电压钳位法检测细胞内钙振荡

目的 建立一种电压钳位技术检测细胞内钙振荡的方法。方法 采用全细胞电压钳位法检测非洲爪蟾卵母细胞微量注射CaCl2诱发的振荡电流。结果 振荡电流为钙诱发的振荡电流，以同样的方法也能测得氨甲酰胆碱激动表达于非洲爪蟾卵母细胞膜之大鼠脑胆碱受体而产生的振荡电流。     

卵母细胞双电极电压钳技术的建立及其记录到的内源性外向电流*

目的：建立卵母细胞双电极电压钳记录技术。方法：建立双电极电压钳技术平台，并应用此平台，在去除滤泡膜的中国四川牛蛙卵母细胞上，记录内源性的外向离子电流。结果：卵母细胞孵育在正常ND96溶液中，将细胞膜钳制在-80 mV膜电位，给予一系列的去极化刺激可诱发出一个外向电流。在细胞外液中加入10 mM的TEA可阻断该电流80%以上，洗脱后电流幅值恢复至90%左右。将正常ND96溶液替换为无钙ND96溶液后，电流没有变化。结论：成功建立了卵母细胞双电极电压钳记录技术。去极化刺激在牛蛙卵母细胞上诱发出的外向电流为钾电流。     

GABAA受体在爪蟾卵母细胞的表达

目的 将鼠源γ-氨基丁酸A型（GABAA）受体表达于爪蟾卵母细胞膜上并行功能测定。方法 微量注射仪将纯化的大鼠脑mRNA注入准备好的爪蟾卵母细胞内并于19℃温浴48h以上使其表达；使用常规双电极电压钳记录卵母细胞表达的受体特性。结果 爪蟾卵母细胞注射大鼠脑mRNA 48h后有GABAA受体的表达，此受体具有天然GABAA受体的氯通道特性。结论 爪蟾卵母细胞具有表达外源GABAA受体的特性，是研究GABA受体生理和药理功能的一种重要工具。     

电压钳位法检测细胞内钙振荡

目的　建立一种电压钳位技术检测细胞内钙振荡的方法。方法　采用全细胞电压钳位法检测非洲爪蟾卵母细胞微量注射CaCl2 诱发的振荡电流。结果　振荡电流持续 1h以上 ,并分别被注射EGTA和肝素以及细胞外灌流氮氟灭酸所取消。结论　结果提示该振荡电流为钙诱发的振荡电流。以同样的方法也能测得氨甲酰胆碱激动表达于非洲爪蟾卵母细胞膜之大鼠脑胆碱受体而产生的振荡电流。     

异戊酸对非洲爪蟾蝌蚪的制动作用及其相关机制

目的观察异戊酸对非洲爪蟾蝌蚪运动的影响,探讨异戊酸对非洲爪蟾卵母细胞膜上甘氨酸耦联的抑制性氯离子通道的影响及其与异戊酸麻醉样作用的关系。方法对非洲爪蟾的蝌蚪在体观察异戊酸的制动效应;采用微注射法使非洲爪蟾卵母细胞上过度表达α1甘氨酸受体,并通过双电极电压钳技术测量异戊酸对甘氨酸耦联的抑制性氯离子通道功能的影响。结果异戊酸在非洲爪蟾蝌蚪中可产生类麻醉效应,其EC50为（44.8±3.7）mmol/L;Hill系数为4.1±1.2;浓度为5.0、7.5、10、20mmol/L的异戊酸可明显增强甘氨酸诱发的氯离子通道电流强度,增强程度为（19.4±4.9）%、（78.6±5.6）%、（107±27）%、（187±39）%,有显著性差异（P＆lt;0.01）。异戊酸可呈浓度依赖性地增加通过非洲爪蟾卵母细胞上甘氨酸耦联抑制性氯离子通道的电流。结论异戊酸对非洲爪蟾蝌蚪具有制动作用,其机制可能与增强对甘氨酸耦联抑制性氯离子通道的电流有关。     

非洲爪蟾卵母细胞内源性及外源性ATP和GABA受体介导的膜反应比较

目的 :对非洲爪蟾卵母细胞表达的ATP和GABA激活电流进行比较。方法 :包括mRNA和cDNA的提取、卵母细胞的微量注射及双电极电压钳技术。结果 :①在表达P2X2 或P2X4 的卵母细胞上 ,外加ATP可分别诱导一被Zn2 + 增强的内向电流。②在表达鸡脑mRNA的卵母细胞上 ,可记录到GABA激活电流 ,且此电流可被bicucul line(一种GABAA 受体选择拮抗剂 )所阻断。③在表达了人视网膜 ρ1亚基cRNA的卵母细胞上 ,外加GABA可引起一不被bicuculline阻断的内向电流 ,后者可被I4AA(一种GABAC 受体特异性拮抗剂 )阻断。④在具有滤泡膜的卵母细胞上可记录到 3种形式的ATP激活电流和一外向的慢的GABA激活电流。⑤在除去滤泡膜的卵母细胞上均未记录到ATP和GABA激活电流。结论 :卵母细胞上存在内源性的嘌呤受体、GABAB 和GABAC 受体 ;且此内源性受体存在于滤泡膜上 ;P2X2 、P2X4 嘌呤受体及GABAA 和GABAC 受体均可在卵母细胞上表达 ,表达的受体所介导的激活电流与内源性受体介导的激活电流有明显区别     

非洲爪蟾卵母细胞内源性及表达的P2型嘌呤受体介导的膜电流记录方法

目的 记录和区分卵母细胞内源性P2型嘌呤受体及表达的外源性P2型嘌呤受体介导的膜电流。方法 应用双电极电压钳技术分别在带滤泡膜及去滤泡膜后注入RNA并经孵育的卵母细胞记录膜电流。结果 根据所用卵母细胞标本的制备（是否去滤泡膜及是否注入RNA并孵育）以及电流的形式及幅值，可将内源性P2型嘌呤受体和表达的外源性P2型嘌呤受体介导的膜电流区分开来。结论 应用以上方法可区分两种不同的三磷酸腺苷（adenosine triphosphate,ATP)激活电流。     

爪蟾抗菌肽的人工合成及对菌膜作用的实验研究

目的探讨爪蟾抗菌肽（magainin）的人工合成及对金黄色葡萄球菌细胞膜的作用。方法利用氨基酸固相合成的方法合成爪蟾抗菌肽,高效液相色谱法进行纯化,质谱鉴定后,得到的爪蟾抗菌肽纯度在99％以上。将爪蟾抗菌肽作用于引起感染性心内膜炎的金黄色葡萄球菌ATCC25923,以PBS缓冲液作为阴性对照,TritonX．100作为阳性对照。结果爪蟾抗菌肽作用于引起心内膜炎的金黄色葡萄球菌后,ATCC25923的A630nm值从0．166下降到0．138,负染后透射电镜观察,发现细菌表面存在破损成小孔的地方,细胞膜界限模糊不清,甚至细胞膜完全溶解。爪蟾抗菌肽通过破坏细菌细胞膜而导致细菌的死亡。结论爪蟾抗菌肽能够提高细菌细胞膜的通透性。     

丙戊酸钠对大鼠脑NMDA受体在爪蟾卵母细胞表达的影响

目的 :观察丙戊酸钠对大鼠脑 N-甲基 - D-天冬氨酸 ( NMDA)受体在非洲爪蟾卵母细胞表达的影响。方法 :采用电压钳位技术记录表达于非洲爪蟾卵母细胞膜上的大鼠脑 NMDA受体通道电流及特性并观察 0 .1和 0 .5 mmol· L-1 丙戊酸钠对大鼠脑 NMDA受体通道电流的影响。结果 :丙戊酸钠 ( 0 .1和 0 .5 mmol· L-1 )对表达于非洲爪蟾卵母细胞的大鼠脑 NMDA受体功能有抑制作用 ,电流峰值由 ( 97.5± 9.8) n A降至 ( 79.7± 1 0 .5 ) n A、( 61 .3± 1 2 .5 ) n A ( P<0 .0 5和P<0 .0 1 )。结论 :丙戊酸钠对大鼠脑 NMDA受体有明显的抑制作用     

大鼠脑组织mRNA在非洲爪蟾卵母细胞的表达——外源性GABAA受体与内源性GABAA和GABAB受体的比较

目的 本文利用在非洲爪蟾卵母细胞表达外源基因的技术，对比研究卵母细胞内源性GABA受体和表达的鼠脑GABA受体，为进一步进行递质与受体的研究奠定方法学基础。方法 实验采用Trazol试剂法及oligo-dt纤维素柱过柱法，从20只大鼠脑组织抽提多聚腺嘌呤mRNA，注入非洲爪蟾卵母细胞表达有功能的受体，并利用电压钳方法记录受体激活电流。结果 卵母细胞内源性GABA受体和表达的鼠脑GABA受体存在多方面的不同。结论 本实验建立的表达模型在研究递质与受体功能、结构、药理学特性等方面起到一定的参考作用。     

鼠脑神经递质受体在卵母细胞上的表达

把提取的鼠脑mRNA注射到卵母细胞内,在卵母细胞上以双电极电压钳技术研究某些递质的诱导电流。实验发现除卵母细胞本身所具有的muscarine受体外,还有多种受体明显地在卵母细胞上表达。卵母细胞膜上的表达受体的反应可分平滑型、振荡型、复合型三类。其反应类型与所开启的通道及通透离子有关。平滑型反应的受体与离子通道为一复合体,激动剂开启其自身离子通道。而振荡型反应是递质通过第二信使的介导,引起胞内Ca2+库中的Ca2+释放,开启卵母细胞膜本身的Cl－通道,产生Ca2+依赖的Cl－电流,构成振荡型电流反应的主要成分。复合型二者兼有。     

Modulation by Divalent Cations of GABAρ1 Receptor From Human Retina Expressed in Xenopus Oocytes

ＩＮＴＲＯＤＵＣＴＩＯＮγ ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃａｃｉｄ (ＧＡＢＡ)ｆｕｎｃｔｉｏｎｓａｓａｎｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒｉｎｔｈｅｍａｍ ｍａｌｉａｎｃｅｎｔｒａｌｎｅｒｖｏｕｓｓｙｓｔｅｍ .Ｉｎｉｔｉａｌｌｙ,ＧＡＢＡｒｅｃｅｐｔｏｒｓｗｅｒｅｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏｔｗｏｗｅｌｌ ｃｈａｒａｃ ｔｅｒｉｚｅｄｒｅｃｅｐｔｏｒｔｙｐｅｓ,ＧＡＢＡＡａｎｄＧＡＢＡＢｒｅｃｅｐｔｏｒｓ.Ａｔｈｉｒｄｔｙｐｅｗａｓｄｉｓｃｏｖｅｒｅｄｉｎｂｒａｉｎａｎｄｒｅｔｉｎａ,ａｎｄｗａｓ…     

大鼠螺旋神经节细胞的电压依赖型钠离子通道的研究

目的 认识大鼠螺旋神经节细胞膜上电压依赖型钠离子通道的电生理特征。方法 采用全细胞电压钳记录模式，观察分离出的大鼠螺旋神经节细胞在不同的钳制电压下胞膜上钠离子通道电流的幅度、激活和失活等电生理特性。结果 在全细胞电压钳制下共在17个螺旋神经节细胞膜上成功记录到钠离子通道电流。钠离子通道电活动有着电压依赖特性，在-40mv激活，-20mV最大，＋20mV失活，但钠离子通道电流与电压为非直线性关系，同样，该通道对0．05μmol／L河鱼屯毒素阻滞剂敏感，且大鼠螺旋神经节细胞膜上的电流密度都基本相同。结论 大鼠螺旋神经节细胞存在着电压依赖型钠离子通道，其电生理学特性适合作初级听神经元离子通道的实验研究。     

爪蟾卵母细胞固醇调控通路的建立及姜黄素的作用

[目的]在爪蟾卵母细胞中建立人类SCAP/SREBP固醇调控系统,利用此系统研究姜黄素对SCAP/SREBP调控通路的作用。[方法]构建带有绿色荧光报告蛋白基因的PLXRN-4SRE-fpa质粒,将构建质粒和其他几种质粒分别提取混和成实验组质粒和对照组质粒,通过微注射的方法分别共注射到Ⅴ、Ⅵ爪蟾卵母细胞核内,与不同浓度的姜黄素共孵育3天,使用荧光定量PCR检测荧光表达量。[结果]相同浓度的姜黄素对注射含有固醇调节元件质粒的卵母细胞荧光表达量要明显高于不含相应元件的质粒。[结论]构建的质粒pLXRN-4SRE-fPA能在爪蟾卵母细胞中有效地应答SCAP、SREBP调控因子;通过影响SCAP/SREBP调控通路调节SRE-1下游基因的表达可能是姜黄素调脂作用的机理之一;利用核内共注射的方法在爪蟾卵母细胞中建立的SCAP/SREBP调控系统可作为SCAP配体类药物快速筛选和作用机制研究的细胞模型。     

Whole-cell recordings of voltage-gated Calcium, Potassium and Sodium currents in acutely isolated hippocampal pyramidal neurons

Objective:To record Calcium, Potassium and Sodium currents in acutely isolated hippocampal pyramidal neurons. Methods:Hip-pocampal CA3 neurons were freshly isolated by 1 mg protease/3 ml SES and mechanical trituration with polished pipettes of progressively smaller tip diameters. Patch clamp technique in whole-cell mode was employed to record voltage-gated channel currents. Results:The procedure dissociated hippocampal neurons, preserving apical dendrites and several basal dendrites, without impairing the electrical characteristics of the neurons. Whole-cell patch clamp configuration was successfully used to record voltage-gated Ca2+ currents, delayed rectifier K+ current and voltage-gated Na+ currents. Conclusion:Protease combined with mechanical trituration may be used for the dissociation of neurons from rat hippocampus. Voltage-gated channels currents could be recorded using a patch clamp technique.     

兔脑 —氨基丁酸结合蛋白（受体）在非洲瓜蟾卵母细胞上的重建

Gurdon's Xenopus laevis oocyte translation system has been extensively employed to investigate the molecular biology of gamma-aminobutyric acid (GABA) receptors in the brains of embryonic chick, rat, etc. As GABA and its receptor may play a role in the pathogenesis of hepatic encephalopathy and a rabbit model of fulminant hepatitis has been established, we reconstituted the rabbit model of fulminant hepatitis has been established, we reconstituted the rabbit brain GABA binding protein (receptor) on Xenopus laevis oocytes to offer a base for further study of the pathological effects of GABA receptor at molecular level. In this report, total RNA was extracted from rabbit brain by guanidine hydrochloride method. The total RNA was then subjected to oligo-(dT)-cellulose affinity chromatography to isolate mRNA. All the RNA samples achieved a high purity with an average OD260/OD280 ratio of about 2.10. The clear bands of 18 S and 28S rRNA in electrophoresis implied that the RNA was not degraded and was therefore available for expression. After two days of incubation of the oocytes injected with mRNA, radioreceptor assay indicated that saturable and specifically displaceable GABA binding sites were implanted onto the oocyte membrane. This result led us to the conclusion that rabbit brain GABA binding protein (receptor) can be reconstituted by injecting exogenous mRNA inclusive of those encoding the receptor into Xenopus oocytes. However, the functional activity of the reconstituted receptor as a GABA gated chloride ion channel needs to be further characterized by patch clamping.     

卵母细胞基因表达系统的应用研究

目的 :建立研究神经生理及药理的卵母细胞表达模型 ,并对鸡脑mRNA在卵母细胞上表达的氨基酸类受体进行研究。方法 :采用盐酸胍或异硫氰酸胍法抽提总RNA ,经寡聚脱氧胸苷 (oligo -dT)纤维素柱纯化得mRNA。mRNA微注射到卵母细胞内进行表达 ,以双电极电压钳技术研究表达的受体。结果 :模型能明显表达外源性mRNA表达的受体 ,而阴性对照无表达。在卵母细胞膜上表达的γ -氨基丁酸 (γ -aminobutyricacid ,GABA) ,甘氨酸(Glycine ,Gly)及红藻氨酸 (Kainate ,KA)受体 ,施加GABA ,Gly及KA均能引起一剂量依赖的内向电流 ,相应的拮抗剂可阻断其电流。剂量效应曲线显示GABA及KA诱导电流的半有效浓度 (EC5 0 )分别为 2 .9× 10 -5mol/L及 6 .3× 10 -5mol/L。结论 :卵母细胞可明显表达鸡脑mRNA编码的KA ,Gly及GABA受体 ,其药理特性与天然受体相似 ,是一个良好的神经生理及药理研究模型。