血液系统条件性DNMT 3B 基因敲除小鼠的构建及鉴定

目的 构建可在血液系统中条件性敲除DNMT 3B 基因小鼠并进行鉴定,为研究DNMT 3B 基因的生物学功能及其在血液肿瘤疾病的作用机制提供动物模型。方法 将引进的DNMT3Bflox/flox 小鼠与Mx1-Cre+ 小鼠进行杂交繁殖,得到基因型DNMT3Bflox/+Mx1-Cre+ 及DNMT3Bflox/+Mx1-Cre- 两种子代,再用这两种子代杂交产生子代小鼠,通过PCR 法鉴定子代小鼠的基因型;获得基因型为DNMT3Bflox/flox Mx1-Cre+ 的小鼠,通过腹腔注射pI-pC 共5 次诱导DNMT3B 敲除,然后用半定量PCR 方法鉴定DNMT 3B 基因敲除情况。结果 基因型鉴定确认在13 只子鼠中有2 只为DNMT3Bflox/flox Mx1-Cre+,经pI-pC 腹腔注射后,DNMT 3B 基因通过Cre/loxP 系统被成功敲除。结论 该方法成功构建可以在血液系统条件性敲除DNMT 3B 基因的小鼠,并进行敲除后鉴定。     

血管内皮细胞特异性敲除cdc42基因的杂合子小鼠与非基因敲除小鼠在急性肺损伤肺组织病理改变以及肺微血管通透性变化的比较

目的比较血管内皮细胞特异性敲除cdc42基因的杂合子小鼠与非基因敲除小鼠在急性肺损伤肺组织病理改变和肺微血管通透性变化的差异。方法 cdc42flox/flox小鼠与血管内皮细胞特异性表达cre重组酶的小鼠杂交,取其基因型为cdc42flox/+Cre+/-的子代小鼠与cdc42flox/flox小鼠回交,得到基因型分别为Cdc42flox/+Cre+/-、Cdc42flox/+Cre-/-、Cdc42flox/floxCre-/-的小鼠,其中Cdc42flox/+Cre+/-为血管内皮细胞特异性敲除cdc42基因的杂合子小鼠,其余两种同一窝出生的非基因敲除小鼠作为对照组,在各组小鼠气道内滴入LPS,制成急性肺损伤模型,比较各组小鼠在肺组织病理改变、病理评分、肺湿干重比值、肺微血管通透系数等指标变化的差异。结果血管内皮细胞特异性敲除cdc42基因的杂合子小鼠急性肺损伤模型在肺组织病理改变、病理评分、肺湿干重比值、肺微血管通透系数等方面与对照组小鼠比较无明显统计学差异。结论血管内皮细胞特异性敲除cdc42基因杂合子小鼠与非基因敲除小鼠比较,在急性肺损伤中肺组织病理改变和肺微血管通透性的变化无明显差异。     

mSpag9肾脏特异性基因敲除小鼠模型的构建与鉴定

目的:为研究支架蛋白JLP在肾脏中的生理功能,建立小鼠精子相关抗原(mSpag9)肾脏特异性基因敲除小鼠模型,为研究该基因所发挥的重要生理功能提供材料和思路。方法:构建mSpag9基因重组载体,通过电转打靶转染胚胎干细胞(ES细胞),将筛选出的阳性ES细胞克隆,经显微注射至超排小鼠的囊胚腔后移植于受体小鼠,从子代筛选嵌合体小鼠,与携带flp位点C57/BL6N小鼠杂交后得到mSpag9flox/+基因敲除小鼠,自交筛选出mSpag9flox/flox小鼠,再与KSP-CreERT2小鼠杂交得到mSpag9flox/flox-Cre肾脏特异性基因敲除小鼠并进行鉴定,待小鼠成长至5周,使用Tamoxifen(10 mg/mL葵花籽油溶解)腹腔注射(0.04 mg/g)诱导Cre重组酶特异性表达于肾小管上皮细胞。结果:经PCR扫描后得到10株阳性ES细胞克隆,其中6株使用Southern Blot鉴定;经显微注射后得到4只雄性、5只雌性嵌合体小鼠,与flp小鼠杂交后得到9只mSpag9flox/+基因敲除小鼠,将自交得到的mSpag9flox/flox小鼠与KSP-CreERT2小鼠交配筛选出mSpag9flox/+-Cre+3只小鼠,将其与mSpag9flox/flox小鼠回交得到基因型为mSpag9flox/flox-Cre+小鼠,即为mSpag9肾脏特异性基因敲除小鼠。结论:该模型利用Cre-Loxp系统实现基因mSpag9的基因打靶,Tamxifen诱导基因mSpag9实现该基因在肾小管上皮细胞上敲除,为进一步研究mSpag9基因及支架蛋白在肾脏生理病理进展中所发挥的作用提供工具。     

Treg中条件性Notch2基因敲除小鼠的构建及鉴定

目的 繁育和鉴定调节性T细胞(regulatory T cells,Treg)中条件性Notch2基因敲除小鼠,为Notch2在Treg中的功能提供研究工具;为Treg与免疫性疾病的发病关系及靶向治疗提供研究手段.方法 将引进的Notch2flox/flox小鼠和Foxp3-Cre+小鼠进行饲养和杂交;将繁育得到的第一代小鼠进行相互交配,再得到第二代小鼠.通过聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)鉴定出具有Notch2flox/flox Foxp3-Cre+基因型的小鼠,再通过该小鼠进行繁育.通过流式细胞术分选出野生型小鼠和Notch2flox/flox Foxp3-Cre+小鼠体内的Treg,Western blot检测小鼠Treg中Foxp3、Notch2、NICD2蛋白的表达,苏木精-伊红(hemotoxylin-eosin,HE)染色观察小鼠肺脏等器官的形态学变化.结果 该方法成功构建了在Treg中敲除Notch2基因的小鼠.Western blot结果显示Notch2flox/flox Foxp3-Cre+小鼠体内的Treg中Notch2、NICD2、Foxp3蛋白表达明显下降(P<0.05),HE染色显示该小鼠肺脏等器官出现明显炎症细胞浸润.结论 本研究成功构建了Treg中条件性敲除Notch2基因的实验小鼠,为Treg与免疫性疾病的发病和靶向干预研究奠定了基础.     

DDR2血管内皮细胞条件性基因敲除小鼠的复制、鉴定及表型分析*

目的 应用Cre/LoxP系统复制盘状结构域受体2（DDR2）在血管内皮细胞可诱导性条件性基因敲除小鼠模型DDR2i?EC（DDR2flox/flox,Cdh5-Cre/ERT2）,并分析其在肝脏中的表型。方法 复制DDR2打靶载体,通过电转入小鼠胚胎干细胞（ES细胞）打靶,通过聚合酶链反应（PCR）+脱氧核糖核酸（DNA）印迹法鉴定筛选阳性ES细胞,将阳性的ES细胞注射到C57BL/6N小鼠囊胚,移植入受体小鼠子宫以获得嵌合体小鼠。将得到的嵌合体小鼠与C57BL/6N小鼠回交得到F0杂合子,F0代杂合小鼠自交筛选获得F1代DDR2flox/flox小鼠,该小鼠与Cdh5-Cre/ERT2小鼠杂交,通过子代自交获得DDR2在血管内皮细胞可诱导性条件性基因敲除（DDR2flox/flox, Cdh5-Cre/ERT2）小鼠。他莫昔芬诱导血管内皮细胞上DDR2基因敲除,对小鼠进行表型分析。结果 获得DDR2血管内皮细胞可诱导性条件性基因敲除小鼠DDR2i?EC（DDR2flox/flox,Cdh5-Cre/ERT2）,DDR2i?EC小鼠出生时符合孟德尔遗传定律,发育良好,他莫昔芬诱导敲除小鼠血管内皮细胞DDR2基因表达后,小鼠出现自发性肝纤维化及黄体血管新生障碍等表型。结论 成功复制DDR2血管内皮细胞可诱导性条件性基因敲除小鼠模型。血管内皮细胞DDR2缺失能导致自发性肝纤维化。     

miR-100基因敲除小鼠模型的构建及基因型鉴定

目的 探讨miR-100基因敲除小鼠模型的构建及基因鉴定.方法 将引进的miR-100flox/flox小鼠与EIIa-Cre小鼠进行交配繁育出F1代小鼠,将F1代小鼠中基因型为miR-100flox/-的雌雄小鼠继续进行交配,获得F2代小鼠,待小鼠1周龄时剪尾部组织提取DNA,PCR法扩增目的基因片段,琼脂糖凝胶电泳进行基因型结果判定.结果 结果显示有所需要的miR-100基因敲除纯合子小鼠,将获得的敲除纯合子小鼠再交配,就可获得更多的基因敲除纯合子小鼠.F1代杂合子小鼠交配获得的F2代小鼠中出现3种基因型:miR-100flox/flox、miR-100flox/-、miR-100-/-,使用 PCR 法成功鉴定出了子代小鼠的基因型.同时剪取miR-100敲除纯合子小鼠、miR-100flox/flox小鼠及miR-100敲除杂合子小鼠的耳朵提取RNA,然后进行qRT-PCR验证miR-100的表达情况.qRT-PCR结果显示,miR-100基因全身敲除纯合子小鼠的耳朵中miR-100的表达几乎为零.结论 该实验成功配繁出miR-100基因全身敲除的小鼠模型,为后续实验提供基础.     

Lck-Cre×Perp^flox/flox条件敲除小鼠的繁育及基因型鉴定

目的 制备Cre-LoxP重组酶系统调控下的T淋巴细胞Perp基因条件性敲除的纯合子小鼠并进行鉴定,为进一步在整体动物水平研究Perp基因在T细胞发育以及在自身免疫疾病发病中的作用提供研究平台.方法 将引进的Perp条件敲除小鼠和T淋巴细胞特异性表达Cre重组酶的Lck-Cre小鼠分别进行繁殖和鉴定,然后将两种小鼠进行杂交并对其子代小鼠的基因型进行鉴定,其子代基因型为Lck-Cre×Perpflox/flox的小鼠即为本实验所构建的T细胞Perp基因特异性敲除的纯合子小鼠.结果 Lck-Cre×Perp^flox/flox的纯合子小鼠被繁殖成功并准确鉴定.Lck-Cre×Perp^flox/flox小鼠脾脏CD3-细胞的Perp基因的RNA及蛋白表达水平与Lck-Cre×Perp^＋/＋小鼠相比显著降低.结论 本研究利用Cre-LoxP技术成功构建了T细胞特异性敲除Perp基因的纯合子小鼠,为进一步研究Perp基因在T淋巴细胞发育以及自身免疫性疾病发病中的作用提供了优良的工具.     

ASIC1基因敲除小鼠的繁殖及基因鉴定

饲养并繁殖酸敏感离子通道1(ASIC1)基因敲除杂合子小鼠,提取小鼠尾部组织DNA,采用聚合酶链反应( PCR)方法鉴定子代小鼠基因型. ASIC1 基因敲除小鼠的繁育和鉴定均获得成功,子代小鼠基因型分别为杂合子( ASIC1+/-)、纯合子( ASIC1-/ -)和野生型( ASIC1+/ +).     

利用基因打靶技术构建血管内皮特异性Stk24/25双基因敲除小鼠

目的:构建Stk24/Stk25双基因敲除小鼠模型,并对其基因型及敲除效率进行测定。方法:使用基因打靶技术构建基因敲除小鼠,利用PCR及凝胶电泳技术对亲代及子代小鼠进行基因型鉴定;并利用ＲT-qPCＲ测定目的基因在小脑血管内皮细胞中mＲNA转录水平的表达情况。结果:通过PCR技术成功检测出小鼠子代基因型Cdh5cre+/Stk24fl/fl/Stk25fl/fl纯合子小鼠,经鉴定血管内皮基因敲除Stk24、Stk25后表达量分别下降了27%（t=2.874,P=0.0207）和30%（t=17.21,P<0.001）。结论:采用基因打靶技术成功构建了Stk24/Stk25双基因敲除小鼠。     

成熟成骨细胞中敲除基因fgfr1小鼠的制备

目的 制备在成熟成骨细胞中敲除基因fgfr1的特定细胞阶段性基因敲除小鼠.方法 从美国NIH引进SPF级fgfr1条件性基因敲除(fgfr1flox/flox)小鼠,进行饲养、繁殖和PCR鉴定;fgfr1flox/flox小鼠与在成熟成骨细胞表达Cre重组酶的OC-Cre小鼠交配,获得在成熟成骨细胞中敲除一个基因拷贝的杂合子小鼠;杂合子小鼠之间交配,或者杂合子小鼠与fgfr1flox/flox小鼠交配,可以获得在成熟成骨细胞中敲除fgfr1基因的小鼠fgfr1△/△/OC-CreTG/ .结果 成功制备在成熟成骨细胞中敲除fgfr1的细胞特异性敲除小鼠.结论 成功引进fgfr1flox/flox小鼠,应用合理的基因条件性敲除繁殖策略,获得在成熟成骨细胞中敲除fgfr1的基因敲除小鼠.