ILK在氧诱导视网膜病变小鼠模型视网膜组织中的表达

背景 研究表明,整合素连接激酶( ILK)在新生血管形成过程中发挥重要作用,目前ILK在其他组织器官新生血管形成过程中的机制已有报道,但少有其与视网膜新生血管形成关系的研究. 目的 探讨ILK在氧诱导视网膜病变(OIR)小鼠模型视网膜新生血管形成和退化过程中的表达及其意义.方法 选用7日龄健康清洁级C57BL/6J小鼠128只,按随机数字表法分为正常对照组和OIR模型组.将小鼠与哺乳母鼠共同置于体积分数(75±2)％氧的玻璃氧箱内饲养5d后转移至正常环境中饲养5d,建立小鼠OIR模型,正常对照组在正常氧环境中饲养21d.取OIR模型组和正常对照组出生后第17天小鼠各5只制备视网膜切片,进行苏木精-伊红染色,检测每张切片中突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核数目.取出生后第12、14、17、21天OIR模型组和正常对照组小鼠各4只分别制备视网膜切片和视网膜铺片,应用ADP酶组织化学法动态观察视网膜新生血管形成和退化过程;采用免疫组织化学法、实时定量聚合酶链反应( real-time PCR)法和Western blot法检测ILK蛋白及其mRNA在小鼠视网膜中的表达情况. 结果 OIR模型组突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核计数为(45.64±12.17)个,正常对照组为(0.35±0.14)个,两组间差异有统计学意义(t=22.85,P＜0.05).视网膜铺片结果显示,OIR模型组小鼠第14天视网膜新生血管开始出现,与同龄正常对照组小鼠视网膜血管比较,出生后17d小鼠新生血管形成和血管走行异常等达到高峰,至21d时新生血管开始退化.免疫组织化学检测显示,ILK主要表达于视网膜神经节细胞层、内核层、内丛状层和光感受器层.Real-time PCR和Western blot结果表明,OIR模型组第12、14、17、21天ILK mRNA在视网膜中的表达水平为(1.00±0.22)、(1.85±0.17)、(1.58±0.43)、(1.53±0.36),呈先升高后下降的趋势;在第12、14、17、21天与正常对照组比较小鼠OIR模型组ILK/3-actin吸光度值均高于正常对照组,差异均有统计学意义(t=2.97,P＜0.05;t=11.88,P＜0.01;t=16.84,P＜0.01;t=13.00,P＜0.01). 结论 ILK的表达水平与视网膜新生血管的形成存在时空对应关系,ILK的高表达可能与视网膜新生血管形成密切相关.     

姜黄素对氧诱导的视网膜新生血管形成的影响

目的 观察姜黄素对高氧诱导视网膜病变(OIR)动物模型新生血管形成的影响.方法 C57BL/6J小鼠72只,分为正常组、OIR模型组、二甲基亚砜(DMSO)组及100、50、10 mg姜黄素治疗组.正常组小鼠饲养于正常空气的氧浓度中,其余各组小鼠参照文献建立OIR模型.治疗组在建立OIR模型后分别腹腔注射100,50、10 mg/kg姜黄素0.1 ml,DMSO组腹腔注射1‰的DMSO 0.1 ml.所有小鼠于17日龄处死,摘除眼球,苏木精-伊红染色观察并计数突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核的数目.取各组小鼠视网膜组织,逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)及蛋白质免疫印迹(Western blot)方法检测血管内皮生长因子(VEGF)-A、VEGF受体-2(VEGFR-2)、内皮抑素(ES)、磷酸化p38丝裂原活化蛋白激酶(p-p38MAPK)在视网膜中的表达.结果 与正常组比较,OIR模型组小鼠视网膜有大量新生血管形成,突破内界膜的内皮细胞核数,OIR模型组为(46.00±16.00)个,正常组为(0.17±0.41)个,差异有统计学意义(P<0.05).RT-PCR及Western blot检测显示100 nag治疗组与其余两个剂量的治疗组相比在对VEGFA、ES、p-p38MAPR表达的影响上具有更为显著的作用(P<0.05),但不同剂量治疗组之间VEGFR-2的表达,差异无统计学意义(P>0.05).结论 姜黄素能够显著抑制氧诱导视网膜新生血管的生成.     

慢病毒介导聚嘧啶束结合蛋白相关剪接因子对氧诱导视网膜病变小鼠视网膜新生血管的抑制作用

目的观察慢病毒介导聚嘧啶束结合蛋白相关剪接因子(PSF)对氧诱导视网膜病变(OIR)小鼠视网膜新生血管的抑制作用。方法5日龄C57BL/6J小鼠112只随机分为正常对照组、单纯OIR模型组、OIR模型+慢病毒空载体处理组(以下简称Vec组)及OIR模型+PSF慢病毒处理组(以下简称PSF组),分别为16、32、32、32只。小鼠7日龄时,正常对照组小鼠常规环境饲养;单纯OIR模型组、Vec组及PSF组小鼠建立OIR模型。小鼠12日龄时,Vec组、PSF组小鼠玻璃体腔分别注射滴度为1×1011 TU/ml的空载体病毒或PSF慢病毒1μl。正常对照组和单纯OIR模型组小鼠不再做任何处理。小鼠17日龄时,采用HE染色计数突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核;作视网膜铺片,测量各组小鼠视网膜无灌注区相对面积;采用实时定量PCR检测各组小鼠视网膜中NF-E2相关因子2(Nrf2)和血红素氧合酶1(HO-1)的mRNA相对表达量;采用Western blot检测各组小鼠视网膜中Nrf2、HO-1及PSF的蛋白相对表达量。组间比较采用单因素方差分析。结果正常对照组、单纯OIR模型组、Vec组、PSF组小鼠突破内界膜的血管内皮细胞核数分别为0.00、14.36±5.50、15.67±4.96、8.13±2.09个;视网膜无灌注区面积分别为0.00%、(35.71±2.81)%、(36.57±4.53)%、(15.33±4.75)%。4组间小鼠突破内界膜的血管内皮细胞核数及视网膜无灌注区面积比较,差异均有统计学意义(F=24.87、165.70,P<0.05)。组间两两比较,单纯OIR模型组、Vec组较正常对照组突破内界膜的血管内皮细胞核数增多,视网膜无灌注区面积增大;PSF组较单纯OIR模型组、Vec组突破内界膜的血管内皮细胞核数减少,视网膜无灌注区面积减小,差异均有统计学意义(P<0.05)。实时定量PCR及Western blot检测结果显示,4组间小鼠视网膜Nrf2、PSF mRNA相对表达量(F=53.66、83.54)以及Nrf2、HO-1、PSF蛋白相对表达量(F=58.38、52.69、24.79)比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。组间两两比较,单纯OIR模型组、Vec组小鼠视网膜Nrf2、PSF mRNA相对表达量及Nrf2、HO-1、PSF蛋白相对表达量较正常对照组明显降低,PSF组小鼠视网膜Nrf2、PSF mRNA相对表达量及Nrf2、HO-1、PSF蛋白相对表达量较单纯OIR模型组、Vec组明显增加,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论慢病毒介导的PSF可通过上调Nrf2及HO-1的表达抑制OIR小鼠视网膜新生血管形成。     

血管能抑素基因转移抑制视网膜新生血管的实验研究

目的 观察血管能抑素真核表达质粒(pCMV-HA)对小鼠视网膜新生血管RNV形成的抑制作用.方法 将鼠龄为7 d的56只C57BL/6J新生小鼠随机分为正常对照组、氧诱导视网膜病变(OIR)模型组、治疗组和空载体组,每组14只.后3组小鼠置于(75±2)%浓度的氧环境中饲养5 d后,回到正常空气环境中建立氧诱导的RNV动物模型.治疗组小鼠在出生后第12天出氧箱时行玻璃体腔注射血管能抑素pCMV-HA,空载体组注射等量空质粒.出生后第17天行伊凡思蓝(Evans blue)灌注血管造影视网膜铺片观察血管变化.石蜡切片行苏木精-伊红染色,光学显微镜下观察并计数突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核数.结果 视网膜铺片结果显示,治疗组较OIR模型组和空载体组视网膜血管分布均匀,新生血管和无灌注区显著减少.治疗组突破内界膜的内皮细胞核数与OIR模型组及空载体组比较,差异有统计学意义(F=39.006,P<0.001).结论 血管能抑素pCMV-HA对氧诱导的RNV有显著的抑制作用.     

抗血管内皮生长因子对氧诱导视网膜新生血管病变模型小鼠视网膜多巴胺含量的影响

目的　研究抗血管内皮生长因子（VEGF）融合蛋白康柏西普（Conbercept）玻璃体内注射对小鼠氧诱导视网膜新生血管病变（OIR）模型中视网膜多巴胺（DA）含量的影响。方法　普通级7 d龄C57BL/6小鼠100只,随机分为空白对照组、OIR组、OIR+生理盐水（NS）组及OIR+ Conbercept组,每组25只。其中空白对照组小鼠在常氧环境中饲养至17 d龄。OIR组、OIR+NS组及OIR+ Conbercept组小鼠通过高流量吸氧建立OIR模型,并在此环境中饲养至12 d龄,OIR+NS组和OIR+Conbercept组小鼠分别行右眼玻璃体内注射1 μL NS、1 μL Conbercept后,在常氧环境中饲养至17 d龄,处死。取各组小鼠右眼眼球行HE染色及视网膜铺片,观察突破内界膜的视网膜血管内皮细胞核数及血管分布;行Western blot检测各组小鼠视网膜中酪氨酸羟化酶（TH）、血管内皮生长因子（VEGF）表达量;行高效液相色谱仪检测各组小鼠视网膜DA含量。结果　空白对照组小鼠视网膜各层清晰,未见明显无灌注区及新生血管。与空白对照组相比,OIR组小鼠视网膜各层排列紊乱,视盘周围可见大片无灌注区,突破内界膜的血管内皮细胞核数、VEGF相对表达量均增加,TH相对表达量、DA含量均减少,差异均有统计学意义（均为P<0.05）;OIR+NS组与OIR组相比,小鼠视网膜中突破内界膜的血管内皮细胞核数、DA含量及VEGF、TH相对表达量差异均无统计学意义（均为P>0.05）;与OIR组及OIR+NS组相比,OIR+ Conbercept组小鼠视网膜各层排列较清晰,视盘周围可见小片状无灌注区,突破内界膜的内皮细胞核数、DA含量及VEGF、TH相对表达量均减少,差异均有统计学意义（均为P<0.05）。结论　OIR模型中视网膜DA含量及TH相对表达量均降低;玻璃体内注射Conbercept后,视网膜新生血管及VEGF相对表达量均减少,TH相对表达量、DA含量均进一步降低。     

α-黑素细胞刺激素抑制氧诱导视网膜病变小鼠视网膜新生血管的生成

背景 视网膜新生血管形成(RNV)可发生于多种眼病,导致视网膜出血甚至脱离,抑制病理性RNV已逐渐成为眼科疾病治疗中的重点.α-黑素细胞刺激素(α-MSH)对视网膜发育过程中的生理性血管生成有抑制作用,但其在病理性RNV方面的作用尚未见报道. 目的 以氧诱导视网膜病变(OIR)小鼠为模型,研究玻璃体腔注射不同质量浓度的α-MSH对病理性RNV的作用. 方法 选取健康清洁级7日龄C57BL/6J幼鼠40只,应用随机数字表法随机分为OIR+0.33μg/μl α-MSH组、OIR+1.67 μ.g/μl α-MSH组、OIR+3.30 μg/μlα-MSH组、OIR组和正常对照组,每组8只.不同剂量α-MSH干预组和OIR组幼鼠在氧体积分数(75±2)％的高氧环境下饲养5d,然后在普通空气环境中饲养5d,正常对照组幼鼠则在普通空气环境中饲养10d.各组取17日龄鼠,球后静脉注射高相对分子质量异硫氰酸葡聚糖(FITC-dextran),制备视网膜铺片,观察视网膜的血管形态,计算无灌注区面积相对于整个视网膜的面积.对小鼠眼球行石蜡切片和苏木精-伊红染色,计数突破内界膜突入玻璃体腔的血管内皮细胞核数. 结果 视网膜铺片结果显示,正常对照组、OIR组、OIR+O.33 μg/μl α-MSH组、OIR+1.67 μg/μl α-MSH组和OIR+3.30 μg/μl α-MSH组视网膜无灌注区相对面积分别为(0.00±0.00)％、(23.01±3.39)％、(18.14±7.20)％、(15.64±7.07)％和(7.62±6.52)％,各组间视网膜无灌注区相对面积总体比较,差异有统计学意义(F=19.635,P＜0.05);其中OIR组无灌注区相对面积显著高于OIR+3.30 μg/μl α-MSH组,差异有统计学意义(t=4.293,P＜0.01).组织病理学检查结果显示,正常对照组、OIR组、OIR+0.33 μg/ μl α-MSH组、OIR+ 1.67 μg/μl α-MSH组和OIR+3.30 μg/μl α-MSH组突入玻璃体腔的血管内皮细胞核数分别为(0.00±0.00)、(11.45±4.26)、(6.35±2.34)、(4.96±1.79)和(1.03±1.25)个.各组突入玻璃体腔的新生血管内皮细胞核数总体比较,差异有统计学意义(F=147.87,P＜0.05);其中OIR组突入玻璃体腔新生血管内皮细胞核数显著高于OIR+0.33μg/μl α-MSH组、OIR+ 1.67 μg/μlα-MSH组和OIR+3.30 μg/μl α-MSH组,差异均有统计学意义(均P＜0.001). 结论 α-MSH可减少OIR小鼠模型视网膜中无灌注区的相对面积和视网膜新生血管核数,其对病理性RNV的抑制作用呈剂量依赖性.     

氧诱导视网膜病变小鼠模型微小RNA表达谱分析

目的 分析氧诱导视网膜病变(OIR)小鼠模型的微小RNA表达谱,筛选可能与视网膜新生血管(RNV)形成有关的微小RNA.方法 7日龄健康C57BL/6J小鼠52只随机分为正常对照组和OIR组,每组26只.OIR组建立OIR小鼠模型;正常对照组不做任何处理.小鼠17日龄时,行视网膜铺片,观察视网膜血管形态;行视网膜石蜡切片,计数突破内界膜的视网膜血管内皮细胞核数;行微小RNA芯片分析,检测具有差异表达的微小RNA,再应用实时聚合酶链反应(RT-PCR)进行验证.结果 正常对照组小鼠视网膜血管平滑、均匀有序分布;OIR组小鼠周边视网膜血管纡曲、紊乱并伴有新生血管芽,中央视网膜无灌注区明显.正常对照组、OIR组小鼠视网膜无灌注区的相对面积分别为(6.57±3.6)％、(25.81±2.12)％;OIR组小鼠视网膜无灌注区的相对面积较正常对照组明显增大,差异有统计学意义(t=28.71,P＜0.001).光学显微镜观察发现,正常对照组小鼠内界膜结构完整、平滑,血管内皮细胞排列整齐,偶见突破内界膜的血管内皮细胞核.正常对照组、OIR组平均每张切片突破内界膜的视网膜血管内皮细胞核数分别为(0.16±0.31)、(28.41±4.01)个.两组平均每张切片突破内界膜的视网膜血管内皮细胞核数比较,差异有统计学意义(t=54.45,P＜0.001).微小RNA芯片分析结果显示,与正常对照组比较,OIR组有21个微小RNA的表达发生了1.5倍以上的变化.其中,上调者9个,下调者12个.差异表达倍数≥3.0的微小RNA为miR-3078、miR-140、miR-29b、miR-29c.RT-PCR检测发现,差异表达倍数≥3.0的4个微小RNA,其表达趋势与芯片分析结果一致.与正常对照组比较,OIR组miR-3078的表达明显上调,差异有统计学意义(t=-2.380,P＜0.05);miR-140、miR-29b、miR-29c的表达明显下调,差异也有统计学意义(t=2.638、2.323、2,415,P＜0.05).结论 OIR小鼠模型的微小RNA表达谱中,miR-3078、miR-140、miR-29b、miR-29c的差异表达倍数≥3.0,其可能与RNV形成有关.     

提前光照对氧诱导视网膜病小鼠模型的视网膜血管发育的影响

目的探讨提前光照对氧诱导视网膜病小鼠模型的视网膜新生血管发育的影响。方法48只健康C57BL／6J小鼠．随机取12只作为正常对照组，其余随机分为高氧模型组、提前光照组和高氧联合提前光照组。每组各12只小鼠。高氧模型组：将出生后第7天（P7）的小鼠置于舍75％高浓度氧的氧箱内，5d后取出，再置于正常空气环境中饲养；提前光照组：取出生后第4天（P4）未开睑新生小鼠。手术提前开启右眼睑裂。让右眼提早接受环境光及视觉刺激，左眼为自身对照：高氧联合提前光照组：取P4小鼠提前开启右眼睑裂．在P7时放入高浓度氧箱内饲养，5d后取出。各组均于小鼠生后第27天（P27）取材，应用HE染色、视网膜铺片ADP酶染色及视网膜新生血管计数等方法观察小鼠视网膜新生血管的生长情况。结果在P27时，正常对照组和单纯提前光照组小鼠视网膜均无显著新生血管生长；高氧模型组内皮细胞计数较正常对照组及单纯提前光照组明显增加，有显著统计学意义（P〈0．01），提示该组存在显著视网膜新生血管生长：在高氧联合提前光照组，双眼新生血管内皮细胞计数均较正常对照组明显增加（P〈0．05），但该组的提前光照眼新生血管内皮细胞计数较单纯高氧作用眼有所减少（P〈0．01）。结论对于小鼠，高氧可诱导视网膜新生血管的生成，提前光照可削弱高氧所致的小鼠视网膜新生血管的增殖。     

小鼠氧诱导视网膜新生血管形成中促红细胞生成素的变化

目的:观察C57BL/6小鼠氧诱导视网膜新生血管病变模型(oxygen-induced retinopathy,OIR)眼内促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)含量的变化。方法:新生C57BL/6小鼠20只,随机分为实验组(n=10)和对照组(n=10)。实验组小鼠于出生后7d(P7)与母鼠共置于密闭的氧箱,含氧75±5mL/L,共培养5d(P5)后回到正常氧环境,含氧20±1mL/L,建立OIR模型。对照组小鼠不进入氧箱,与母鼠一同饲养于正常氧环境。于P17处死各组小鼠,摘取右眼眼球制作组织切片,HE染色后行病理组织学检查,计数突破内界膜视网膜新生血管(retinal neovascularization,RNV)内皮细胞核数。采用放射免疫法测定实验组和对照组小鼠左眼视网膜组织EPO含量。结果:实验组小鼠视网膜突破内界膜RNV内皮细胞核计数为80.0±6.2个,而对照组仅为1.0±0.9个,两者差异有统计学意义(P<0.01)。实验组视网膜EPO含量为80.8±20.7U/L,对照组为14.4±6.8U/L,两者差异有统计学意义(P<0.01),且视网膜组织EPO表达与RNV增生程度呈明显正相关(r=0.58,P<0.01)。结论:小鼠视网膜新生血管形成与眼球局部EPO上调有关。     

Toll样受体4对氧诱导视网膜新生血管发生的促进作用及其机制

背景 研究发现,Toll样受体(TLRs)在视网膜新生血管的形成中发挥重要作用,但其作用机制尚不清楚. 目的 探讨TLR4对小鼠氧诱导视网膜病变(OIR)中新生血管生成的作用及其机制. 方法 将18只7日龄新生C57BL/6J小鼠以随机数字表法按小鼠窝别分为常氧组、OIR组及OIR+脂多糖(LPS)-EB组,常氧组小鼠在正常氧环境中饲养,OIR组及OIR+LPS-EB组小鼠于生后第7天(P7)与母鼠置于体积分数(75±2)％高氧氧箱中饲养5d以诱导OIR模型,于P12在正常氧环境中饲养,OIR+LPS-EB组P12小鼠腹腔内注射LPS-EB,剂量为1 mg/kg,OIR组同法注射PBS.各组摘取P17小鼠眼球于质量分数4％多聚甲醛中固定并行视网膜铺片和Lectin染色,计算视网膜无血管区和新生血管区面积占全视网膜的百分比.各组制备P17小鼠眼后节组织冰冻切片并行免疫荧光检测,计数小鼠5 mm视网膜全长活化小胶质细胞数目;采用CD11b和TLR4免疫荧光双标记法检测各组小鼠视网膜小胶质细胞中CD11b、TLR4的表达及其分泌血管内皮生长因子(VEGF)、白细胞介素1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的水平.结果 常氧组P17小鼠视网膜血管分布和形态正常,OIR组和OIR+LPS-EB组P17小鼠视网膜中央均出现无血管区和新生血管簇,OIR+LPS-EB组小鼠视网膜无血管区面积比为(18.47±1.32)％,新生血管面积比为(3.29±0.85)％,分别大于OIR组的(15.78±1.44)％和(1.77±0.19)％,差异均有统计学意义(t=3.36,P=0.01;t=4.22,P=0.00).免疫荧光结果显示,常氧组P17小鼠视网膜中活化小胶质细胞数量极少,OIR组和OIR+LPS-EB组P17小鼠视网膜中活化小胶质细胞荧光强度增强,活化小胶质细胞数量增加,其中OIR+LPS-EB组小鼠视网膜中小胶质细胞数明显多于OIR组,差异有统计学意义[(95.50士4.77)/5 mm与(74.83±4.17)/5 mm,t=8.00,P＜0.01].常氧组小鼠视网膜中TLR4阳性小胶质细胞数量极少,OIR组和OIR+LPS-EB组小鼠视网膜中TLR4荧光增强,TLR4阳性小胶质细胞数量明显增加,OIR+LPS-EB组小鼠视网膜中TLR4阳性小胶质细胞数目明显多于OIR组,差异有统计学意义[(49.50±6.38)/5 mm与(28.17±6.24)/5 mm,t=5.86,P＜0.01)].常氧组P17小鼠视网膜中CD11b和VEGF/IL-1β/TNF-α共表达的小胶质细胞数量分别为(1.17±0.75)/5 mm、0和0,而OIR+LPS-EB组小鼠视网膜中共表达CD11b和VEGF/IL-1β/TNF-α的小胶质细胞数量多于OIR组,差异有统计学意义[(44.50±8.78)/5mm与(28.50±5.61)/5 mm,F=44.07,P＜0.01;(24.10±6.49)/5 mm与(16.00±3.46)/5 mm,F=11.31,P＜0.01;(33.83±14.82)/5 mm与(23.00±2.83)/5 mm,t=19.92,P＜0.01]. 结论 TLR4可促进OIR小鼠视网膜新生血管的生成,其作用机制可能与TLR4激活视网膜小胶质细胞中相关的下游信号通路,促进血管生长因子及炎性因子的释放有关.     

靶向血管内皮生长因子的RNA干扰抑制氧诱导视网膜病变小鼠视网膜新生血管生成的研究

目的探讨玻璃体腔注射靶向血管内皮生长因子（VEGF）的RNA干扰慢病毒抑制氧诱导视网膜病变（OIR）小鼠视网膜新生血管生成的作用及其机制。方法实验研究。构建4对针对靶基冈小鼠VEGF的siRNA干扰载体,筛选并进行慢病毒包装。60只C57Bif6J小鼠分成4组（每组15只）：正常对照组．OIR模型组,OIR＋空载体组,OIR＋VEGF-RNA干扰组。OIR＋空载体组和OIR＋VEGF-RNA干扰慢病毒组的小鼠在生后第5天玻璃体腔注射相应的1μ1的7.5×10^7空载体慢病毒和VEGF-RNA干扰慢病毒。后3组小鼠在生后第7天建立OIR模型。第17天时FITC-Dextran灌注视网膜铺片观察4组小鼠视网膜血管形态及面积变化,视网膜铺片免疫荧光染色检测紧密连接蛋白Claudin-5和Occludin的分布变化．Westernblot检测VEGF、磷酸肌醇3激酶（P13K）、酪氨酸蛋白激酶SRC、磷酸化细胞外信号调节激酶（P-ERK）蛋白表达量的变化。数据采用单因素方差分析进行比较。结果FITC-Dextran灌注视网膜铺片显示正常组视网膜血管分布呈均匀网状;RNA干扰组新生血管面积（0．271399mm^2）明显较OIR模型组（1.212782mm^2）、空载体组（1．152504mm^2）少（F=449．924,P〈0．01）。OIR模型组和空载体组间差异无统计学意义,其余两两间差异均有统计学意义（P〈0．01）。视网膜铺片免疫荧光染色显示紧密连接蛋白Claudin-5和Occludin在RNA干扰组中与正常组相似,呈均匀光滑线性分布,而在OIR模型组、空载体组的分布中断、不均匀,在新生血管团中可见团块状的强荧光;VEGF的RNA干扰组中VEGF、P13K、酪氨酸蛋白激酶SRC和p-ERK的蛋白表达量较OIR模型和空载体组低。结论玻璃体腔注射靶向VEGF的RNA干扰慢病毒能有效抑制OIR小鼠模型中VEGF及其下游通路蛋白的表达．从而抑制视网膜新生血管的形成．为临床上早产儿视网膜病变的防治提供了新思路和新途径。     

Arresten在氧诱导小鼠视网膜新生血管形成中的抑制作用及机制

目的　探讨Arresten在氧诱导小鼠视网膜新生血管形成中的抑制作用及机制。方法　选取48只出生后7 d健康清洁级C57BL/6J幼鼠,随机分为氧诱导视网膜病变（oxygen induced retinopathy,OIR）组、OIR+ Arresten组和常氧组,每组16只。OIR+Arresten组及OIR组幼鼠在体积分数为（75±2）％的高氧环境下饲养5 d,然后转移至正常氧气环境中饲养5 d,其中OIR+Arresten组幼鼠于高氧饲养刚结束时,给予双眼玻璃体内注射Arresten蛋白。常氧组幼鼠则在常规氧气环境中连续饲养10 d。在鼠龄17 d时,各组取6只幼鼠经股静脉注射异硫氰酸葡聚糖溶液处死并摘出眼球,视网膜铺片后观察视网膜的血管形态、计算无灌注区面积。同时对小鼠眼球视网膜行石蜡切片和HE染色,计算侵入玻璃体内血管内皮细胞核的数量。同时,通过细胞培养实验,利用MTT法检测Arresten蛋白对人血管内皮细胞增殖的抑制作用。结果　视网膜铺片结果显示,常氧组、OIR组、OIR+Arresten组视网膜无灌注区相对面积分别为（2.35±1.62）％、（57.28±9.36）％和（20.38±8.69）％,三组间总体比较,差异有统计学意义（F=18.732,P<0.05）,且OIR组无灌注区相对面积显著高于OIR+Arresten组,差异有统计学意义（P<0.05）。常氧组小鼠视网膜的内界膜结构仍保持平滑完整,未发现有新生血管侵入玻璃体内。OIR组和OIR+Arresten组每张切片上血管内皮细胞核的数量分别为 （15.18±4.83）个、（7.33±3.88）个,其中OIR+Arresten组侵入玻璃体内新生血管内皮细胞核的数量显著低于OIR组,差异有统计学意义（P<0.05）。Arresten蛋白对人脐静脉内皮细胞增殖的抑制率随着其浓度的升高而增加,但当Arresten蛋白浓度达到1000 μg·L^-1时,人脐静脉内皮细胞的增殖抑制率达到顶峰,为（58.00±0.65）％。结论　Arresten蛋白能够抑制氧诱导的小鼠视网膜新生血管形成,通过抑制血管内皮细胞增殖来抑制新生血管形成。     

巨噬细胞在小鼠氧诱导视网膜新生血管形成中的作用

目的　探讨巨噬细胞对小鼠氧诱导视网膜病变（ｏｘｙｇｅｎ-ｉｎｄｕｃｅｄｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ,ＯＩＲ）形成的影响。方法　将新生Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ小鼠随机分为３组,分别为常氧对照组、ＯＩＲ模型组以及清除巨噬细胞的ＯＩＲ组。将后两组小鼠于生后第７天（Ｐ７）至Ｐ１２置于体积分数（７５±２）％高氧氧箱中以诱导ＯＩＲ。清除巨噬细胞的ＯＩＲ组小鼠于Ｐ９、Ｐ１１、Ｐ１３和Ｐ１５接受腹腔注射氯膦酸二钠脂质体４次以清除全身单核-巨噬细胞,ＯＩＲ模型组小鼠则于上述４个时间点接受腹腔注射ＰＢＳ脂质体。三组小鼠均于Ｐ１７时取右眼行视网膜铺片和Ｌｅｃｔｉｎ染色,观察视网膜出血及血管生长情况;取左眼行视网膜切片和ＨＥ染色,观察视网膜组织病理学变化。结果　与常氧对照组相比,ＯＩＲ模型组小鼠视网膜存在出血现象,清除巨噬细胞的ＯＩＲ组出血有所减轻。ＯＩＲ模型组小鼠视网膜血管形态呈异常增殖的团簇状,走行迂曲,而清除巨噬细胞的ＯＩＲ组小鼠视网膜新生血管异常形态减轻。与ＯＩＲ模型组相比,清除巨噬细胞的ＯＩＲ小鼠视网膜无血管区及新生血管区面积均显著减小［（１７．１９±０．５８）％、（１０．３８±０．５３）％,ｔａ＝８．６８０,Ｐ＜０．０１;（４．６０±０．１５）％、（２．５１±０．１３）％,ｔｎ＝１０．８３,Ｐ＜０．０１］,突破内界膜新生血管内皮细胞核数目明显减少（１８．５０±０．８５、７．１７±０．４８;ｔ＝１１．６６,Ｐ＜０．０１）。结论　清除巨噬细胞可减轻小鼠ＯＩＲ严重程度,提示巨噬细胞对视网膜新生血管形成具有促进作用。     

CREB1在氧诱导视网膜病变小鼠模型中的表达变化

目的研究CREB1在氧诱导视网膜病变（OIR）小鼠模型视网膜新生血管形成中的表达变化,探寻视网膜新生血管形成的可能机制。方法实验研究。选用7日龄健康清洁级C57BL/6J小鼠134只,随机分为正常对照组（67只）和OIR模型组（67只）。将小鼠与哺乳母鼠共同置于（75±2）％氧环境内饲养5 d后转移至正常环境中饲养5 d,建立小鼠OIR模型,17日龄的OIR鼠在空气中再继续饲养4 d,正常对照组在正常氧环境中饲养21 d。出生后第17 d时取OIR模型组和正常对照组小鼠制备视网膜切片HE染色法和FITC-dextran心脏灌注视网膜铺片法观察视网膜新生血管情况,以及视网膜组织冰冻切片免疫荧光染色观察P-CREB1表达情况。取2组鼠第7、9、12、14、17、21 d的视网膜采用实时定量聚合酶链反应（real-time PCR）法和Western Blot法检测CREB1mRNA和蛋白在小鼠视网膜中的表达情况。数据分析采用独立样本t检验和两因素方差分析方法,两两比较采用Bonferronipost-test检验。结果17 d时OIR模型组较正常对照组突破视网膜内界膜的内皮细胞核数明显增加（t=11.31,P<0.05）,且模型组视网膜新生血管区及无灌注区面积分别为（21.40±2.72）%和（30.61±3.12）%。与正常对照组相比,模型组小鼠视网膜中可见大量P-CREB1蛋白荧光,主要表达在内核层和神经节细胞层。Real-time PCR和Western Blot结果表明,正常对照组第7、9、12、14、17天的CREB1mRNA和蛋白在视网膜中的表达水平逐渐升高,21 d时开始出现下降的趋势;在各相应时间点OIR模型组里的CREB1相对表达量除第7天外,其余时间点均高于正常对照组,差异均有统计学意义（P<0.05）。结论CREB1的表达水平与视网膜新生血管的形成存在时空对应关系,CREB1的高表达可能参与了OIR模型中视网膜新生血管的形成过程。     

HIF-1α特异性双链RNA抑制鼠视网膜新生血管的剂量-效应关系

背景 脂质体介导缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)特异性双链RNA(dsRNA)能够有效抑制鼠视网膜新生血管,抑制效率与其剂量比相关. 目的 探讨HIF-1αdsRNA抑制鼠视网膜新生血管的剂量-效应关系.方法 采用Smith的方法,将出生后7d的C57BL/6J小鼠置于氧舱内,控制氧体积分数为(75±3)％,5d后正常氧环境喂养7d后处死;采用异硫氰酸荧光素-葡聚糖(FITC-Dextran)荧光造影视网膜铺片观察视网膜新生血管的形态,鉴定视网膜新生血管模型.将出生后7d的8只小鼠于空气中喂养,为正常组.另51只8日龄小鼠放入(75±3)％的高氧环境中,5d后出舱并随机分为对照组(3只)、空载体组(3只)和基因治疗组,基因治疗组按照剂量比例(脂质体:质粒)亚分为9个组,每组5只.出舱当天空载体组小鼠玻璃体腔内注射空载体pSilencer2.1-U6 hygro,基因治疗组按照不同剂量比例注射HIF-1α dsRNA表达质粒pSilencer2.1-U6hygro,均采用脂质体介导.对照组小鼠不作任何处理.注射后7d采用FITC-Dextran荧光造影视网膜铺片观察视网膜新生血管的形态变化,采用病理切片统计突破内界膜的血管内皮细胞细胞核数,采用免疫组织化学法检测视网膜中血管内皮生长因子(VEGF)的表达差异. 结果 视网膜铺片荧光造影发现,正常组视网膜血管分布呈规则均匀的网状结构.对照组和空载体组视网膜血管不规则扩张,中周边部有大量血管新生.基因治疗组中央区视网膜血管迂曲及不规则扩张较对照组和空载体组明显减轻,其中脂质体∶质粒为1∶1组更为明显.病理切片显示,正常组很少见到突破视网膜内界膜的内皮细胞细胞核,而对照组和空载体组中均大量出现,其发生率为100％.各基因治疗组均较对照组的(11.57±5.85)个和空载体组的(11.53±6.15)个明显减少,其中脂质体∶质粒为1∶1组突破视网膜内界膜的内皮细胞细胞核数最少,为(2.17±4.23)个,各治疗组间的差异均有统计学意义(P＜0.05).免疫组织化学染色显示,正常组视网膜中VEGF呈弱阳性表达;对照组和空载体组视网膜中VEGF呈阳性表达.各基因治疗组与对照组和空载体组相比较,VEGF的表达明显减少.结论 采用脂质体介导,玻璃体腔显微注射HIF-1α特异性dsRNA表达质粒pSilencer2.1-U6 hygro能有效抑制小鼠缺血性视网膜病变模型新生血管的形成,其中脂质体∶质粒为1∶1时抑制效率最高.     

精氨酸-谷氨酰胺在幼鼠早产儿视网膜病变模型中的应用(英文)

目的:观察精氨酸-谷氨酰胺(Arg-Gln)对早产儿视网膜病变动物模型视网膜新生血管的抑制作用。方法:48只7日龄的C57BL/6J新生鼠暴露在750mL/L高氧环境中5d,然后回到正常空气中建立早产儿视网膜病变的动物模型。在鼠龄12d时实验组(36只)新生鼠每天两次腹腔注射Arg-Gln(剂量分别为1.0,3.0,5.0g/kg,每组12只),连续注射5d;对照组(12只)每天两次腹腔注射PBS,连续5d。所有小鼠均于17d处死,视网膜铺片,ADP酶染色观察视网膜血管情况。HE染色,在光学显微镜下观察并计数突破视网膜内界膜的血管内皮细胞细胞核数目。Real-time RT-PCR方法测量每组视网膜VEGF mRNA水平。结果:与对照组相比,实验组以剂量依赖方式无灌注区面积和新生血管团逐渐减少;实验组中最大剂量组[5.0g/(kg·d)]突破内界膜的内皮细胞细胞核数目比对照组大约减少75%(P<0.01);实验组视网膜VEGF mRNA水平与对照组相比明显下降。结论:Arg-Gln能够有效抑制早产儿视网膜病变动物模型视网膜新生血管的生成,可能为临床提供一种预防和治疗早产儿视网膜病变安全有效的新方法。     

磷脂酰肌醇-3-激酶/丝氨酸-苏氨酸激酶抑制剂LY294002对小鼠视网膜新生血管形成的抑制作用

目的　探讨磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K）/丝氨酸-苏氨酸激酶（Serine/threonine kinase,AKT）信号转导通路抑制剂LY294002对小鼠氧诱导视网膜病变（oxygen-induced retinopathy,OIR）的视网膜新生血管（retinal neovascularization,RNV）形成的影响。方法　取C57BL/6J小鼠60只,随机分为实验组和对照组,每组各30只,均制备OIR模型。小鼠出氧箱前1 d即鼠龄11 d时实验组玻璃体内注射0.5 μL的LY294002,对照组玻璃体内注射等体积的PBS。病理切片计数突破视网膜内界膜的新生血管内皮细胞核数,免疫组织化学和RT-PCR法检测pAKT、VEGF蛋白及mRNA的表达情况。结果　实验组小鼠新生血管内皮细胞核数为（12.53±1.71）个,较对照组（25.31±1.42）个明显减少（P<0.05）;实验组小鼠pAKT、VEGF的蛋白表达呈弱阳性,阳性细胞的吸光度值（9.12±1.35、13.91±1.49）均较对照组（15.11±2.17、19.72±2.61）明显下降（均为P<0.05）;实验组小鼠AKT、VEGF mRNA相对表达量均较对照组明显下降（均为P<0.05）。结论　LY294002通过抑制PI3K/AKT信号转导通路,可有效抑制小鼠OIR的RNV形成,LY294002有望成为防治血管增生性视网膜病变的一种有效方法。