andanalysis show that the nucleotide sequence of the cloned DNA fragment is unique,forthere has not been any significant homologue with that of other Plasmodium genes pub-lished as yet.     

恶性疟原虫杂合抗原基因的表达及其产物免疫功能的研究

化学合成的人恶性疟原虫杂合多肽抗原 AB 基因,编码子孢子 CSP重复序列 NANP、CSPTh2R和红内期spf35.1、spf83.1、spf55.1、spf83.18、pf155/RESA-5’端重复区共7个不同免疫功能表位,与大肠杆菌质粒pWR450-1重组,构建成pWR450-1/AB表达载体。在乳糖操纵子调控下以β-半乳糖苷酶-恶性疟原虫杂合多肽抗原融合蛋白形式,在大肠杆菌中高效表达。表达产物经SDS-PAGE电泳分离纯化后,加福氏佐剂免疫家兔,诱导产生较高滴度的抗血清。抗血清对人恶性疟原虫体外生长有明显的抑制作用,24h抑制率为65.92％;72h的抑制率为72.63％。对照血清无抑制作用。分离纯化的表达产物能与鼠抗恶性疟原虫和疟疾患者抗血清起免疫反应。这些结果表明合成基因的表达产物具有较好的免疫原性。     

人工合成人恶性疟原虫58肽抗原基因在大肠杆菌中的表达

使用DNA合成仪合成的人恶性疟原虫58肽抗原基因,与大肠杆菌表达性载体质粒PWR450—Ⅰ重组,转化到大肠杆菌JM83中。用斑点杂交技术和电泳分析DNA方法筛选出阳性重组转化菌株,经SDS-聚丙烯酰胺凝胶蛋白电泳分析,证明合成基因在大肠杆菌中表达,产生与β—半乳糖苷酶融合的多肽。     

人红细胞生成素全基因的化学合成及克隆

利用DNA合成技术,设计并合成人红细胞生成素(EPO)的全基因,EPO基因全长600 bp.首先合成32个小片段,经纯化后分别连接成相应的3个基因大片段,再将3个基因大片段组装成1个完整的EPO基因。用双脱氧末端终止法对基因大片段及全基因进行DNA序列分析,结果表明化学合成的基因序列与最初设计的EPO基因序列完全一致。     

人α-心房肽基因的化学合成及其在酵母系统中的克隆和表达

按酵母密码系统化学合成人α-心房肽。为得到人α-心房肽基因的正确表达,少数碱基已按酵母简并密码予以替换,但在DNA序列互补的另一链的相应位点上的密码则未作相应的替换,故在局部上出现了不配对的格局。该基因已被克隆入带有α-factor外分泌型启动子的穿梭质粒pCLWA_2,含有编码人α-心房肽不同DNA序列的重组体已用Bg1 Ⅱ的限制性分析加以区别。比较两种基因所表达的人α-心房肽水平表明:含有酵母简并密码的基因所表达的人α-心房肽水平(0.5～0.7mg/L)低于按天然DNA序列合成的基因所表达的人α-心房肽水平(0.8～1mg/L)。     

人α-心钠素基因的串联

将α-心钠素(α-hANF)基因克隆到PUC_(18)载体上,经菌落原位杂交筛选鉴定出有α-hANF基因的克隆株。用BamⅡ和BamH Ⅰ消化并分离纯化得到含5′端部分α-hANF基因及PUC_(18)载体的F_1片段。用DNA合成仪合成3′端部分α-hANF基因的F_2接头,在基因3′端加入谷氨酸的密码子GAA,作为表达产物用内肽酶Glu-C专一裂解的位置,并去掉基因3′端的终止信号TGA,将原BamH Ⅰ接头改为EcoR Ⅰ接头。最后,将F_1和F_2片段与α-hANF基因酶促连接后进行转化,通过双酶切筛选出含有双拷贝α-hANF基因的转化子,并用双脱氧链终止法进行序列分析,证明核苷酸顺序正确。