大鼠脑组织mRNA在非洲爪蟾卵母细胞的表达——外源性GABAA受体与内源性GABAA和GABAB受体的比较

目的 本文利用在非洲爪蟾卵母细胞表达外源基因的技术，对比研究卵母细胞内源性GABA受体和表达的鼠脑GABA受体，为进一步进行递质与受体的研究奠定方法学基础。方法 实验采用Trazol试剂法及oligo-dt纤维素柱过柱法，从20只大鼠脑组织抽提多聚腺嘌呤mRNA，注入非洲爪蟾卵母细胞表达有功能的受体，并利用电压钳方法记录受体激活电流。结果 卵母细胞内源性GABA受体和表达的鼠脑GABA受体存在多方面的不同。结论 本实验建立的表达模型在研究递质与受体功能、结构、药理学特性等方面起到一定的参考作用。     

丙戊酸钠对大鼠脑NMDA受体在爪蟾卵母细胞表达的影响

目的 :观察丙戊酸钠对大鼠脑 N-甲基 - D-天冬氨酸 ( NMDA)受体在非洲爪蟾卵母细胞表达的影响。方法 :采用电压钳位技术记录表达于非洲爪蟾卵母细胞膜上的大鼠脑 NMDA受体通道电流及特性并观察 0 .1和 0 .5 mmol· L-1 丙戊酸钠对大鼠脑 NMDA受体通道电流的影响。结果 :丙戊酸钠 ( 0 .1和 0 .5 mmol· L-1 )对表达于非洲爪蟾卵母细胞的大鼠脑 NMDA受体功能有抑制作用 ,电流峰值由 ( 97.5± 9.8) n A降至 ( 79.7± 1 0 .5 ) n A、( 61 .3± 1 2 .5 ) n A ( P<0 .0 5和P<0 .0 1 )。结论 :丙戊酸钠对大鼠脑 NMDA受体有明显的抑制作用     

NMDA受体亚基NR1的体外表达及功能检测

目的：体外表达ＮＭＤＡ受体亚基ＮＲ１并了解其电生理学特性,探讨体外表达受体亚基的意义。方法：将克隆的ＮＭＤＡ受体亚基ＮＲ１质粒ＤＮＡ经体外转录成ＲＮＡ,显微注射到爪蟾卵母细胞后进行受体表达,采用双电极电压钳位技术记录表达的ＮＲ１亚基的激活电流。结果：注射ＮＲ１亚基ＲＮＡ的爪蟾卵母细胞能表达出具有电生理学功能的受体,其激活电流能被Ｄ－ＡＰ５阻断等特性,说明该表达的ＮＲ１亚基具有ＮＭＤＡ受体的功能。结     

非洲爪蟾卵母细胞内源性及外源性ATP和GABA受体介导的膜反应比较

目的 :对非洲爪蟾卵母细胞表达的ATP和GABA激活电流进行比较。方法 :包括mRNA和cDNA的提取、卵母细胞的微量注射及双电极电压钳技术。结果 :①在表达P2X2 或P2X4 的卵母细胞上 ,外加ATP可分别诱导一被Zn2 + 增强的内向电流。②在表达鸡脑mRNA的卵母细胞上 ,可记录到GABA激活电流 ,且此电流可被bicucul line(一种GABAA 受体选择拮抗剂 )所阻断。③在表达了人视网膜 ρ1亚基cRNA的卵母细胞上 ,外加GABA可引起一不被bicuculline阻断的内向电流 ,后者可被I4AA(一种GABAC 受体特异性拮抗剂 )阻断。④在具有滤泡膜的卵母细胞上可记录到 3种形式的ATP激活电流和一外向的慢的GABA激活电流。⑤在除去滤泡膜的卵母细胞上均未记录到ATP和GABA激活电流。结论 :卵母细胞上存在内源性的嘌呤受体、GABAB 和GABAC 受体 ;且此内源性受体存在于滤泡膜上 ;P2X2 、P2X4 嘌呤受体及GABAA 和GABAC 受体均可在卵母细胞上表达 ,表达的受体所介导的激活电流与内源性受体介导的激活电流有明显区别     

老年性痴呆大鼠M型乙酰胆碱受体功能变化的研究

目的 :探讨老年性痴呆大鼠M型乙酰胆碱受体功能变化。方法 :建立老年性痴呆 (Alzheimer’sdisease,AD)大鼠模型 ,抽提AD大鼠脑半球基底团多聚腺嘌呤mRNA ,注射到非洲爪蟾卵母细胞上表达有功能的大鼠脑乙酰胆碱受体 ,利用电压钳技术记录电压依赖性的离子通道电流。比较AD大鼠组与正常对照组乙酰胆碱 (ACh)引起的M型乙酰胆碱受体电流变化。结果 :①AD组和对照组每克脑组织提取的poly(A) +mRNA分别为 (18± 6 .2 ) μg ,(19± 5 .8) μg ,两者无统计学差异 ;②Cl-是表达的M型ACh电流的主要载流离子 ;③注射老年大鼠海马组织mRNA后 ,ACh诱发的电流幅度 (8.12± 2 .2 1)nA下降 ,比对照组 (2 1.32nA)约下降 (37± 2 .77) % ,差异有极显著性 (P <0 .0 0 1)。结论 :AD大鼠M型乙酰胆碱受体功能呈减弱趋势 ,其原因可能是受体蛋白遗传信息发生了改变。     

电压钳位法检测细胞内钙振荡

目的　建立一种电压钳位技术检测细胞内钙振荡的方法。方法　采用全细胞电压钳位法检测非洲爪蟾卵母细胞微量注射CaCl2 诱发的振荡电流。结果　振荡电流持续 1h以上 ,并分别被注射EGTA和肝素以及细胞外灌流氮氟灭酸所取消。结论　结果提示该振荡电流为钙诱发的振荡电流。以同样的方法也能测得氨甲酰胆碱激动表达于非洲爪蟾卵母细胞膜之大鼠脑胆碱受体而产生的振荡电流。     

电压钳位法检测细胞内钙振荡

目的 建立一种电压钳位技术检测细胞内钙振荡的方法。方法 采用全细胞电压钳位法检测非洲爪蟾卵母细胞微量注射CaCl2诱发的振荡电流。结果 振荡电流为钙诱发的振荡电流，以同样的方法也能测得氨甲酰胆碱激动表达于非洲爪蟾卵母细胞膜之大鼠脑胆碱受体而产生的振荡电流。     

大鼠脑N-甲基-D-门冬氨酸受体在非洲爪蟾卵母细胞的表达

从成年和14d龄大鼠脑中提取mRNA,并分别注入到非洲爪蟾卵母细胞内,以全细胞电压钳位法测N-甲基-D-门冬氨酸（NMDA）引起内向膜电流,成年组为（5.2± 1.3）nA,14d龄组为（13.3±0.8）nA,组间比较差异显著（P<0.01）;以最小反应模型分析14d龄组的NMDA量效反应曲线呈S形,K值为86μmol/L。结果表明14d龄鼠脑NMDA受体在非洲爪蟾卵母细胞表达较成年鼠好。     

兔脑γ-氨基丁酸结合蛋白(受体)在非洲爪蟾卵母细胞上的重建

作者采用盐酸胍法提取兔脑RNA,并经寡聚-(dT)-纤维素亲和层析分离获得完好的总mRNA,这种异源mRNA注入非洲爪蟾卵母细胞胞浆后经放射受体分析证实,γ-氨基丁酸结合蛋白(受体)能被重建于细胞膜上。该重建技术稳定可靠,为进一步进行γ-氨基丁酸受体的体外研究奠定了基础。     

神经慢性挤压伤疼痛模型大鼠脊髓GABAA受体mRNA表达的变化

目的：了解大鼠坐骨神经慢性挤压伤（chronic constriction injury, CCI）模型脊髓GABAA受体α2、γ2亚型mRNA表达的变化。方法：SD大鼠20只，5只为正常对照，15只做成CCI模型，用Von Frey细丝和CO2激光测定大鼠足爪的疼痛阈值变化，并于术后3d、7d和14d处死（n=5每组），取L4－5脊髓用RT－PCR方法测定不同时点大鼠脊髓GABAA受体α2、γ2亚型mRNA的表达量。结果：CCI大鼠结扎侧在术后3d即开始出现机械感觉异常和痛觉过敏，7d、14d组逐渐加重（P＜0．05）。与正常大鼠比较，CCI大鼠GABAA受体α2、γ2亚单位mRNA表达量于术后7d开始出现下降（P＜0．05），且术后14d组进一步降低（P＜0．01）。结论：CCI大鼠疼痛模型中脊髓GABAA受体α2、γ2亚单位的表达量明显下降，其在慢性神经性疼痛中发病机制中的确切作用尚待进一步研究。     

鼠脑神经递质受体在卵母细胞上的表达

把提取的鼠脑mRNA注射到卵母细胞内,在卵母细胞上以双电极电压钳技术研究某些递质的诱导电流。实验发现除卵母细胞本身所具有的muscarine受体外,还有多种受体明显地在卵母细胞上表达。卵母细胞膜上的表达受体的反应可分平滑型、振荡型、复合型三类。其反应类型与所开启的通道及通透离子有关。平滑型反应的受体与离子通道为一复合体,激动剂开启其自身离子通道。而振荡型反应是递质通过第二信使的介导,引起胞内Ca2+库中的Ca2+释放,开启卵母细胞膜本身的Cl－通道,产生Ca2+依赖的Cl－电流,构成振荡型电流反应的主要成分。复合型二者兼有。     

表达的辣椒素受体对甲醛刺激的反应

目的：验证Nielsen假设的正确性。方法：体外转录辣椒素受体(VRI)cDNA，获得CRmRNA，注入非洲爪蟾卵母细胞，异源性表达VRI。用甲醛刺激异源性表达的VRI。用双电极电压钳记录。结果：实验组有3个细胞对激动剂辣椒素(capsaicin 10^-7mol／L)有反应，并且VRI拮抗剂(capsazepine 10^-5mol／L)能完全阻断此内向电流。结论：表达的VRI对甲醛刺激发生反应。验证了Nielsen假设的正确性。     

Modulation by Divalent Cations of GABAρ1 Receptor From Human Retina Expressed in Xenopus Oocytes

ＩＮＴＲＯＤＵＣＴＩＯＮγ ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃａｃｉｄ (ＧＡＢＡ)ｆｕｎｃｔｉｏｎｓａｓａｎｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒｉｎｔｈｅｍａｍ ｍａｌｉａｎｃｅｎｔｒａｌｎｅｒｖｏｕｓｓｙｓｔｅｍ .Ｉｎｉｔｉａｌｌｙ,ＧＡＢＡｒｅｃｅｐｔｏｒｓｗｅｒｅｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏｔｗｏｗｅｌｌ ｃｈａｒａｃ ｔｅｒｉｚｅｄｒｅｃｅｐｔｏｒｔｙｐｅｓ,ＧＡＢＡＡａｎｄＧＡＢＡＢｒｅｃｅｐｔｏｒｓ.Ａｔｈｉｒｄｔｙｐｅｗａｓｄｉｓｃｏｖｅｒｅｄｉｎｂｒａｉｎａｎｄｒｅｔｉｎａ,ａｎｄｗａｓ…     

卵母细胞基因表达系统的应用研究

目的 :建立研究神经生理及药理的卵母细胞表达模型 ,并对鸡脑mRNA在卵母细胞上表达的氨基酸类受体进行研究。方法 :采用盐酸胍或异硫氰酸胍法抽提总RNA ,经寡聚脱氧胸苷 (oligo -dT)纤维素柱纯化得mRNA。mRNA微注射到卵母细胞内进行表达 ,以双电极电压钳技术研究表达的受体。结果 :模型能明显表达外源性mRNA表达的受体 ,而阴性对照无表达。在卵母细胞膜上表达的γ -氨基丁酸 (γ -aminobutyricacid ,GABA) ,甘氨酸(Glycine ,Gly)及红藻氨酸 (Kainate ,KA)受体 ,施加GABA ,Gly及KA均能引起一剂量依赖的内向电流 ,相应的拮抗剂可阻断其电流。剂量效应曲线显示GABA及KA诱导电流的半有效浓度 (EC5 0 )分别为 2 .9× 10 -5mol/L及 6 .3× 10 -5mol/L。结论 :卵母细胞可明显表达鸡脑mRNA编码的KA ,Gly及GABA受体 ,其药理特性与天然受体相似 ,是一个良好的神经生理及药理研究模型。     

Effects of free radicals and amyloid β protein on the currents of expressed rat receptors in Xenopus oocytes

Objective To investigate the effects of free radicals (FRs) and amyloid β protein 1-40 ( Aβ(1-40)) on the functions of expressed neurotransmitter receptors (NRs) i n Xenopus oocytes.Methods Total RNA and messenger RNA (mRNA) was prepared from 3-month-old Wistar rat br ain tissues with Promega kits and microinjected into maturated Xenopus oocyt es (stages Ⅴ-Ⅵ) with 50 nl (50 ng) for each oocyte. The microinjec ted oocy tes were incubated with modifiedBath’s solution at 19.0℃±1.0℃ for receptor expression and their currents were recorded with double electrode voltage clamp technique. Superoxide anion free radicals (SAFRs) were produced via a reaction system (HPXXO) with hypoxanthine (HPX, 0.05 mol/L) and xanthine oxidase (XO, 0.1 U/L). In order to observe the effects of Aβ and SAFRs on the e xpressed glutamate receptor, HPX/XO and Aβ(1-40) were added to incubation solution at 12 h, 24 h and 96 h before recording.Results The results showed that the oocytes expressed functional NRs originating from ra t brain tissues. These NRs included muscarinic acetylcholine (mACh), glutamate (Glu), dopamine (DA), serotonin (5-HT) and γ-aminobutyric acid (GABA). T he c urrent characteristics of expressed receptors were inward currents carried by ch loride ion with their equibrilium potentials close to -22 mV. The extent of ef fect on the current of expressed glutamate receptor from rat brain was different among different Aβ concentrations and incubation times. Aβ(1-40) at a c oncentration of 20 nmol/L had little effect on the currents of expressed rat br ain glutamate receptors up to 24 h of incubation period; but the currents of gl utamate receptor were significantly decreased (25% off, P&lt;0.01) in the trea tment of 60 nmol/L Aβ(1-40) over 24 h. Moreover, when 20 nmol/L Aβ (1-40) was co-incubated over 12 h with SAFRs produced by the reaction syste m of HPXXO, it was found that the currents of expressed rat bra in glutamate rec eptors had been changed markedly. When the oocytes were co-treated with 60 nm ol/L Aβ(1-40) and SAFRs over a period of 12 h, the currents of glutamate receptor significantly decreased (21% off, P&lt;0.05), and the decreased perce ntage reached 52% over 24 h co-treatment with 60 nmol/L Aβ(1-40) and SA FRs. In addition, vitamin E had a partial effect against this inhi bitory effect.Conclusion The results suggest that Aβ has a kind of inhibitory effect upon the current of the glutamate receptor, similar to the effects of free radicals. The effects c an be antagonized by vitamin E. These imply that Aβ may play a role via inhibi ting receptor function in the pathophysiology of Alzheimer’s disease.     

Zn~(2+)对鸡脑mRNA表达在卵母细胞膜上的GABA及KA受体的调制作用

目的：探讨Ｚｎ２＋和氨基酸类递质之间是否存在内在关系或相互作用。方法：实验以盐酸胍方法抽提鸡脑ｍＲＮＡ，通过微量注射把信使核糖酸（ｍＲＮＡ）导入卵母细胞，利用卵母细胞的基因表达系统进行表达。应用双电极电压钳方法研究所表达的受体。结果：（１）γ－氨基丁酸（ＧＡＢＡ）及红藻氨酸（ＫＡ）受体在卵母细胞膜上表达明显。施加相应的激动剂均能引起一剂量依赖的内向电流，其幅值分别高达２９４±６．４ｎＡ和３０９．５±４．９ｎＡ，相应的拮抗剂荷包牡丹碱（ｂｉｃｕｃｕｌｉｎｅ）和６－氰基－７－硝基喹恶啉土卫四（ＣＮＯＸ）可阻断其电流，而阴性对照无此现象。（２）剂量效应曲线显示Ｚｎ２＋的浓度为３０ｍｍｏｌ／Ｌ时开始抑制３００ｍｍｏｌ／Ｌ的ＫＡ诱导电流。半抑制浓度（ＩＣ５０）为７１０ｍｍｏｌ／Ｌ。（３）Ｚｎ２＋在ｎｍｏｌ／Ｌ级浓度时即对ＧＡＢＡ诱导电流有抑制作用，ＩＣ５０为２５ｍｍｏｌ／Ｌ。（４）Ｚｎ２＋的这种抑制作用是可逆的，即去除灌流液中的Ｚｎ２＋后，ＫＡ及ＧＡＢＡ诱导电流恢复到原来大小。结论：Ｚｎ２＋可能作为一种神经调制物通过非竞争性抑制来调制ＧＡＢＡ及ＫＡ受体。     

大鼠孤束核GABAA 和GABAB受体对心血管活动调节的区别

目的： 一定程度上区分孤束核(NTS)内GABAA 和GABAB 受体对血压调节的作用。方法：NTS微注射、NTS损毁及电刺激下丘脑防御反应区,记录血压和心率。结果：GABAA受体拮抗剂荷包牡丹碱能逆转GABA摄取抑制剂3-哌啶甲酸引起的血压升高,GABAB受体拮抗剂CGP 35348则不能;谷氨酸使蝇蕈醇所致的血压升高小幅度下降,对GABAB受体激动剂引起的血压升高无明显影响;刺激下丘脑防御反应区引起的血压升高能被NTS部位注射荷包牡丹碱所阻断,GABAB受体拮抗剂CGP 35348不能。结论：NTS部位的GABAA和GABAB受体在对心血管功能的调控方面存在差异,这些差异可能是由于GABAA受体主要存在于突触后膜,GABAB受体主要存在于突触前膜所造成的。     

人卵子发生过程中卵母细胞PTEN基因的表达及其意义

目的: 研究在人卵子发生过程中PTEN基因与卵母细胞的关系.方法: EnVision免疫组化染色方法检测人卵巢组织中卵母细胞PTEN与PCNA的表达;原位杂交法检测人卵巢组织中卵母细胞PTEN mRNA表达.结果: 8/10例人卵巢的卵母细胞表达PTEN蛋白,10/10例卵母细胞表达PCNA,同时人卵巢次级卵泡内层卵泡膜细胞(theca interna)也表达PTEN,但卵巢的颗粒细胞、卵泡细胞和间质细胞大多不表达或弱表达PTEN与PCNA.PTEN mRNA表达结果基本与 PTEN蛋白一致,7/10例人卵巢的卵母细胞表达PTENmRNA,卵巢的卵泡细胞和间质细胞大多不表达或弱表达PTENmRNA.结论: PTEN的表达可能与卵母细胞的生长、成熟和变大有关.     

A single amino acid change within the ion-channel domain of the gamma-aminobutyric acid rho1 receptor accelerates desensitization and increases taurine agonism

BACKGROUND: GABAC receptors are part of the ligand-gated ion channel family of receptors that share some functional and structural features: e.g., they have four putative transmembrane domains (TM1-TM4) and the TM2-segment is presumed to form the ion-channel. GABAC receptors open chloride channels and do not desensitize even after long exposures to GABA. These receptors are highly expressed in vertebrate retina, where they may play a unique role due to their unusual biophysical and pharmacologic characteristics. METHODS: To determine whether the TM2 domain plays a role in the process of desensitization of GABAC receptors, we used site-directed mutagenesis to produce several permutations within the leucine (L9') residue of the TM2 domain of the human GABArho1 subunit. Recombinant receptors were expressed in Xenopus laevis oocytes and their functional and pharmacologic properties were studied by using a two-microelectrode, voltage-clamp. RESULTS: Several amino acid changes led to receptors that did not generate GABA-currents, whereas an Asp for Leu mutation in the well-conserved L9' position of the rho1 subunit (L301D-rho1) generated a fast-desensitizing, bicuculline-resistant receptor that was antagonized by TPMPA, a specific GABAC receptor antagonist. Moreover, in contrast with wild-type rho1 receptors, which are practically not gated by taurine, L301D-rho1 mutant receptors generated substantial taurine-currents. CONCLUSIONS: Substitution of L9' residue in the TM2 region of GABArho1 receptor for an amino acid residue with an acidic lateral chain greatly accelerates its desensitization rate and increases taurine-agonism. This mutant will be useful to study mechanisms involved in gating and desensitization of GABAC receptors in particular, and of neurotransmitter receptors in general.